Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Chromatinarchitektur zu beantworten, z. B. wie die 3D-Struktur von Chromatin die Genexpression und -entwicklung beeinflussen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine hochauflösende Ansicht der Chromatinarchitektur und präzise inszenierter Fliegenembryonen bietet. Obwohl diese Methode Einblicke in die Organisation und Entwicklung von Chromatin geben kann, kann man auch vorhandene Linien aus transgenen Fliegenbibliotheken verwenden, um ihre Wirkung in der Chromatin-Organisation zu testen.
Um das Protokoll zu beginnen, passen Sie das Gesamtvolumen der zuvor gesammelten Embryonen auf zwei Milliliter mit PBST an. Fügen Sie sechs Milliliter Heptan und 100 Mikroliter 37%Formaldehyd in Wasser hinzu. Nach Zugabe von Formaldehyd, kräftig schütteln sie das Rohr nach oben und unten für eine Minute.
Die wässrige und organische Phase wird sich zu einer shampooartigen Konsistenz verbinden. Rühren Sie die Mischung 10 Minuten lang auf einem Drehmischer. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 mal g für eine Minute bei Raumtemperatur, um Embryonen am Boden des Rohres zu sammeln.
Saugen Sie die gesamte Shampoo-ähnliche Flüssigkeit und entsorgen Sie sie, wobei Sie darauf achten, keine Embryonen zu aspirieren. 15 Minuten nach Zugabe von Formaldehyd, setzen Sie die Embryonen in fünf Milliliter PBST mit 125 Millimolar Glycin. Schütteln Sie die Embryonen eine Minute lang kräftig auf und ab.
Nach dem Zentrifugieren den Überstand ansaugen. Mit einer 1.000 Mikroliter Pipette eine Charge von 100 Embryonen auf ein kleines Glasgefäß übertragen, das zum Sortieren geeignet ist, vorzugsweise auf dunklem Hintergrund, und auf Eis legen. Sortieren Sie Embryonen nach Kerndichte und Zellzyklusstatus mit einer Nadel oder Spritzenspitze.
Entfernen Sie alle mitotischen Embryonen, die durch ihre dispergierte, nicht-nukleare Verteilung von EGFP PCNA und Embryonen erkennbar sind, die teilweise ein nicht-nukleares GFP-Signal aufweisen. Um die Sortierung zu unterstützen, richten Sie Referenzembryonen in den Kernzyklen 12, 13 und 14 in jeder Charge auf, um Embryonen mit einem der Referenzembryonen abzugleichen. Pipette die gewünschten Embryonen mit einer 1.000 Mikroliter Pipette.
In eine frische Röhre geben und auf Eis legen. Fahren Sie fort, bis genügend Embryonen für das geplante Experiment sortiert sind. Spin Rohre kurz bei 100 mal g bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie den Überstand und stellen Sie sicher, dass die Embryonen so trocken wie möglich zum Einfrieren sind. Flash gefrieren Embryonen durch Untertauchen der Rohre in flüssigen Stickstoff und speichern bei minus 80 Grad Celsius. Die Rohre mit gefrorenen Embryonen auf Eis legen.
Setzen Sie die Embryonen in 500 Mikrolitere eiskalteLysepuffer aus. Warten Sie eine Minute, damit sich der Embryo am Boden des Rohres absetzen kann. Als nächstes mahlen Sie die Embryonen mit einem Metall-Mikro-Pestle vorgekühlt auf Eis, die entworfen ist, um fest passen eine 1,5 Milliliter Mikrozentrifuge Rohr.
Um zu vermeiden, dass die Embryonen aufgewittelt werden, legen Sie den Stößel langsam ein, bis er den Boden des Rohres berührt. Drücken Sie nach unten und schleifen Sie dann, indem Sie den Stößel zweimal in beide Richtungen drehen. Heben Sie den Stößel sehr leicht an.
Drücken Sie erneut auf den Boden des Rohres und wiederholen Sie den Schleifvorgang 10 Mal oder bis die Embryonen vollständig lysiert sind. Die Lösung sollte homogen sein und keine verbleibenden großen Embryonen bleiben. Die homogenisierte Suspension 15 Minuten auf Eis inkubieren.
Drehen Sie bei 1 000 mal g vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet, indem Sie in 500 Mikroliter eiskalten Lysepuffer und Pipetten nach oben und unten. Nach einer weiteren Drehung, entsorgen Sie den Überstand.
Setzen Sie das gewaschene Pellet in 100 Mikroliter n.Ä. 0,5% Natriumdodecylsulfat oder SDS aus. Dann durchlässigen Sie die Kerne, indem Sie die Probe für 10 Minuten bei 65 Grad Celsius in einem Heizblock inkubieren. Fügen Sie 50 Mikroliter 10%Triton X100 und 120 Mikroliter Wasser hinzu.
Streichen Sie das Rohr, um den Inhalt zu mischen und die Röhre bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten in einem Wärmeblock zu bebrüten. Fügen Sie 25 Mikroliter 10X Restriktionsenzympuffer und 20 Einheiten mit fünf Einheiten pro Mikroliter MBO1 hinzu. Streichen Sie die Röhre, um den Inhalt zu mischen und die Röhre in einem Wärmeblock zu inkubieren, um die DNA zu verdauen.
