يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة الكروماتين مثل كيف يمكن للهيكل ثلاثي الأبعاد من الكروماتين أن يؤثر على التعبير الجيني والتطور. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر رؤية عالية الدقة لهندسة الكروماتين وأجنة الذبابة على وجه التحديد. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تنظيم الكروماتين والتنمية، يمكن للمرء أيضا استخدام خطوط القائمة من مكتبات ذبابة المعدلة وراثيا لاختبار تأثيرها في منظمة الكروماتين.
للبدء في البروتوكول، ضبط الحجم الإجمالي للأجنة التي تم جمعها سابقا إلى ملليلترين مع PBST. إضافة ستة ملليلتر من الهبتان و 100 ميكرولترات من 37٪ الفورمالديهايد في الماء. بعد إضافة الفورمالديهايد، يهز بقوة أنبوب صعودا وهبوطا لمدة دقيقة واحدة.
وسوف تتحد المرحلة مائي والعضوية لتشكيل اتساق مثل الشامبو. تهيج الخليط على خلاط دوار لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 500 مرة ز لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لجمع الأجنة في الجزء السفلي من الأنبوب.
pirate كامل مثل الشامبو السائل والتخلص منه، مع الحرص على عدم التعرق أي أجنة. بعد 15 دقيقة من إضافة الفورمالديهايد، إعادة تعليق الأجنة في خمسة ملليلتر من PBST مع 125 جليكاين ملليمولار. هز الأجنة صعودا وهبوطا بقوة لمدة دقيقة واحدة.
بعد الطرد المركزي، طامح المغرور. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، نقل دفعة من 100 جنين إلى وعاء زجاجي صغير مناسب للفرز، ويفضل أن يكون ذلك على خلفية داكنة ووضعها على الجليد. فرز الأجنة حسب الكثافة النووية وحالة دورة الخلية باستخدام إبرة أو حقنة تلميح.
إزالة جميع الأجنة الميتاوتية التي يمكن التعرف عليها من خلال توزيعها غير النووي المتفرق لـ EGFP PCNA والأجنة التي تظهر جزئيًا إشارة GFP غير نووية. للمساعدة في الفرز، اصطف الأجنة المرجعية في الدورات النووية 12 و 13 و 14 في كل دفعة لتتناسب مع الأجنة مع واحد من الأجنة المرجعية. ماصة حتى الأجنة المطلوب باستخدام 1000 ماصة ميكرولتر.
نقلها إلى أنبوب جديد ووضعها على الجليد. استمر حتى يتم فرز ما يكفي من الأجنة للتجربة المخطط لها. تدور أنابيب لفترة وجيزة في 100 مرة ز في درجة حرارة الغرفة.
إزالة فائقة وضمان الأجنة جافة قدر الإمكان لتجميد. فلاش تجميد الأجنة عن طريق غمر الأنابيب في النيتروجين السائل وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. ضع الأنابيب مع الأجنة المجمدة على الجليد.
resuspend الأجنة في 500 ميكرولترات من الجليد الباردة العازلة التحلل. انتظر دقيقة واحدة للسماح للجنين بالاستقرار في الجزء السفلي من الأنبوب. بعد ذلك ، طحن الأجنة مع آفة معدنية صغيرة تم تبريدها مسبقًا على الجليد الذي تم تصميمه لتناسب بإحكام أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر.
لتجنب تهيج الأجنة ، أدخل الآفة ببطء حتى تمس الجزء السفلي من الأنبوب. دفع لأسفل ثم طحن عن طريق تدوير الآفات مرتين في كلا الاتجاهين. رفع الآفات قليلا جدا.
دفع إلى الجزء السفلي من الأنبوب مرة أخرى وتكرار إجراء طحن 10 مرات أو حتى يتم lysed الأجنة تماما. وينبغي أن يكون الحل متجانساً وألا تبقى قطع كبيرة متبقية من الأجنة. احتضان التعليق المتجانس على الجليد لمدة 15 دقيقة.
تدور في 1،000 مرة ز أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وغسل بيليه عن طريق resuspending في 500 ميكرولتر الجليد الباردة العازلة والتحلل صعودا وهبوطا. بعد دوران آخر، تجاهل الماخرة.
Resuspend بيليه غسلها في 100 ميكرولترات من 0.5٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات أو SDS. ثم قم بإضفاء الصبغة على النواة عن طريق احتضان العينة لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية في كتلة التدفئة. إضافة 50 ميكرولترات من 10٪ تريتون X100 و 120 ميكرولترات من المياه.
نفض الغبار الأنبوب لخلط المحتويات واحتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في كتلة الحرارة. إضافة 25 ميكرولتردات من 10X تقييد إنزيم العازلة و 20 وحدة من خمس وحدات لكل ميكرولتر MBO1. نفض الغبار الأنبوب لخلط المحتويات واحتضان الأنبوب في كتلة الحرارة لهضم الحمض النووي.
