この作品は、NIOSH と NIEHS (AES12007001-1-0-6) 間の省庁間の契約によって部分で支えられました。

1. 準備、NIOSH サンプラー
注: NIOSH サンプラーはバイオエアロゾルの 2 つのサンプリング チューブ、ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) フィルターを使用して収集する 2 段サイクロン エアロゾル サンプラーです。
<ol><li>アセンブリの前に慎重にサンプラーを検査します。それを確保するためのサンプラーは破損していない、すべてのネジは、場所と、ぴったりと 2 つによって形成される縫い目の周りシーリング テープ チェックの半分はそのまま。サンプラーの o リングに傷、亀裂や涙やシリコン グリスの非常に軽いコーティングしているされていないことを確認を確認します。 注: サンプラーは、ポリスチレンやポリプロピレン スリーピース フィルター カセットで 37 mm 3 μ m PTFE フィルターを含みます。<ol>
<li>ベースの部分の格子の表面に、セルロースまたはプラスチック フィルター サポート パッド (フィルターに付属) を配置することによってフィルター カセットを組み立てる (図 1参照)。上向きコレクションの側でフィルター サポート パッドの上にフィルターを配置するのにフィルター鉗子を使用します。</li>
		<li>手動または空気圧プレスを使用してフィルター カセットをシールします。手閉鎖空気フィルター周りリークし、コレクションの効率が低下できるようになります。リング状部分 (拡張子カウル) を挿入し、しっかりと均等にそれをプッシュ ダウンするプレスを使用します。フィルターの周りに空気が漏れていないことを確認して、しっかりをフィルターに拡張カウル押し下げます。 メモ: カセットの上部の部分は中にサンプリングされていないがサンプリングが完了したら、フィルターをカバーする保存する必要があります。</li>
		<li>サンプラーの上に組み立てられたカセットに合わせて、可能な限りそれを押し込みます。フィルター カセットと場所でフィルター カセットを保持してリークを防ぐためにバックアップ シールとして機能するサンプラーの外側に 19 mm (3/4 インチ) テープの一部をラップします。</li>
		<li>リークに対して二次シールとして機能するサンプラー ボトムアウトするまでとシーリング テープ各チューブの周りラップにしっかりと完全に各チューブをネジします。 注: 最初のチューブ 15 mL ポリプロピレン チューブを収集非吸入粒子の空気力学的直径と > 4 μ m。2 番目のチューブ 1.5 mL ポリプロピレン製遠心管は、1、4 μ m 間吸入粒子を収集します。残りの小さい粒子、< 1 μ m、PTFE に収集されます (図 2参照) にフィルターを適用。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フィルターの違いとして各使用前に校正瓶 NIOSH サンプラーを介して空気の流れを調整し、サンプラーの気流を変化させる原因となります。<ol>
<li>校正の jar を使用するには、フィルター カセットの上部に jar のルアーロック継ぎ手を挿入、瓶でサンプラーを配置、瓶を密封します。</li>
		<li>校正 jar を校正流量計・ サンプリング ポンプに接続します。流量計をオンにして、数分のためのウォーム アップすること。流量計にはフィルターの流量計、サンプラーが汚れないようにその入口に接続する必要がありますに注意してください。</li>
		<li>サンプリング ポンプをオンにしてウォーム アップし、安定させるために数分の実行を許可します。</li>
		<li>3.5 L/分で正しい流量を設定するポンプを調整します。 注: NIOSH サンプラーの流量は通常 3.5 L/分に設定します。この流量でサンプラーは吸入粒子サンプリング16ACGIH/ISO 基準に準拠します。他の流量は、異なるカットオフ サイズが必要なまたは騒音レベルを減らすためにも注意しては異なる流量を使用すると場合、は、サンプラー、吸入サンプリング条件に適合は不要になった場合に使用できます。</li>
		<li>校正が完了したとき、電源を切り、ポンプに流量計。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 静的および個人的なエアロゾル サンプリング
<ol><li>いずれかの個人または静的エリア サンプリングの NIOSH エアロゾルのサンプラーを設定します。 注: 静的サンプリングは、三脚または他の固定装置に接続して、サンプラーを使用して、 (図 3参照)、サンプリング時個人対サンプラーとポンプは (図 4参照) を検討されている人にマウント。<ol>
<li>静的な領域のサンプリングで保つ特定の領域にできるだけ近いサンプラーを検討中します。吸気口、部屋の入り口や気流のパスがあるかもしれない場所からサンプラーを維持します。 注: エアロゾル濃度かなり異なります、短い距離でも元のエアロゾルが部屋17に場合は特に。</li>
		<li>個人的なサンプリングは、人の呼吸ゾーン内のサンプラーを設定します。襟、肩や胸にサンプラーを接続し、バックパック、腰にサンプリング ポンプを配置します。 注: 呼吸ゾーンですと周りの人の鼻吸入17時に空気の大部分を描画する 30 cm の半球をする一般的。</li>
	</ol>
</li>
	<li>管サンプラー サンプラー入り江も明確であり、何もが入り江を妨害したり、サンプラーに空気の流れを妨げることがであることを確認します。管サンプラのピンチまたはねじれていないする必要があります。任意の閉塞は、ポンプを停止する原因となります。</li>
	<li>ポンプをオンにします。2 分後、ポンプが実行されているかどうかはチェックしてください。 注: 行為の空気から 10 分ほどで環境10,18,19によっての完全 8 h 勤務に至るまでの期間のためのサンプリングします。図 6に示された結果は、屋内環境で 60 分サンプリング周期の代表です。</li>
	<li>空気サンプリングが完了した後は、サンプル チューブとフィルターを収集します。シーリング テープを削除、チューブを外し、それらをキャップします。フィルター カセットの 3 番目の部分は、フィルター上に置きます。処理の準備ができるまで 4 ° c のサンプルを格納します。</li>
</ol>3. 大気試料からゲノム DNA の抽出
<ol><li>NIOSH BC251 サンプラーの各段階からゲノム DNA (gDNA) を抽出します。コレクション チューブをサンプリング空気を処理し、個別にサンプルで吸入と吸入以外の微生物エアロゾルの測定を許可するフィルターします。 注: 代わりに、3 つのステージと結合できるサンプル接種が小さすぎる場合を抽出します。<ol>
<li>クラス II 生物学的安全キャビネットまたは層流クリーン ベンチ、無菌フィルターを削除します。70% のエタノールおよびテコで動かす道具サンプリング カセット カセット開口部ツールを使用してを開くを使用してサンプリング カセットを拭いてください。フィルター リフターを使用して、フィルターとサポート パッドを上向きにプッシュします。フィルター鉗子を使用してフィルターをつかみ、滅菌シャーレに配置。フィルターを 6 等分にカットし、300 mg ガラスビーズ (0.2 - 0.5 mm) を有する補強 2 mL チューブに配置します。</li>
		<li>30 液体窒素でフィルターを含むチューブ s、すぐに 30 の 4.5 m/s に設定ビーズ工場ホモジナイザの場所 s。</li>
