私たちのプロトコルは、異なる気候地域から得られた土壌サンプルを使用して、土壌中の酵母とカビの多様性を調査します。これは、環境酵母の多様性に関する洞察を提供し、病原性種の追跡に役立ちます。このプロトコルは、土壌から酵母やカビを収穫する費用対効果の高い迅速な方法を提供します。
土壌サンプルは、わずか7日で分離株を得るために完全に処理することができます。培養チューブにラベルを付け、培地を1日前に準備するなど、よく組織された実験セットアップは、実験中に圧倒される感覚を避けるための鍵です。滅菌13ミリリットル培養チューブのセットを準備することから始めます。
土壌サンプルIDでそれらを標識することによって、血清学的ピペットを使用して、クロラムフェニコールおよびベノミルを添加した酵母エキス - ペプトン - デキストロースブロス5ミリリットルを各チューブに加える。レベル2の生物用のバイオセーフティキャビネット内で、滅菌木製の平面先端アプリケーターを使用して、約0.1グラムの土壌を適切な培養チューブに移します。チューブを最初のストップにしっかりとキャップし、インキュベーション中の空気交換を可能にしながらこぼれを防ぎます。
次に、培養チューブをローラードラム中で、酵母増殖を最大化するのに最適と考えられる温度で24時間インキュベートする。次いで、クロラムフェニコールおよびベノミル添加酵母エキスペプトンデキストロース寒天プレートを、上清を固体培地に移す前に土壌サンプルIDで標識する。ローラードラムから培養チューブを取り外します。
次に、レベル2の生物用のバイオセーフティキャビネット内で、チューブを短時間渦巻きにして、底に沈んだ可能性のある土壌粒子と細胞を懸濁液に戻します。次に、上清100マイクロリットルをマイクロピペットを用いてプレート上に移す。滅菌再利用可能なセルスプレッダーを使用して、液体を寒天表面に完全かつ均等に広げます。
2〜3日の十分なインキュベーション時間を確保した後、レベル2の生物のバイオセーフティキャビネット内の酵母増殖についてプレートを検査します。クリーミーで丸みを帯びたマット状の酵母で、細菌やカビのコロニーと簡単に区別できます。滅菌された木製の平らな先端のアプリケータースティックを使用して、各プレートから酵母様のコロニーを1つ選択します。
選択した各コロニーを、単一コロニー用のクロラムフェニコールとベノミルとストリークを添加した新鮮な酵母エキスペプトンデキストロ寒天プレートに移します。3つの別々のスジを実行し、すべてのスジに新しいアプリケータースティックを使用します。次に、プレート上で展開した新鮮な細胞を用いてコロニーポリメラーゼ連鎖反応を行う。
内部転写スペーサーITS1およびITS4プライマーを使用して、真菌バーコード遺伝子を増幅する。得られた酵母株の内部転写スペーサー配列と、国立バイオテクノロジー情報センターGenBankおよびUNITEなどの公開データベースに寄託された2つの配列を比較し、種の同一性を確立する。1ミリリットルのサブローデキストロースブロスを含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに土壌を加え、摂氏50度で2〜4日間インキュベートする。
土壌接種ブロスから麦芽エキス寒天プレート上に菌糸体を移すには、まず、目に見える菌糸成長を有する土壌接種物を特定し、サブローデキストロースブロスを空気境界に加える。次に、滅菌された木製のプレーンチップアプリケータースティックを使用して、菌糸体を麦芽エキス寒天プレートの中心に移し、これらの麦芽エキス寒天プレートを摂氏37度に設定して3日間インキュベートします。菌糸体の選択のために、アスペルギルス フミガーツスの形態学的特性を有する、特徴的な緑色の揺れ様成長を有するカビコロニーを同定する。
レベル2の生物のためのバイオセーフティキャビネット内では、滅菌された木製の平面先端アプリケータースティックまたは接種ループを使用して表面を一度こすり取って分生子または菌糸体を収穫し、単一コロニー用の寒天上に縞模様をつけることによって麦芽エキス寒天プレートの中心に移す。プレートを摂氏37度で2日間インキュベートする。滅菌塗布スティックまたは接種ループを用いて、コロニーを1回ストリークすることにより麦芽エキス寒天上に生成した単一コロニーを継代培養する。
収穫した胞子をプレートの中央に広げる。滅菌30%グリセロール溶液を調製し、培養保存のためにアスペルギルス フミガーツス胞子または菌糸体を採取する。寒天プレートを摂氏37度で2日間インキュベートした後、ピペットを用いて30%グリセロール溶液の1ミリリットルを吸引し、それをアスペルギルス フミガーツスコロニーに分散させる。
アスペルギルス フミガーツス株の表現型同定のために、菌糸体および胞子ストックの10マイクロリットルを吸引し、990マイクロリットルの水を加える。この希釈胞子懸濁液をボルテックスし、10マイクロリットルの懸濁液を標準的な顕微鏡スライド上に分配する。次いで、化合物顕微鏡を用いて、懸濁液を倍率400倍で観察し、分生子腫を見出す。
観察された分生子の形態をアスペルギルス フミガーツス コニディオフォアの形態と比較します。9つのマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれについて正しい断片サイズを決定するには、断片解析が可能なソフトウェアを使用する。キャピラリー電気泳動から得られた生データを取得し、断片化された分析ソフトウェアを使用して、最大のピークに基づいて断片サイズをスコアリングします。
次に、基準株Af293の繰り返し数のフラグメントサイズを使用して9つの低いそれぞれの繰り返し数にフラグメントサイズを変換する。3,826の土壌サンプルから9カ国の53カ所から採取し、1,473の酵母株を単離した。各国の最良のインキュベーション温度は、その年間平均気温に基づいて決定されました。
各国の希薄化分析では、土壌酵母多様性の尺度としてシャノン多様性指数を用いた。得られた希薄化曲線は飽和漸近線に近づき、追加のサンプリングがより多くの酵母多様性をもたらした可能性は低いことを示している。プレート上の菌糸成長は、アスペルギルス フミガーツスに典型的な緑色の揺れた形態を形成した。
他の耐熱性真菌種は、同じ土壌サンプル内に存在し、同じプレート上または単独でアスペルギルス フミガーツスを成長させることができる。光顕微鏡を用いて確認・同定されたアスペルギルス・フミガトゥス・フミガトゥス・コニディオフォア構造は、分生子植物がスティックの形態にボールを持ち、分生子葉がユニセリエートであり、分生子鎖に結合したフィアリドが球状小胞に直接結合していることが明らかになった。生成されたバイセリエートをクロマトグラムは、アスペルギルス フミガーツス・ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、およびテトラヌクレオチド短タンデムリピート遺伝子座の断片長を視覚化する3つのチャネルを明らかにした。
高品質の最小スパニング ネットワークは、R スクリプト plot_poppr_msn または imsn を使用して生成できます。主要成分の判別的分析は、系統間の遺伝的関係を視覚化するもう1つの方法です。ベノミルとクロラムフェニコールを増殖培地に添加すると、それぞれカビと細菌の増殖を防ぎ、酵母の選択を促進します。
クロラムフェニコールはまた、培地中の発酵を減少させ、インキュベーションチューブ内のガス蓄積を低下させる。土壌サンプルでメタゲノミクスを行うことで、文化的多様性に関する追加情報が得られます。A.fumigatus株の感受性試験は、耐性遺伝子型の存在を同定する。
このプロトコルは、ほとんど変更することなく、他の酵母およびカビシステムに適用することができます。それは、地球規模での文化的な土壌酵母の多様性とその予測因子の調査を容易にした。
