この作品は一部で、スタートアップ資金援助によって支えシンシナティ小児研究財団 (CCRF) から m. n.、革新的なコア付与 (ICG) の下で健康の国民の協会の進めるトランスレーショナル科学センターでサポートされています。受賞番号 UL1 TR001425。 内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

プロトコルをまとめた図は、図 1を参照してください。
1. バキュロ ウイルス プラスミド DNA の精製
<ol><li>流体培養基 LB の抗生物質; での 200 mL の baculoviral プラスミド DNA (バクミド)14を含む細菌文化を成長します。カナマイシン (50 μ G/ml)、テトラサイクリン (10 μ G/ml)、ゲンタマイシン (7 μ g/mL)、300 rpm で軌道シェーカー設定 37 ° C で 16 時間。</li>
	<li>標準散プロトコル15を使用して細菌文化からバクミド DNA を浄化し、TE バッファーでバクミドを溶解します。</li>
</ol>2. バキュロ ウイルスの生産
<ol><li>135 rpm、ポリカーボネート昆虫無血清培1,2,3を含む三角フラスコで 28 ° C で軌道シェーカー インキュベーターで培養 Sf9 細胞。 注:Sf9 細胞が凍結ストックからフリーズ解除、回復し、成長指数段階を入力するセルのために少なくとも二週間を許可します。</li>
	<li>トリパン ブルー染色後の診断と成長指数段階で収穫した Sf9 細胞を数えます。種子 1 x 106 Sf9 細胞培地 2 mL に 6 ウェル培養処理プレートのウェルあたり。インキュベーターで 28 ° C で 1 時間付けるセルを許可します。</li>
	<li>成長培地を無血清培グレースの昆虫培養液 1 mL に置き換えます。</li>
	<li>昆虫の細胞のトランスフェクション試薬を用いた Sf9 細胞に DNA バクミドを transfect します。<ol>
<li>ミックス 8 μ L 昆虫の細胞のトランスフェクション試薬グレースの昆虫媒体の 100 μ L で。</li>
		<li>希釈培昆虫媒体の 100 μ L に DNA バクミドの 2 μ g、ボルテックスで軽く混ぜます。</li>
		<li>希釈昆虫細胞のトランスフェクション試薬を希釈した DNA を組み合わせて、軽く混ぜます。室温で 15 〜 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>セル上に滴下し DNA 脂質混合物を追加します。28 ° c 約 5 h のインキュベーターで孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞からトランスフェクション混合物を削除し、2 ml の PBS のセルを洗浄します。</li>
	<li>昆虫培養液 2 mL を追加し、インキュベーターで 28 ° C で、文化メディアを変更せずに続行します。 注:バクミドには蛍光タンパク質が含まれています、その式がセル 48 時間後トランスフェクションで検出できます。バキュロ ウイルスは transfected Sf9 細胞によって生成され、その後融合細胞を感染する培養液に分泌されます。セル全体人口は、5 日間でバキュロ ウイルス感染し、細胞変性効果とも呼ばれます、ウイルス感染の兆候を示しています。細胞直径が含まれます、細胞質、細胞増殖の停止と死亡または分離細胞の液胞/顆粒が細胞培養の存在。ただし、トランスフェクションや感染効率が最適ではない、文化がない明らかな細胞変性効果が表示されます。200-400 倍の倍率で倒立位相差顕微鏡で細胞変性効果を視覚化できます。バキュロ ウイルス感染細胞は、抗 gp64 抗体11との汚損によって検出できます。</li>
	<li>収穫バキュロ ウイルス上清 5 日トランスフェクションとラベル後 P1ウイルス ストックとして。</li>
	<li>PBS、バキュロ ウイルス上清、0.5% ウシ血清アルブミン (BSA) で暗闇の中、光に敏感であるに格納します。短期 (90 日まで) のための 4 ° c または長期的には-80 ° C で保存します。</li>