		<li>フィルターは千切りまで手順 3.1.2 を何回か繰り返します。そのままフィルターの小さな断片が残ることがあります。0.5 mL の溶解バッファー (4 M 尿素、200 mM トリス、20 mM の NaCl、200 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、pH 7.4) を追加します。</li>
		<li>15 mL と 1.5 mL の空気サンプラー管に 0.3 mL の溶解バッファーを追加します。渦管 10 - 15 秒で直立と倒立し、別の 10-15 s。300 mg ガラス ビーズを含む強化 2 mL チューブに各チューブの内容を転送します。 注: 各サンプラー管で収集した材料のほとんどは、管の上部に蓄積されます。</li>
		<li>4.5 m/s 30 s と遠心分離機でビーズ工場ホモジナイザのすべてのチューブを処理 22 ° C で 1 分 20,000 × g で滅菌 1.5 mL 遠心チューブに上清を転送および 22 ° C で 1 分再び 20,000 x g でチューブを遠心分離この手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>溶解試薬の 30 μ L を追加 (材料表を参照) をそれぞれチューブし、37 ° C 15 分でチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>0.2 mL の結合バッファー (10 M 尿素, 6 M グアニジン塩酸、10 mM トリス-HCl、20% トリトン X-100, pH 4.4) を追加、プロテイナーゼ K (100 μ g/mL) 各チューブ、10 分追加 100 μ L 各管にイソプロパノールの 70 ° C でチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>ガラス繊維フィルター チューブ (700 μ L 容量) 2 mL 採血管の配置に抽出ソリューションを転送し、20,000 x g 30 で採血管を遠心分離機 22 ° C で sコレクション チューブを破棄し、新しい 2 mL 採血管にフィルター チューブを配置します。</li>
	<li>各管に 0.5 mL の阻害剤の除去バッファー (5 M グアニジン HCl、20 mM トリス-HCl、pH 6.6, 38% のエタノール) を追加し、コレクション チューブ 30 20,000 × g で遠心分離機 22 ° C で sコレクション チューブを破棄し、新しい 2 mL 採血管にフィルター チューブを配置します。</li>
	<li>各管に 0.5 mL の洗浄バッファー (20 mM NaCl、2 mM トリス-HCl、pH 7.5、80% エタノール) を追加し、コレクション チューブ 30 20,000 × g で遠心分離機 22 ° C で sコレクション チューブを破棄し、新しい 2 mL 採血管にフィルター チューブを配置します。このプロセスを繰り返します。</li>
	<li>任意の残留洗浄バッファーを削除する 22 ° C でさらに 1 分間 20,000 × g で採血管を遠心分離します。コレクション チューブを破棄し、新しい管にフィルター チューブを配置します。</li>
	<li>追加 100 μ L (70 ° C) 溶出バッファー (トリス-HCl、pH 8.5 10 mM) 各チューブを暖かいし、室温で 1-2 分間遠心分離機 30 20,000 × g で採血管を孵化させなさい 22 ° C で s空のフィルター チューブを滅菌 1.5 mL 遠心チューブに転送し、再ステップ 3.8 から波を適用します。1-2 分間遠心分離機 30 20,000 × g、室温でインキュベート 22 ° C で s 注: 波を使用することができますステップ 4 またはを使用する準備ができるまでの-20 ° C で保存されているためにすぐに。ゲノム DNA を保存ことができます年に-20 ° C まで長期的なストレージが必要な場合は、-80 ° C で DNA を格納することをお勧めします。</li>
</ol>4. 菌のリボソーム DNA の増幅
<ol><li>その地域 1 および 2 抽出された gDNA からを増幅するのに普遍的な真菌のプライマーを使用します。 注: このプロトコルのプライマー対 Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3')/ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') ITS 領域4、5の最高のカバレッジを提供するために使用されます。Its 1 領または ITS2 領域だけを増幅するものなどの他のプライマー セットを使用できます。<ol>
<li>ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 滅菌 0.5 mL PCR チューブや 96 ウェル PCR プレート帳票 50 μ L 反応の各サンプルを次のように設定: 5 μ L (ステップ 3) から抽出されたテンプレート DNA の PCR グレード水の 33.3 μ L、5 μ L の 10 x PCR バッファー、50 mm MgCl21.5 μ L、10 mM - デオキシヌクレオシド 2' 5'-三リン酸塩の 1 μ L、20 μ M Fun18Sf 前方プライマーの 0.5 μ L、20 μ M ITS4R 逆プライマー、0.5 μ、 Taq DNA ポリメラーゼの 0.2 μ L。</li>
		<li>サーマルサイクラーに反応を実行: 3 分; 95 ° C で変性変性の 6 サイクル (96 ° C、30 s) アニール (50 ° C、45 s) とプライマー拡張 (72 ° C、3 分);変性の 20 サイクル (96 ° C、30 s)、焼鈍 (50 ° C、45 s)、およびプライマー拡張 (72 ° C、1 分);72 ° C で 10 分間でプライマー拡張は、次のステップまで 4 ° C で反応混合物を保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>帳票の PCR の反作用は浄化シリカ膜精製キットを使用して結合します。 注: この手順により、PCR コンポーネント (プライマー、dNTPs、酵素、塩、等) および増幅された DNA の準備から他の汚染物質を除去するため。<ol>
<li>滅菌 1.5 mL 容マイクロ チューブ内の各サンプル (合計 150 μ L) の 3 つの反作用を結合します。5 倍ボリューム (750 μ L) で結合バッファー (5 M グアニジン HCl、30% イソプロパノール) を追加し、上下に 10 回ピペッティングして混合します。</li>
		<li>列コレクション チューブの配置をスピンし、濾液 30 s. 破棄の 17,900 x g でチューブを遠心分離機の混合物の 450 μ L を追加します。列に残り 450 μ L を追加し、30 の 17,900 × g で遠心分離機 22 ° C で s 注: スピンの列には、列に DNA の吸着は、シリカ膜が含まれます。</li>
		<li>濾液を破棄し、750 μ L 洗浄バッファー (10 mM トリス-HCl、pH 7.5、80% エタノール) をスピンの列に追加します。遠心分離機の 30 の 17,900 x g で列 22 ° C で s 注: このプロセスは、上記 PCR の反作用からの汚染物質を削除します。</li>
