この方法は、クロマチン構造が遺伝子発現にどのような影響を与えるか、クロマチン組織が転写ダイナミクスをどのように調節するかを示す、遺伝子発現に関する重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この技術を開発した理由は、染色体アーキテクチャを制御的に変化させ、長距離クロマチンループの作成を可能にしたからです。一方、クロマチンコンテキストを逆にして内因性染色体構造を復元する能力を有する。
この方法は、使いやすさと広い適用性のために設計されました。私たちは、システムがより広く使用できるように、非毒性二量体とdcas9の直交種を利用しました。この方法を開発したのは、遺伝子発現が染色体アーキテクチャを受けるかどうか、染色体構造が遺伝子発現の変化につながるのかという長年の鶏と卵の問題に答えることができるようにしたからです。
CRISPRガイドRNA配列の設計および細胞培養の維持は、テキストプロトコルに記載されている。プラスミドマップと利用されたプライマーがそこにリストされている。プラスミド調製を開始し、レンチウイルスCRISPRプラスミドの5マイクログラムを、3マイクロリットルのBsmB1 3マイクロリットルのアルカリホスファターゼ6マイクロリットルの10x消化バッファーと0.6マイクロリットルのDTTの新鮮な100ミリモルを混合することによって、プラスミド調製を開始する。
総体積を60マイクロリットルの二重蒸留水に持ち込み、37°Cで30分間インキュベートし、プラスミドを消化して脱リン酸化します。次いで、ゲルは、ループプラスミドおよび二重蒸留水中の消化プラスミドを精製する。次に、ガイドRNAペアに対するアニーリング反応を調製する。
各ガイドRNAの1マイクロリットルを100マイクロモルで、1マイクロリットルの10x T4ライゲーションバッファー6.5マイクロリットルの二重蒸留水と0.5マイクロリットルのT4 PNKを組み合わせて、合計10マイクロリットルの反応量を得ます。ガイドRNAペアを標的配列にアニールするには、30分で摂氏37度で混合物をインキュベートし、続いて摂氏95度で5分間インキュベーションし、毎分5度ずつ摂氏5度下げることで徐々に温度を25度に下げます。次に、アニールガイドRNAを二重蒸留水で1〜200で希釈します。
次に、2つのライゲーション反応を調製します。消化したプラスミドの1マイクロリットルを0.5マイクロリットルの希釈されたペリバニアガイドRNAse 2.5マイクロリットルの2xライゲーションバッファー1マイクロリットルの二重蒸留水と0.5マイクロリットルのリガーゼと混合する。反応を室温で10分間インキュベートし、BsmB1消化プラスミドをガイドにリゲートします。
次に、新たに合体したプラスミドを安定な3つの細菌に変換し、任意のプラスミド調製方法を使用して細菌を増幅する。6ウェルプレートでは、10%FBSと1%ペンストレップを備えたDMEMの種子750、000 2n3 Tcells。各構成物に1つの井戸を使用し、24時間細胞をインキュベートします。
翌日、培地を10%FBSでフレッシュな抗生物質フリーDMEMに変更します。メッキされた細胞の各ウェルのための媒体を変更した直後にレンチウイルス産生混合物のチューブを準備する。各反応につき、11マイクロリットルの脂質基トランスフェクション試薬を、各反応に対して150マイクロリットルのOpti-MEM培地で希釈する。
次に、別々のチューブでDNAを調製する。CLOud9レンチウイルスベクタープラスミドの2マイクログラムを、他のレンチウイルス包装成分の2マイクログラムと組み合わせます。この混合物をオプティ-MEM培地の150マイクロリットルで希釈します。
次に、希釈された脂質ベースのトランスフェクション試薬で希釈レンチウイルスプラスミド混合物の等量を組み合わせ、室温で5分間インキュベートします。次に、細胞の各ウェルに、調製した混合物の1つのチューブを追加し、インキュベーションを継続する。48時間後、プレート井戸から円錐形にウイルス産生媒体を移し、300gで5分間回転させる。
その後、ペレット化された破片を廃棄するために新鮮なチューブに上清を転送します。今、すぐにターゲット細胞を変換したり、将来の使用のために摂氏80度でそれを凍結するためにウイルス産生培地を使用しています。目的の各ウイルス構造の250マイクロリットルを追加することから始め、この場合、80,000細胞を含む50ミリリットルの円錐管に相補CLOud9プラスミドで構成される。
次に、溶液中のミリリットル当たり1〜8マイクログラムの間になるように十分なポリブレンを加えます。次に、抗生物質を含まない培地を用いて、各チューブの総体積を1ミリリットルに調整します。ウイルス粒子と細胞との接触を増加させると、室温で30分間800gで細胞を回転させる。
次に、ピペット処理により上清で細胞を再懸濁する。次に、細胞の懸濁液を培養プレートにロードし、24時間インキュベートします。翌日、細胞を収集します。
室温で5分間300gで遠心分離し、通常の培地で再中断します。翌日、ピューロマイシンとハイグロマイシンを培地に添加し、二重に細胞を導入します。抗生物質の適切な濃度は、各細胞の種類のために事前に決定する必要があります.
次いで、下流の適用を進める前に少なくとも3日間、選択培地中の細胞をインキュベートし、細胞および選択培地を維持し続ける。選択した細胞およびトランスデューチされた細胞を二量体化するために、培養皿に1ミリモルABAを加える。コントロールの場合は、DMSO を追加し、実験の間、ABA または DMSO でセルを維持します。
二量体化を逆にするには、プレートの表面を2回覆うのに十分なPBSで細胞を洗います。その後、ABAフリー培地中の培養細胞は、それらを未二量化状態に維持する。CLOud9系の適切な使用は、細胞培養培地へのABAの添加または除去を通じて、相補的なCSAおよびCSP CLOud9コンストラクトの可逆的接触を誘発する。
CSAおよびCSPの構成体は標準的なCRISPRガイドRNAAseを使用して適切なゲノム領域に局在する。クロマチン免疫沈降後に定量PCRを使用し、各CLOud9成分を標的化する際に正確な局在化を確実に行った。さらに、ABAの有無にかかわらず共免疫沈殿は、リガンドの存在下でCSAおよびCSP二量体化を検証し、同様にリガンドの不在時の可逆性を検証した。
ABA二量体化後、β-グロビンとLCRとの間のより大きな接触を染色体確認捕捉によって測定した。しかし、これは CSA のみを含むコントロールまたは CSP コンストラクトのみで見られなかった。LCR β-グロビン相互作用を作成しても、内因性LCRグロビン接触を完全に排除したわけではない。
元の連絡先にのみ追加されます。β-グロビンLCR接触における増加は、標的LCRまたはβ-グロビンプロモーター領域内の正確な領域に関係なく72時間の二量化を通じて観察された。最後に、ABAを取り外した後の染色体確認キャプチャでシステムの可逆性を確認した。
これは、内因性の確認の完全な更新をもたらしました.この手順を試みる間、メディアを変更し、新鮮な二量体CLOud9トランスデューシス細胞を毎日追加することを覚えておくことが重要です。レンチウイルスの使用は非常に危険であり、BSL 2で使用されるすべての予防措置は、常にこの手順を実行するときに取られる必要があります忘れないでください。