	<li>昆虫培養培地 10 mL に 10 cm 培養処理板のシード 6 × 106 Sf9 細胞。セルに初期バキュロ ウイルス上清 (1P) の 1 つの mL を追加します。</li>
	<li>バキュロ ウイルス上清 (P2) 5th日後感染症での収穫します。</li>
	<li>シード 50 mL 三角フラスコ 250 mL ポリカーボネートで昆虫培地の培養における Sf9 細胞 (3 x 106セル/mL) と軌道シェーカー インキュベーターでフラスコの場所。セルに P2株式の 2 mL を追加し、28 ° c. の一定した温度を維持しながら 135 回転で振る 注:感染後 3 〜 4 日 Sf9 細胞母集団高価バキュロ ウイルス生産の指標である細胞変性効果が表示されます。</li>
	<li>音量 (P3P4、...) を取得するまで、順番にバキュロ ウイルス上清を増幅する各後続の感染における細胞培養の 50 のボリュームを 10 増。 注:P3は感染 Sf9 の 1 l、500 mL の細胞培養は、P2バキュロ ウイルス上清; の 10 〜 20 mL に感染することのラウンド 3rdP4は感染 Sf9 のどの 5 ~ 10 L の細胞培養は、P3バキュロ ウイルス上清の 100 に 200 mL に感染することのラウンド 4thです。通常、ml 昆虫無血清培地で/3 × 106細胞 Sf9 細胞がシードされます。</li>
	<li>バキュロ ウイルス細胞の残骸を削除し、ゲノム DNA および RNA を消化する 37 ° C で 2 h の 50 単位/ml ヌクレアーゼ (250 単位/μ L の株式) と清のバキュロ ウイルスの治療に 4 ° C で 30 分間 1,000 x g で上清を遠心します。0.45 μ m のろ過ユニットを介して培養上清をフィルター処理します。</li>
</ol>3. クロマトグラフィー システムの準備
<ol><li>順番に、サンプルとバッファー ライン各滅菌水、1 N 水酸化ナトリウム、水の洗浄によってクロマトグラフィー システムを準備し、線形流量 50 mL/分で洗浄バッファー (含む 150 mM 20 mM リン酸ナトリウム塩化ナトリウム バッファー、pH 7.0)。</li>
	<li>カラムの洗浄バッファー (5 CV 滅菌 20 mM リン酸ナトリウム バッファー含む 2 M の塩化ナトリウム、pH 7.0) を順番に実行して、ヘパリン 50 μ m 列 (10 × 10 cm、7.9 mL 列ボリューム (CV)) を準備および線形流量 7 mL/min で 5 CV 洗浄バッファー。</li>
</ol>バキュロ ウイルスをベクターの清浄化
<ol><li>クロマトグラフィー システムをとおり設定します。<ol>
<li>バキュロ ウイルス上清をロードするための入口ポートを読み込むサンプルを使用します。</li>
		<li>洗浄バッファーの読み込みバッファーの入口ポート A1 を使用します。洗浄バッファーの少なくとも 500 ml のボトルを準備し、瓶の中に洗浄バッファーの行を配置します。</li>
		<li>溶出バッファー (1.5 M の塩化ナトリウム、pH 8.0 で 20 mM リン酸ナトリウム) を読み込むためのバッファー入口ポート A2 を使用します。溶出バッファーの少なくとも 500 mL の瓶を準備し、瓶の中に溶出バッファーの行を配置します。</li>
		<li>列パススルー バキュロ ウイルス上清を収集する一部のコレクター、洗浄バッファー、および溶出バキュロ ウイルスいくつかの 50 mL の円錐管に挿入します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>洗浄バッファー (40 mL) 線形流量 7.0 mL/分での 5 つの 7.9 mL 列ボリューム (CVs) とヘパリン コラムを平衡させ。</li>
	<li>バキュロ ウイルス上清 2.0 mL/min の線形流量でクロマトグラフィー システムのサンプル ポンプ (入口サンプル ポート) を使用して、ヘパリン列に 250 mL をロードします。</li>
	<li>紫外線 (UV) 吸光度曲線になるまで洗浄バッファーの線形 2.0 mL/min の流量でヘパリン列を介して 10 CVs (80 mL) を実行 (280 nm) がベースラインに戻ったなり安定します。</li>