		<li>濾液を破棄し、遠心分離機の 22 ° C で 1 分 17,900 x g で空の列 注: この手順は、ダウン ストリーム アプリケーションを妨げるバッファーを洗浄、残留を取り除くことです。</li>
		<li>滅菌 1.5 mL 遠心チューブにスピン列を転送します。溶出バッファー (10 mM Tris Cl、pH 8.5) の 45 μ L を追加し、室温で 5 分間遠心分離機管 22 ° C で 1 分 17,900 x g でスピン列を孵化させなさい</li>
		<li>手順 4 および 5 のためすぐに溶離された DNA を使用してまたは使用の準備が整うまで-20 ° C で保存します。 注意: amplicons の格納することができます年に-20 ° C まで長期的なストレージが必要な場合は、-80 ° C で DNA を格納することをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 真菌その増幅器は agarose のゲルの電気泳動の検証
<ol><li>キャスト 1% の agarose のゲル含む 1 μ G/ml エチジウム ブロマイド。トリス-酢酸-EDTA (TAE) バッファー x 1 を沸騰のアガロースを溶解します。ソリューションは、約 50 ° C に冷却は、エチジウム ブロマイドを追加し、キャスト ゲルに注ぐ。</li>
	<li>Agarose のゲルは固化後 1 のゲルを浸す x TAE とゲルにロードする産物を準備します。増幅された DNA の 8 μ L は、バッファーを読み込んで x 5 の 2 μ L を追加します。 注: これらのボリュームは、必要な読み込みバッファーの濃度に応じて調整できます。</li>
	<li>サイズの参考のため DNA の梯子とジェルの上にすべての 10 μ L のサンプルをロードします。75 V でゲルを実行 (6 V/cm) 約 90 分通常 750 間見られるバンドを視覚化して紫外線を使用して、1,000 塩基対光 (図 5参照)。</li>
</ol>6. シーケンスと真菌の ITS 領域の解析
<ol><li>抽出された gDNA または増幅真菌 ITS 領域をシーケンス処理し、最新かつ適切なメソッドを使用してシーケンスを分析します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+and+allergic+health+effects+of+dampness,+mold,+and+dampness-related+agents:+a+review+of+the+epidemiologic+evidence.">Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence.</a> Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).</li><li>Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+fungal+diversity+in+a+water-damaged+office+building.">Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building.</a> J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).</li><li>Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+fungal+diversity+in+a+water-damaged+office+building.">Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building.</a> J Occup Environ Hyg. , (2016).</li><li>Pitkaranta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fungal+flora+in+indoor+dust+by+ribosomal+DNA+sequence+analysis,+quantitative+PCR,+and+culture.">Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture.</a> Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).</li><li>Rittenour, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+transcribed+spacer+rRNA+gene+sequencing+analysis+of+fungal+diversity+in+Kansas+City+indoor+environments.">Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments.</a> Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).</li><li>Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal-specific+PCR+primers+developed+for+analysis+of+the+ITS+region+of+environmental+DNA+extracts.">Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts.</a> BMC Microbiol. 5, 28 (2005).</li><li>Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+ITS1+and+ITS2+to+study+environmental+fungal+diversity+using+pyrosequencing.">Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing.</a> FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).</li><li>Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+and+validation+of+some+ITS+primer+pairs+useful+for+fungal+metabarcoding+studies.">Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies.</a> PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).</li><li>Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-coverage+ITS+primers+for+the+DNA-based+identification+of+ascomycetes+and+basidiomycetes+in+environmental+samples.">High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples.</a> PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).