この方法は、クロマチンの3D構造が遺伝子発現や開発にどのような影響を与えるかなど、クロマチンアーキテクチャ分野の重要な質問に答える上で役立ちます。この技術の主な利点は、クロマチンアーキテクチャと正確にステージされたフライ胚の高解像度ビューを提供することです。この方法はクロマチンの組織と開発に関する洞察を提供することができますが、トランスジェニックフライライブラリの既存のラインを使用してクロマチン組織での効果をテストすることもできます。
プロトコルを開始するには、PBSTで以前に収集した胚の総体積を2ミリリットルに調整します。6ミリリットルのヘプタンと37%ホルムアルデヒドの100マイクロリットルを水中に加えます。ホルムアルデヒドを加えた後、チューブを1分間激しく上下に振ります。
水相と有機相は、組み合わせてシャンプーのような一貫性を形成します。ロータリーミキサーで10分間攪拌します。チューブの底部に胚を集めるために、チューブを室温で1分間500回gで遠心分離する。
シャンプー状の液体全体を吸引し、それを捨てて、胚を吸引しないように注意してください。ホルムアルデヒドを添加してから15分後、125ミリモルグリシンを用いて5ミリリットルのPBSTで胚を再懸濁する。胚を1分間激しく振り下ろします。
遠心後、上清を吸引する。1,000マイクロリットルピペットを使用して、100個の胚のバッチを選別に適した小さなガラス容器に移し、好ましくは暗い背景に置き、氷の上に置きます。針または注射器先端を使用して、核密度と細胞周期状態で胚を並べ替えます。
EGFP PCNAの分散した非核分布と、部分的に非核GFP信号を示す胚によって認識可能なすべての有糸分裂性胚を除去する。分類を支援するために、各バッチの核周期12、13、および14で参照胚を並べて、胚を参照胚の1つと一致させる。1,000マイクロリットルピペットを使用して所望の胚をピペットアップする。
新鮮なチューブにそれらを転送し、氷の上に置きます。計画された実験のために十分な胚がソートされるまで続けます。スピンチューブは室温で100倍gで短時間回転します。
上清を取り除き、胚が凍結のために可能な限り乾燥していることを確認します。フラッシュは、液体窒素にチューブを水没させることによって胚を凍結し、マイナス80°Cで保存します。氷の上に凍結胚とチューブを置きます。
500マイクロリットルの氷冷ライシスバッファーで胚を再懸濁します。胚がチューブの底に落ち着くように1分待ちます。次に、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにしっかりとフィットするように設計された氷の上で予冷した金属マイクロ害虫で胚を粉砕します。
胚を攪拌しないように、チューブの底に触れるまでゆっくりと害虫を挿入します。下に押し下げてから、両方向に2回害虫を回転させます。害虫を少し持ち上げます。
チューブの底にもう一度押し込み、粉砕手順を10回、または胚が完全にlysedされるまで繰り返します。溶液は均質であるべきであり、残存する大きな胚片は残らないべきである。均質化懸濁液を氷上で15分間インキュベートする。
1,000倍g 4°Cで5分間スピンします。上清を捨て、500マイクロリットル氷冷ライシスバッファーで再懸濁し、上下にピペット処理してペレットを洗浄します。別のスピンの後、上清を捨てます。
洗浄したペレットを0.5%のナトリウムドデシル硫酸またはSDSの100マイクロリットルで再懸濁する。その後、加熱ブロックで摂氏65度で10分間サンプルをインキュベートすることによって核を透過させます。10%トリトンX100と120マイクロリットルの水の50マイクロリットルを追加します。
チューブをフリックして内容物を混ぜ、ヒートブロックで15分間摂氏37度でチューブをインキュベートします。10X制限酵素バッファー25マイクロリットル、マイクロリットルMBO1あたり5単位20個を加えます。チューブをフリックして内容物を混ぜ、チューブを熱ブロックにインキュベートしてDNAを消化します。