Fügen Sie weitere 20 Einheiten Von MBO1 hinzu. Setzen Sie die Inkubation für 90 Minuten fort. Nach der zweiten 90-minütigen Inkubation die Probe bei 62 Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren, um das MBO1 inaktiv zu machen.
Als nächstes fügen Sie 18 Mikroliter 0,4 Millimolar Biotin 14-dATP, 2,25 Mikroliter eines unveränderten 3,3 Millimolar dCTP-dGTP-dTTP-Mix und acht Mikroliter mit fünf Einheiten pro Mikroliter DNA-Polymerase I Klenow-Fragment hinzu. Streichen Sie das Rohr, um den Inhalt zu mischen und die Probe bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten zu bebrüten. Als nächstes fügen Sie 657 Mikroliter Wasser, 120 Mikroliter 10X T4 DNA Ligase Puffer, 100 Mikroliter 10%Triton X100, sechs Mikroliter von 20 Milligramm pro Milliliter RinderserumAlbumin und schließlich fünf Mikroliter mit fünf Einheiten pro Mikroliter T4 DNA Ligase hinzu.
Als nächstes drehen Sie das Rohr vorsichtig bei 20 U/min bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Fügen Sie weitere fünf Mikroliter mit fünf Einheiten pro Mikroliter T4 DNA Ligase hinzu. Drehen Sie noch zwei Stunden weiter, dann drehen Sie die Kerne fünf Minuten lang bei 2 500 mal g herunter.
Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen. Setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter Extraktionspuffer aus und fügen Sie 20 Mikroliter von 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K.Flick die Röhre hinzu und inkubieren Sie die Röhre, um das Protein zu verdauen. 130 Mikroliter von fünf Mol-Natriumchlorid hinzufügen und über Nacht zur Entvernetzung inkubieren.
Am nächsten Tag pipette die Probe in eine neue Zwei-Milliliter-Röhre mit niedrigen DNA-Bindungseigenschaften. Fügen Sie 0,1X Volumen von drei Molaren-Natriumacetat und zwei Mikroliter von 15 Milligramm pro Milliliter GlycoBlue. 1,6 Volumen reines absolutes Ethanol hinzufügen und den Inhalt invertieren, dann die Probe bei minus 80 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren.
Zentrifugieren Sie nach der Inkubation den Inhalt. Suchen Sie das DNA-Pellet, das nur vom GlycoBlue entdeckt werden kann. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und bewegen Sie die Pipettenspitze entlang der gegenüberliegenden Wand aus dem DNA-Pellet in das Rohr.
Waschen Sie das Pellet mit 800 Mikrolitern 70%Ethanol. Mischen Sie die Probe, indem Sie sie bei 20.000 mal g bei Raumtemperatur für fünf Minuten invertieren und zentrifugieren. Entfernen Sie die verbleibenden Tröpfchen während dieses Schritts und die folgenden Wäschen, indem Sie sie mit einer P10-Spitze aus den Rohren schieben, und öffnen Sie dann den Deckel, um bis zu fünf Minuten zu trocknen.
Sobald keine Flüssigkeit mehr ist, 50 Mikroliter 10 Millimolar Trischlorid hinzufügen. Immer wieder Pipette die Lösung über den Bereich, wo das Pellet befindet sich, um die DNA zu löslich. Fügen Sie einen Mikroliter von 20 Milligramm pro Milliliter RNase A.Mix durch Streichen der Röhre.
Inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten, um RNA zu verdauen. Schließlich die Probe im Gefrierschrank oder Kühlschrank bis zur Bibliotheksvorbereitung aufbewahren. Bilder des EGFP PCNA-Signals jeder sortierten Embryocharge zeigen präzise Stadium- und Zellzyklusstatus jedes einzelnen Embryos für nachgelagerte Experimente.
Bioanalyzer-Spuren zeigen, dass die Größenverteilung von DNA-Fragmenten nach Größenauswahl zwischen 300 und 700 Basenpaaren mit einem Maximum von etwa 450 Basenpaaren liegt. Hi-C-Interaktionskarten zeigen, dass im Kernzyklus 12 nur wenige topologisch assoziierte Domänen oder TADs erkannt werden, die sich bei den Kernzyklen 13 und 14 dramatisch ändern, wenn TADs immer prominenter werden und unspezifische Langstreckenkontakte erschöpft sind. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Perlen gründlich zu waschen und die Inkubationszeiten nicht unnötig zu verlängern, insbesondere bei hohen Temperaturen, da dies zu qualitativ minderwertigen Hi-C-Bibliotheken führen kann.
Diese Technik, die präzise Inszenierung und hochauflösende Chromatin-Bestätigungskartierung kombiniert, ebnete forschern auf dem Gebiet der Epigenetik den Weg, um die Rolle der dreidimensionalen Chromatin-Organisation in einer In-vivo-Entwicklungsumgebung zu erforschen.