</li><li>Lemons, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+rRNA+sequencing+analysis+of+evaporative+cooler+indoor+environments+located+in+the+Great+Basin+Desert+region+of+the+United+States.">Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States.</a> Environ Sci Process Impacts. , (2017).</li><li>Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+methodology+to+detect+infectious+airborne+influenza+virus+using+the+NIOSH+bioaerosol+sampler.">Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler.</a> J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).</li><li>Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+in+coal+dust+deposited+on+internal+surface+of+respirable+size+selective+samplers.">Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers.</a> J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).</li><li>Wang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+evaluation+of+personal+sampling+methods+for+multiple+bioaerosols.">Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols.</a> PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).</li><li>Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-stage+cyclone+using+microcentrifuge+tubes+for+personal+bioaerosol+sampling.">A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling.</a> J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).</li><li>Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+DNA+extraction+methodologies+used+for+assessing+fungal+diversity+via+ITS+sequencing.">Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing.</a> J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).</li><li>ACGIH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , (2001).</li><li>Rodes, C. E., Thornburg, J. W., Ruzer, L. S., Harley, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. , (2005).</li><li>Broadwater, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+a+persistent+odor+at+an+aircraft+seat+manufacturer.">Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer.</a> J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).</li><li>Couch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , (2017).</li><li>Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+bias+associated+with+incomplete+extraction+of+microbial+DNA+from+soil.">Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).</li><li>Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+interference+to+conventional+and+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+fungi+in+dust.">Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust.</a> J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).</li><li>Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITS+as+an+environmental+DNA+barcode+for+fungi:+an+in+silico+approach+reveals+potential+PCR+biases.">ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases.</a> BMC Microbiol. 10, 189 (2010).</li><li>Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+and+rrn+gene+copy+number+on+PCR+amplification+of+16S+rRNA+genes+from+a+mixture+of+bacterial+species.">Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species.</a> Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).</li><li>Vesper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+Environmental+Relative+Moldiness+index+for+US+homes.">Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes.</a> J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).</li></ol>