MBO1 のさらに 20 単位を追加します。インキュベーションを90分間続けます。2回目の90分間のインキュベーションの後、サンプルを摂氏62度で20分間インキュベートし、MBO1を非アクティブにします。
次に、0.4ミリモルビオチン14-dATPの18マイクロリットル、2.25マイクロリットルの未改変3.3ミリモルdCTP-dGTP-dTTPミックス、およびマイクロリットルDNAポリメラーゼIクレノウ断片あたり5単位の8マイクロリットルを加える。チューブをフリックして内容物を混ぜ、サンプルを摂氏37度で90分間インキュベートします。次に、657マイクロリットルの水、10X T4 DNAリガーゼバッファーの120マイクロリットル、10%トリトンX100の100マイクロリットル、1ミリリットルウシ血清アルブミンあたり20ミリグラムの6マイクロリットル、そして最後にマイクロリットルT4 DNAリガーゼあたり5リットルの5マイクロリットルを加える。
次に、室温で20RPMで2時間静かにチューブを回転させます。マイクロリットルT4 DNAリガーゼあたり5単位のさらに5マイクロリットルを追加します。さらに2時間回転し続け、2,500倍gで核を5分間回転させます。
遠心後、上清を捨てる。ペレットを抽出バッファーの 500 マイクロリットルに再懸濁し、1 ミリリットルプロテイナーゼ 1 ミリグラム 20 ミリリットルの 20 マイクロリットルを加え、チューブをフリックし、チューブをインキュベートしてタンパク質を消化します。5モル塩化ナトリウムの130マイクロリットルを追加し、非架橋に一晩インキュベート。
翌日、サンプルを低DNA結合特性を持つ新しい2ミリリットルチューブにピペットします。酢酸ナトリウム3モルの0.1倍の体積と1ミリリットルの2マイクロリットルを1ミリリットルグリコブルーを加えます。1.6量の純粋な絶対エタノールを加え、内容物を反転させ、15分間マイナス80度でサンプルをインキュベートします。
インキュベーション後、内容物を遠心分離する。グリコブルーでしか見つめることができないDNAペレットを見つけます。上清を慎重に取り出し、ピペットチップをDNAペレットから反対側の壁に沿ってチューブに移動します。
ペレットを70%エタノールの800マイクロリットルで洗浄します。サンプルを反転して遠心分離し、室温で20,000倍のgで5分間混ぜます。このステップ中に残りの液滴を取り除き、P10チップでチューブから押し出して次の液滴を開け、蓋を開けて最大5分間空気乾燥させます。
液体が残らない場合は、50マイクロリットルの10ミリモルトリスクロリドを加えます。DNAを可溶化するためにペレットが配置された領域に溶液を繰り返しピペットします。チューブをフリックして、1ミリリットルRNase A.Mixあたり20ミリグラムの1マイクロリットルを追加します。
サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートし、RNAを消化します。最後に、ライブラリの準備ができるまで、冷凍庫または冷蔵庫にサンプルを保管します。各ソートされた胚バッチのEGFP PCNAシグナルの画像は、下流実験のためのすべての単一の胚の正確な段階および細胞周期状態を明らかにする。
バイオアナライザーのトレースは、サイズ選択後のDNA断片のサイズ分布が300~700塩基対の間にあり、最大約450塩基対であることを示している。Hi-C相互作用マップは、核周期12では、TADがますます顕著になり、非特異的な長距離接触が枯渇する核サイクル13と14で劇的に変化するトポロジカル関連ドメインまたはTADが検出される少数であることを示している。この手順を試みる間、ビーズを徹底的に洗い、特に高温時に不必要にインキュベーション時間を延長しないように注意することが重要です。
この技術は、正確なステージングと高解像度クロマチン確認マッピングを組み合わせることで、エピジェネティクス分野の研究者が生体内発達環境における3次元クロマチン組織の役割を探求する道を開きました。