	<li>ヘパリン列からバキュロ ウイルス粒子を切り離して考えるとき線形流量 4.0 mL/分時計タンパク質クロマト グラム上のシャープな溶出ピークで溶出バッファーの 5 CVs (40 mL) を持つ 7.9 mL ヘパリン列からバキュロ ウイルス粒子を溶出します。</li>
	<li>後の溶出、すぐに 10 倍その後遠心分離中に浸透衝撃からバキュロ ウイルス粒子の不活性化を防ぐために水に 20 mM リン酸ナトリウム緩衝を使用して溶出バキュロ ウイルス上清を希釈します。</li>
	<li>各分画の 100 μ L をストアは、バキュロ ウイルス上清、洗浄バッファー、および溶出液の読み込み中に収集された列の通過など。HT1080 浄化プロセス (セクション 6 を参照) を評価するためにこれらのバキュロ ウイルスの分数に感染します。</li>
	<li>カラムの洗浄バッファーと洗浄バッファーで列をきれいに。最後に、線形 7.0 mL/分の流量で 5 CV 滅菌 20% エタノール水で列を洗い、4 ° C で保存</li>
	<li>水、1 N 水酸化ナトリウムを水と再び 20% エタノール水 50.0 mL/min の線流速とクロマトグラフィー システムをきれいにし、20% エタノールでシステムを格納します。</li>
</ol>5. バキュロ ウイルスの濃度
<ol><li>オートクレーブを用いた遠心管を消毒済み。ティッシュ文化フードの各遠心チューブにバキュロ ウイルス上清の等しいボリュームを追加します。バランス チューブの重量を測定し、滅菌 PBS で遠心管の内容の重さを調整します。</li>
	<li>SW 32 Ti ローターのバケツを反対に超遠心機チューブのそれぞれを配置します。</li>
	<li>80,000 × g で、超遠心機を実行4 ° C で 90 分</li>
	<li>ティッシュ文化フードの遠心管を開き、無菌バキュロ ウイルス ペレットを削除せず、液体を吸引します。</li>
	<li>積極的に上下に 200 μ L 0.5% (w/巻) BSA を含む PBS でピペッティングによる各チューブのペレットを再懸濁します。</li>
	<li>クリオバイアル (バイアルあたり 50 に 100 μ L) に集中バキュロ ウイルスを転送し、-80 ° C で保存</li>
</ol>6. バキュロ ウイルスの滴定
<ol><li>感染、前日は、トリパン ブルーとセルを青色に染色後、検定を用いた HT1080 細胞をカウントします。2 ml のダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) を含む 6 ウェル プレートのウェルあたりの種子 1 x 105 HT1080 細胞。種子いくつか追加井戸細胞感染の時に存在の正確な数を決定することができます。37 ° C、5% CO2でインキュベーターで培養します。 注:HT1080 細胞は、他のセル行16と比較するとヘパラン硫酸のより高いレベルを表現しており、滴定に使用されます。HT1080 細胞が付着、滴定はより簡単なより伝統的な Sf9 による滴定を使用する場合に比べて時間がかかる。</li>
	<li>感染症の日に井戸からセルをカウントすることによってウェルあたりの細胞数を決定します。設定されていた脇カラム精製前とサンプル列の流れを通じて、洗浄、および溶出画分から、希薄化後の元バキュロ ウイルスを追加することによって、細胞に感染します。各サンプルの希釈と経験的バキュロ ウイルス感染粒子に基づいてボリュームを決定し、3 通の各ウェルに感染します。</li>
	<li>感染後 2 日間は、興味の遺伝子の表現のための細胞を分析します。細胞を蛍光蛋白質 (例えばGFP)17を表する場合流れの cytometer を使用して分析できます。</li>
	<li>細胞感染、希釈倍率、数式を使用してセルの蛍光蛋白質の割合の時に存在の数に基づいて価 (1 mL あたり感染単位) を計算: (蛍光タンパク質の感染 × 割合の中にセルの数陽性細胞 × 希釈倍率)/mL でバキュロ ウイルスのボリューム。 注:たとえば、感染症の時もあたりのセル数の合計が 1.2 × 105、蛍光タンパク質の割合は 5%、希釈倍率は 100、追加希薄バキュロ ウイルスの量は 10 μ L、力価は 6 × 107感染単位 (IU)/mL です。</li>
</ol>