調査結果とこのレポートの結論のこれらの者は、必ずしも疾病対策と予防のための労働安全と健康センターの国立研究所の公式の位置ではないです。

シーケンス ベースのアプローチを使用して労働環境の中で真菌多様性を決定する真菌ハザードの同定と露出の評価が上がった。このアプローチを使用して頻繁にしない文化または評価の顕微鏡ベースのメソッドを使用して検出される多くの種の追加真菌の検出のため許可しています。職業などの室内環境とその増幅とシーケンスの空気サンプルからゲノム DNA の抽出からバイオエアロゾルを?...

屋内と労働環境における真菌エクスポー ジャーは、アレルギー感作喘息1などの呼吸器合併症につながります。真菌危険の識別は、リスクの評価と労働者の暴露を防止するため重要です。これらの真菌危険室内汚染、外気の侵入、または労働者が現在2区域に真菌物質の輸送が行われ環境の妨害の可能性があります。真菌の暴露を評価する方法は、実行可能な文化サンプリングだけでなく、真菌胞子の顕微鏡検査に含まれています。これらのアプローチは、いくつかの制限があるし、全体的な真菌負担3に貢献できる多くの菌種を見落とすこと。文化ベースのアプローチだけの栄養媒体で栽培することができますこれらの可能な真菌の生物を区別できます。顕微鏡を介して種レベルに真菌の胞子を識別するは、胞子のような形態の共有によって混同することができます。どちらの方法、分析し多く残り正体不明で、菌種を特定する mycologists に大きく依存します。
職業上の危険識別および暴露評価で使用される既存の方法論を改良するには、多くの研究者は分子ベースの技術になっています。屋内と労働環境の中で微生物の多様性を評価するためのシーケンス ベースのアプローチは、顕微鏡や実行可能な文化3,4 などの方法と比較して検出された菌種の広範なスペクトルを明らかにしています。 ,5。ここで紹介した方法では、労働環境の空気サンプリングと真菌の潜在的な危険を識別するためのゲノム DNA の抽出をについて説明します。有害性の特定には核リボソーム内部転写スペーサー、または、その菌の中で非常に可変、真菌種6,7を区別するために一般的に使用されている地域を配列することによって、します。 8,9。多くの種門、担子菌類に属するいくつかの種はない実行可能な文化に個人を特定できるよう、職場で見と病理組織学的に区別することは困難。これらの菌は、屋内と労働環境シーケンス真菌 ITS 領域3,4,10評価内で高い相対的な豊富に観察されています。その配列は、屋内と労働環境の内で発生した菌類の多様性に一層の知識を提供しています。
プロトコルは方法を使用して収集、抽出、およびシーケンス解析のためのバイオエアロゾルから真菌の ITS 領域を増幅する詳細を紹介します。このアプローチは、空気中の微粒子を収集するために 2 段サイクロン エアロゾル サンプラーの労働安全と健康 (NIOSH) の国立研究所を利用しています。このサンプラーはバイオエアロゾルと別の吸入 (≤4 μ m 空気力学的直径) を収集するために開発された、非吸入 (> 4 μ m の空気力学的直径) 粒子は、ほとんどが屋内環境内で真菌の生物の同定は、ワーカー11によって吸入する可能性が高い。サイクロン サンプラーを含む他の空気サンプラーは吸入範囲内で粒子を収集する能力を持っている市場で利用できる (< 4 μ m)12,13をフィルターを使用しています。対照的に、NIOSH 2 段サイクロン エアロゾル サンプラーは、下流のアプリケーション14すぐに処理できる使い捨て、ポリプロピレン チューブにその空気力学的直径に基づく種の真菌を分離します。
ゲノム DNA を抽出し、真菌の ITS 領域の増幅のプロセスは、このプロトコルに記載されています。抽出の方法論の提示は、多くの市販キットのターゲット哺乳類細胞、細菌、または特に酵母15菌類および細菌からの DNA の抽出のために特別開発されています。本研究で使用されるプライマーは、真菌の 1 とその 2 地域4、5の両方の全体的な取材に基づいて選択されます。これらの領域のシーケンスことができます含め、バンクの多くの ITS 配列の比較のシーケンスその 1 地域、その 2 地域、または地域の 1 とその 2 の両方。大気試料の菌類の多様性より少なく支配的な真菌門に属する他のシーケンスと同様に、シーケンスの門は、子嚢菌門と担子菌類のかなりの数を明らかに、これらのメソッドが表示されますを使用して屋内設定で収集接合菌。このアプローチを使用して識別される真菌のシーケンスの広範な多様性は栽培や顕微鏡のような伝統的なハザード識別方法を使用するキャプチャと思います。真菌の ITS 領域の塩基配列決定は、真菌の危険を識別し、屋内と職業の真菌エクスポー ジャーのよりよい理解を可能にする拡張メソッドを提供します。