إضافة 20 وحدة أخرى من MBO1. مواصلة الحضانة لمدة 90 دقيقة. بعد الحضانة الثانية لمدة 90 دقيقة ، احتضان العينة في 62 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لactive من MBO1.
بعد ذلك، أضف 18 ميكرولترات من 0.4 ملليمولار حيوي 14-dATP، 2.25 ميكرولترات من مزيج dCTP-dGTP-dTTP غير المعدلة 3.3 ميليمولار، وثمانية ميكرولترات من خمس وحدات لكل ميكرولترر الحمض النووي بوليميراز أنا كلينو جزء. نفض الغبار الأنبوب لخلط المحتويات واحتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 657 ميكرولترات من الماء ، و 120 ميكرولترات من 10X T4 الحمض النووي العازل ، و 100 ميكرولترات من 10 ٪ Triton X100 ، وستة ميكرولترات من 20 ملليغرام لكل ملليلتر بولفين مصل الألبوم ، وأخيرا خمسة ميكرولترات من خمس وحدات لكل ميكرولتر T4 LIGAse الحمض النووي.
بعد ذلك، قم بتدوير الأنبوب بلطف عند 20 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. إضافة آخر خمسة ميكرولترات من خمس وحدات لكل microliter T4 الحمض النووي ligase. استمر في الدوران لمدة ساعتين إضافيتين، ثم قم بالدوران إلى أسفل النوى بمعدل 2،500 مرة ز لمدة خمس دقائق.
بعد الطرد المركزي، تخلص من المغرور. Resuspend بيليه في 500 ميكرولتررس من العازلة استخراج وإضافة 20 ميكرولترات من 20 ملليغرام لكل ملليلتر البروتينات K.Flick الأنبوب واحتضان الأنبوب لهضم البروتين. إضافة 130 ميكرولترات من خمسة كلوريد الصوديوم الضرس واحتضان بين عشية وضحاها إلى إزالة crosslink.
في اليوم التالي، ماصة العينة في أنبوب ملليلتر جديد مع خصائص منخفضة ربط الحمض النووي. إضافة 0.1X حجم من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس واثنين من ميكرولترات من 15 ملليغرام لكل ملليلتر جليكوبل. إضافة 1.6 مجلدات من الإيثانول المطلق النقي وعكس المحتويات، ثم احتضان العينة في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
بعد الحضانة، الطرد المركزي محتويات. حدد موقع بيليه الحمض النووي الذي لا يمكن إلا أن رصدت من قبل GlycoBlue. إزالة فائقة بعناية، تحريك تلميح ماصة في أنبوب على طول الجدار المقابل من بيليه الحمض النووي.
غسل بيليه مع 800 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول. اخلط العينة عن طريق عكسها وطاردتها المركزية عند 20,000 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. إزالة قطرات المتبقية خلال هذه الخطوة ويغسل التالية عن طريق دفعها للخروج من الأنابيب مع طرف P10، ثم فتح غطاء للهواء الجاف لمدة تصل إلى خمس دقائق.
مرة واحدة لا يوجد سائل هو المتبقية، إضافة 50 ميكرولترات من 10 ملليمولار ثلاثيات كلوريد. ماصة مرارا وتكرارا الحل على المنطقة حيث كان موجودا بيليه ل solubilize الحمض النووي. إضافة ميكرولتر واحد من 20 ملليغرام لكل ملليلتر RNase A.Mix عن طريق نفض الغبار الأنبوب.
احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لهضم الحمض النووي الريبي. وأخيراً، قم بتخزين العينة في الثلاجة أو الثلاجة حتى إعداد المكتبة. تكشف صور إشارة PCNA EGFP لكل دفعة من مجموعات الأجنة التي تم فرزها عن مرحلة دقيقة وحالة دورة الخلايا لكل جنين واحد لتجارب المصب.
تظهر آثار Bioanalyzer أن توزيع حجم شظايا الحمض النووي بعد تحديد الحجم يتراوح بين 300 إلى 700 زوج أساسي بحد أقصى يبلغ حوالي 450 زوجًا أساسيًا. تُظهر خرائط التفاعل في الدورة النووية 12 أنه في الدورة النووية 12، يتم اكتشاف عدد قليل من المجالات المرتبطة بتوبولوجيلي أو TADs التي تتغير بشكل كبير في الـ 13 و14 عندما تكون الـ TADs بارزة بشكل متزايد ويتم استنفاد الاتصالات طويلة المدى غير المبينة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تغسل الخرز جيدا وليس لإطالة أوقات الحضانة دون داع وخاصة في درجات الحرارة العالية لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض جودة مرحبا جيم المكتبات.
هذه التقنية التي تجمع بين التدريج الدقيق ورسم خرائط تأكيد الكروماتين عالية الدقة مهدت الطريق للباحثين في مجال علم الوراثة اللاجينية لاستكشاف دور منظمة الكروماتين ثلاثية الأبعاد في بيئة تنموية في الجسم الحي.