<ol>
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著者は利益相反を宣言しません。

ここで提示されたプロトコルでは、Sf9 細胞懸濁培養におけるバキュロ ウイルスの生産とヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いたバキュロ ウイルスの精製をについて説明します。このプロトコルで使用されるパラメーターは収量を最大化し、感染バキュロ ウイルスの不活性化を最小限に抑えます。ここで提供されるプロトコルは、9他の人が達成したバキュロ ウイルス?...

バキュロ ウイルスは主に組換えタンパク質とチョウ目ハスモンヨトウ fugiperda (Sf) 9 でワクチンの生産の使用組換えハイブリッドバキュロとmulticapsid の核多角体病ウイルス (AcMNPV) を用いた昆虫細胞1,2,3,4. もっと最近、遺伝子療法アプリケーション5の有望なベクトルとして浮上しています。幅広いホストおよび組織の親和性を持っている知られているし、静止して増殖細胞に感染して、非病原性はホスト染色体4,5,6には統合されていません。また、スケーラブルでありクローズド システムの将来の臨床生産1の処理は、無血清浮遊培養でバキュロ ウイルスを生成できます。
バキュロ ウイルス粒子の純度は細胞毒性7,8,9を最小限に抑えながら効果的な伝達を達成するために重要です。バキュロ ウイルスは、遠心または接線流ろ過 (TFF) 伝染性の影響は限定的で集中することができます。しかし、これらの手順だけでなくウイルス粒子を集中、また細胞の残骸と Sf9 から蛋白質文化、毒性の in vitro (個人的な観察) できるし、炎症や使用する免疫反応を引き起こす可能性があります生体内で。ウイルス株を集中して高度な場合は特に、これを避けるため、バキュロ ウイルス感染を精製し、粒子を汚染から分離する必要があります。
いくつかの方法は、バキュロ ウイルスのベクトル10、11,12の濃縮精製に報告されています。使用可能なアプローチのヘパリン アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーは低濃度タンパク質12を汚染の浄化のシングル ステップの高レベルのことができます。メソッドは、バキュロ ウイルス13,14の受容体としてのヘパラン硫酸の同定に基づいています。列とバキュロ ウイルスのバインディングに Sf9 細胞上清をロードした後列は非連結またはゆるく縛られた汚染粒子を除去する生理学的な (等張性) バッファーで洗浄できます。ヘパリンへのバインドはリバーシブルなのでバキュロ ウイルス粒子は不活性化を防ぐために生理学的 (等張性) 塩濃度に希釈はしてすぐに浸透衝撃12高 salt のバッファーで溶出することができます。また、上のキャプチャと同様に、バキュロ ウイルスの生産とクロマトグラフィー カラムからの溶出実行できます現在の優れた製造基準 (cGMP) に互換性のあるクローズド システム プロセスを使用しています。
ここでは、製造、精製、およびアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーおよび遠心分離を用いた感染バキュロ ウイルスの濃度の詳細なプロトコルを提供します。簡単に言えば、付着性文化のバキュロ ウイルス プラスミッド DNA と Sf9 細胞のトランスフェクションによってバキュロ ウイルスを制作・無血清培養で感染バキュロ ウイルスをさらに拡大します。我々 はヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いたバキュロ ウイルスを浄化し、高い遺伝子治療用ベクターを集中する最後のステップとして遠心を使用します。