<table><tbody><tr><td>NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler</td><td>NIOSH</td><td>BC251</td><td>The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler</td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-373</td><td>1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>15 mL polypropylene tubes for air sampling</td></tr><tr><td>Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4&quot; Width</td><td>McMaster-Carr</td><td>76505A1</td><td>sealing tape</td></tr><tr><td>Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm</td><td>SKC Inc.</td><td>225-3LF</td><td>3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs</td></tr><tr><td>PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 &amp;micro;m, 37 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>FSLW03700</td><td>Contains: 37 mm, 3.0 &amp;micro;m PTFE filters and support pads</td></tr><tr><td>Fisherbrand filter forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-753-50</td><td>filter forceps</td></tr><tr><td>Model 502 Precision PanaPress</td><td>PanaVise</td><td>502</td><td>pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press</td></tr><tr><td>Scotch Super 33+ vinyl electrical tape</td><td>McMaster-Carr</td><td>76455A21</td><td>19 mm tape</td></tr><tr><td>Multi-purpose Calibration Jar, Large</td><td>SKC Inc.</td><td>225-112</td><td>calibration jar</td></tr><tr><td>Universal PCXR4 Sample Pump</td><td>SKC Inc.</td><td>224-PCXR4</td><td>sampling pump</td></tr><tr><td>Mass Flowmeter 4140</td><td>TSI Inc.</td><td>4140</td><td>flow meter</td></tr><tr><td>Roche High Pure PCR Template Kit</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11796828001</td><td>Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes</td></tr><tr><td>Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps</td><td>Fisher Scientific</td><td>15340162</td><td>2 mL reinforced tubes for bead homogenization</td></tr><tr><td>Glass beads, acid washed, 212-300 &amp;micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td>glass beads</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-163</td><td>bead homogenizer</td></tr><tr><td>CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8740</td><td>lysis reagent</td></tr><tr><td>Platinum Taq polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10966-018</td><td>Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427-088</td><td>10 mM dNTP mix</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye</td></tr><tr><td>Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>B1 or B2</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>10488-085</td><td>DNA ladder</td></tr></tbody></table>

collection and extraction of occupational air samples for analysis of fungal dna

従来の文化や顕微鏡ベースのアプローチなどの労働環境における真菌エクスポー ジャーを識別する多くの種の排除で起因したいくつかの制限があります。最後の 20 年間の進歩は、真菌の危険を識別するための分子ベースのアプローチに衛生研究を主導しています。これらのメソッドは、従来の方法を使用して検出されていない持っている屋内と労働環境の内で多くの種の検出にしました。空気内真菌の多様性を決定するためのアプローチのゲノム DNA の抽出、増幅、シーケンシング、および内部の真菌の分類同定を通してサンプルこのプロトコルの詳細は転写スペーサー (ITS) 領域です。そのシーケンスの結果、検出できないか、または文化または顕微鏡を使用して種レベルに特定は難しい多くの菌種の検出。これらのメソッドは、真菌の負担の定量的な対策を提供しない、彼らはハザード同定への新しいアプローチを提供し、全体の種多様性および労働環境の中で多様性を決定するため使用することができます。

環境内での種の分布は、大気試料で識別される各乙のクローンの数を決定することによって相対的な豊かさを使用して評価できます。図 6は、次の空気サンプリングの 60 分屋内環境内で分類学的に種を表すアイスランドクローナ グラフです。それは、環境にさまざまな門接合菌 (クモノスカビ microsporus) に属する種と同様、2 つの主要な菌...

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真菌 DNA 分析のための職場空気サンプルの収集と抽出 |環境 |ビデオ

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

環境内で菌類の多様性を決定する、衛生学健康への危険を識別するために利用されている方法です。このプロトコルでは、真菌の ITS 領域の拡大そして配列の産業空気サンプルからの DNA 抽出について説明します。このアプローチは、伝統的な評価方法によって見落とされることができる多くの菌類の種組成を検出します。

コレクションと真菌 DNA の分析のための産業大気サンプルの抽出

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

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12.3K ビュー.  Centers for Disease Control and Prevention. 環境内で菌類の多様性を決定する、衛生学健康への危険を識別するために利用されている方法です。このプロトコルでは、真菌の ITS 領域の拡大そして配列の産業空気サンプルからの DNA 抽出について説明します。このアプローチは、伝統的な評価方法によって見落とされることができる多くの菌類の種組成を検出します。

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Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

ロングリード配列決定のためのうどんこ病から高分子量のゲノムDNAの精製

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

遺伝学

Air-sampled Filter Analysis for Endotoxins and DNA Content

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles to be performed in parallel. The purpose of the method presented here is to obtain a highly accurate and reliable analysis of the endotoxin and DNA content of bio-aerosols extracted from filters. The extraction of high molecular weight organic molecules, such as lipopolysaccharides, from sampled filters involves shaking the sample in a pyrogen-free water-based medium. The subsequent analysis is based on an enzymatic reaction that can be detected using a turbidimetric measurement. As a result of the high organic content on the sampled filters, the extraction of DNA from the samples is performed using a commercial DNA extraction kit that was originally designed for soils and modified to improve the DNA yield. The detection and quantification of specific microbial species using quantitative polymerase chain reaction (q-PCR) analysis are described and compared with other available methods.

Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.

エンドトキシンとDNAコンテンツのエアサンプリングフィルタ解析

Outdoor aerosol research commonly uses particulate matter sampled on filters. This procedure enables various characterizations of the collected particles ...

環境学

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

実証、メタゲノムと計算手法を照らす殺菌剤妥協ミツバチ健康メカニズム

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

免疫・感染学

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

組成と異なる環境条件下におけるバイオエアロゾルの分布解析

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

から毒素誘導とタンパク質抽出フザリウム属属。</emプロテオーム研究>文化

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

生物学

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse models of pulmonary fungal infection. Although multiple methods are used to assess fungal burden, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of fungal DNA has emerged as a technique with several advantages over previous culture-based methods. Currently, a comprehensive assessment of lung pathology, leukocyte recruitment, fungal burden, and gene expression in mice with invasive aspergillosis (IA) necessitates the use of a significant number of experimental and control animals. Here the quantification of lung histological staining to determine fungal burden using a reduced number of animals was examined in detail. Lung sections were stained to identify fungal structures with Gomori&#39;s modified methanamine silver (GMS) staining. Images were taken from the GMS-stained sections from 4 discrete fields of each formalin-fixed paraffin-embedded lung. The GMS stained areas within each image were quantified using an image analysis program, and from this quantification, the mean percentage of stained area was determined for each sample. Using this strategy, eosinophil-deficient mice exhibited decreased fungal burden and disease with caspofungin therapy, while wild-type mice with IA did not improve with caspofungin. Similarly, fungal burden in mice lacking &#947;&#948; T cells were also improved by caspofungin, as measured by qPCR and GMS quantification. GMS quantification is therefore introduced as a method for the determination of relative lung fungal burden that may ultimately reduce the quantity of experimental animals required for comprehensive studies of invasive aspergillosis.

Here we describe a protocol to determine pulmonary fungal burden in mice with invasive aspergillosis by quantification of Gomori&#39;s modified methanamine silver staining in histological sections. Use of this method resulted in comparable results with less animals compared to assessment of fungal burden by quantitative PCR of lung fungal DNA.