<table><tbody><tr><td>Akta Avant 150</td><td>GE Healthcare</td><td>28976337</td><td>Chromatography system</td></tr><tr><td>POROS Heparin 50 &amp;micro;m Column</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4333414</td><td>Heparin column</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Non-catalog item</td><td>Concentrates virus at high-speed</td></tr><tr><td>Polyallomer Ultracentrifuge tube</td><td>Beckman-Coulter</td><td>326823</td><td>Concentrates virus at high-speed</td></tr><tr><td>MaxQ 8000 orbital shaker incubator&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Non-catalog item</td><td>Shaker for suspension culture</td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer flasks</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238071</td><td>Flask for suspension culture</td></tr><tr><td>1 L Erlenmeyer flasks</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>238072</td><td>Flask for suspension culture</td></tr><tr><td>Microscope (Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>Non-catalog item</td><td>Cell monitoring and counting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Table top centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>For clarification of Baculovirus supernatant</td></tr><tr><td>50 ml Conical tube</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td>For collection of Baculovirus supernatant</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-200-80</td><td>Tissue culture treated plate</td></tr><tr><td>10-cm plate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-772E</td><td>Tissue culture treated plate</td></tr><tr><td>Stericup-HV, 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m, PVDF</td><td>EMD-Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td>Filtration unit</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15160-054</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac Vector Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10360-014</td><td>Baculovirus expression system</td></tr><tr><td>DH10B-T1R&amp;nbsp; Competent cell</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12331-013</td><td>Competent cell for bacmid</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>In-house</td><td>Non-catalog item</td><td>10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.</td></tr><tr><td>Plasmid Maxiprep kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K2100-06</td><td>For bacmid purification</td></tr><tr><td>Sf9 Cells</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11496-015</td><td>Insect cells</td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s Insect Cell Culture Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11605-094</td><td>Transfection medium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20012227</td><td>Washing cells, diluting samples</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect cell media</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30278.02</td><td>Serum-free insect cell growth medium</td></tr><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td></tr><tr><td>Baculovirus plasmid (bacmid) DNA</td><td>In-house</td><td>Non-catalog item</td><td>Bacmid for Baculovirus Production</td></tr><tr><td>Cellfectin II&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10362</td><td>Transfection reagent for insect cells</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>Stabilizes Baculovirus</td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thomas Scientific</td><td>1222C24</td><td>For storage of Baculovirus</td></tr><tr><td>HT1080 cell line</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>Fibroblast cell line</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>Growth media for cell lines</td></tr><tr><td>Wash buffer</td><td>In-house</td><td>Non-catalog item</td><td>20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride</td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td>In-house</td><td>Non-catalog item</td><td>20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride</td></tr><tr><td>Column cleaning buffer</td><td>In-house</td><td>Non-catalog item</td><td>20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride</td></tr><tr><td>Sterile water</td><td>In-house</td><td>Non-catalog item</td><td>For Akta Avant cleaning</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.09137</td><td>For Akta Avant cleaning</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7073</td><td>For Akta Avant cleaning</td></tr></tbody></table>

production and purification of baculovirus for gene therapy application

バキュロ ウイルスは、組換えタンパク質、ワクチンの生産のため伝統的に使用されています。しかし、最近では、バキュロ ウイルスは遺伝子治療応用のための有望なベクトルとして現れています。ここでは、バキュロ ウイルス バキュロ ウイルス プラスミド DNA (バクミド) のトランスフェクション Sf9 細胞の付着性文化で生産されています。バキュロ ウイルスは、希望の音量が得られるまでその後 Sf9 細胞の無血清培養に拡張されます。それは、ヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いた培養上清の文化から精製します。ウイルス上清は、バキュロ ウイルスのエンベロープ糖蛋白のヘパリンの親和性により上澄みでバキュロ ウイルス粒子を結合するヘパリンの列に読み込まれます。列は汚染物質を除去するためのバッファーで洗浄、バキュロ ウイルスは高塩バッファーを持つ列から溶離されます。溶出液が等張液の塩濃度に希釈され、バキュロ ウイルス粒子がさらに遠心を使用して集中しています。このメソッドを使用して、バキュロ ウイルス感染粒子の 25% 回復を 500-fold まで集中してすることができます。ただし、ここで説明されているプロトコルは、1 L までの文化から生産と精製、バキュロ ウイルスを示します、メソッドできますがスケール アップ遺伝子治療応用のための臨床グレードのベクトル生成閉鎖系の培養における。