アスペルギルス症では実験的肺真菌負担を決定する組織の定量化

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular fungi such as molds and unicellular fungi, broadly defined as yeasts, fulfill essential roles in soil ecosystems as decomposers of organic material and as food sources for other soil dwellers. Fungal species diversity in soil is dependent on a multitude of climatic factors such as rainfall and temperature, as well as soil properties including organic matter, pH, and moisture. Lack of adequate environmental sampling, especially in regions of Asia, Africa, South America, and Central America, hinders the characterization of soil fungal communities and the discovery of novel species. 
We characterized soil fungal communities in nine countries across six continents using ~4,000 soil samples and a protocol developed in the laboratory for the isolation of yeasts and molds. This protocol begins with separate selective enrichment for yeasts and the medically relevant mold Aspergillus fumigatus, in liquid media while inhibiting bacterial growth. Resulting colonies are then transferred to solid media and further processed to obtain pure cultures, followed by downstream genetic characterization. Yeast species identity is established via sequencing of their internal transcribed spacer (ITS) region of the nuclear ribosomal RNA gene cluster, while global population structure of A. fumigatus is explored via microsatellite marker analysis. 
The protocol was successfully applied to isolate and characterize soil yeast and A. fumigatus populations in Cameroon, Canada, China, Costa Rica, Iceland, Peru, New Zealand, and Saudi Arabia. These findings revealed much-needed insights on global patterns in soil yeast diversity, as well as global population structure and antifungal resistance profiles of A. fumigatus. This paper presents the method of isolating both yeasts and A. fumigatus from international soil samples.

This protocol is an effective, speedy method of culturing yeasts and the mold Aspergillus fumigatus from large sets of soil samples in as little as 7 days. The methods can be easily modified to accommodate a range of incubation media and temperatures as needed for experiments.

土壌からの培養酵母・カビの分離による菌群構造調査

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as any other vital resource, the fungi with which these plants intimately associate are essential for them. Hence, some of the most relevant techniques in studying mycoheterotrophic species are the ones that enable the investigation of associated fungi, especially those inhabiting roots and subterranean organs. In this context, techniques for identifying culture-dependent and culture-independent endophytic fungi are commonly applied. Isolating fungal endophytes provides a means for morphologically identifying them, analyzing their diversity, and maintaining inocula for applications in the symbiotic germination of orchid seeds. However, it is known that there is a large variety of non-culturable fungi inhabiting plant tissues. Thus, culture-independent molecular identification techniques offer a broader cover of species diversity and abundance. This article aims to provide the methodological support necessary for starting two investigation procedures: a culture-dependent and an independent one. Regarding the culture-dependent protocol, the processes of collecting and maintaining plant samples from collection sites to laboratory facilities are detailed, along with isolating filamentous fungi from subterranean and aerial organs of mycoheterotrophic plants, keeping a collection of isolates, morphologically characterizing hyphae by slide culture methodology, and molecular identification of fungi by total DNA extraction. Encompassing culture-independent methodologies, the detailed procedures include collecting plant samples for metagenomic analyses and total DNA extraction from achlorophyllous plant organs using a commercial kit. Finally, continuity protocols (e.g., polymerase chain reaction [PCR], sequencing) are also suggested for analyses, and techniques are presented here.

The current article aims to provide detailed and adequate protocols for the isolation of plant-associated endophytic fungi, long-term preservation of isolates, morphological characterization, and total DNA extraction for subsequent molecular identification and metagenomic analyses.

菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

Investigating Bacterial-Fungal Interactions using Fungal Highway Columns in Diverse Environments and Substrates

Bacterial-fungal interactions (BFIs) play an integral role in shaping microbial community composition, biogeochemical functions, spatial dynamics, and microbial dispersal. Mycelial networks created by filamentous fungi or other filamentous microorganisms (e.g., Oomycetes) act as 'fungal highways' that can be utilized by bacteria for transport throughout heterogeneous environments, greatly facilitating their mobility and granting them access to regions that may be challenging or impossible to reach on their own (e.g., due to air pockets within the soil). Several devices and experimental protocols have been created to study these fungal highways, including fungal highway columns. The fungal highway column designed by our group can be used for a variety of in situ or in vitro applications, as well as with diverse environmental and host-associated sample types. Herein, we describe the methods for performing experiments with these columns, including designing, printing, sterilizing, and preparing the devices. The options for analyzing data obtained from the use of these devices are also discussed here, and troubleshooting advice regarding potential pitfalls associated with experiments using fungal highway columns is offered. These devices can be used to gain a more comprehensive understanding of the diversity, mechanisms, and dynamics of fungal highway BFIs to provide valuable insights into the structural and functional dynamics within complex environments (e.g., soils) and across diverse habitats in which bacteria and fungi co-exist.

This protocol provides detailed instructions on how to construct, sterilize, assemble, utilize, and reuse the fungal highway columns to enrich bacterial-fungal pairs interacting through fungal highways from diverse environmental substrates.

多様な環境および基質における真菌ハイウェイカラムを用いた細菌-真菌相互作用の調査

Bacterial-fungal interactions (BFIs) play an integral role in shaping microbial community composition, biogeochemical functions, spatial dynamics, and ...