提示されたプロトコルは、フロー図 (図 1)。手順にはバクミド板の付着性文化、無血清培養、ヌクレアーゼ治療、遠心分離と濾過によって明確化以降の増幅でバキュロ ウイルスを生成する DNA と Sf9 細胞のトランスフェクションが含まれます超遠心法による濃度がヘパリン親和性クロマトグラフィーによる浄化が続きます。
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Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

生産およびバキュロ ウイルスの遺伝子治療応用のための浄化

このプロトコルでバキュロ ウイルスは Sf9 細胞にトランスフェクション バキュロ ウイルス プラスミドのプロデュース、無血清培養で増幅されます。上清はヘパリン親和性クロマトグラフィーによる精製、超遠心法でさらに集中しています。このプロトコルは、生産およびバキュロ ウイルス遺伝子治療応用のための浄化に役立ちます。

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

production-purification-baculovirus-for-gene-therapy

Research

JoVE Journal

Genetics

14.6K ビュー.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. このプロトコルでバキュロ ウイルスは Sf9 細胞にトランスフェクション バキュロ ウイルス プラスミドのプロデュース、無血清培養で増幅されます。上清はヘパリン親和性クロマトグラフィーによる精製、超遠心法でさらに集中しています。このプロトコルは、生産およびバキュロ ウイルス遺伝子治療応用のための浄化に役立ちます。

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Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell culture system. This system was developed to express foreign genes under the control of the baculoviral promoter in transient expression plasmids. Furthermore, this system can be applied to a functional assay of either the baculovirus itself or foreign proteins. The most widely and commercially available transient gene expression system is developed based on the immediate-early gene (IE) promoter of Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). However, a low expression level of foreign genes in insect cells was observed. Therefore, a transient gene expression system was constructed for improving protein expression. In this system, recombinant plasmids were constructed to contain the target sequence under the control of the Drosophila heat shock 70 (Dhsp70) promoter. This protocol presents the application of this heat shock-based pDHsp/V5-His (V5 epitope with 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cell (sf9 cell) system; this system is available not only for gene expression but also for evaluating the anti-apoptotic activity of candidate proteins in insect cells. Furthermore, this system can be either transfected with one recombinant plasmid or co-transfected two potentially functionally antagonistic recombinant plasmids in insect cells. The protocol demonstrates the efficiency of this system and provides a practical case of this technique.

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

This protocol describes a heat shock-induced protein expression system (pDHsp/V5-His/sf9 cell system), which can be used for either expressing foreign proteins or evaluating the anti-apoptotic activity of potential foreign proteins and their truncated amino acids in insect cells.

昆虫細胞 (sf9) 蛋白質機能の試金のための外国遺伝子の一過性発現

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

遺伝学

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

生化学

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The baculovirus-mediated insect cell expression system is one of the systems used to express recombinant eukaryotic secretory proteins with some post-translational modifications. The secretory proteins need to be routed through the secretory pathways for protein glycosylation, disulfide bonds formation, and other post-translational modifications. To improve the existing insect cell expression of secretory plant proteins, a baculovirus expression vector is modified by the addition of either a GP67 or a hemolin signal peptide sequence between the promoter and multiple-cloning sites. This newly designed modified vector system successfully produced a high yield of soluble recombinant secreted plant receptor proteins of Arabidopsis thaliana. Two of the expressed plant proteins, the extracellular domains of Arabidopsis TDR and PRK3 plasma membrane receptors, were crystallized for X-ray crystallographic studies. The modified vector system is an improved tool that can potentially be used for the expression of recombinant secretory proteins in the animal kingdom as well.

Here, we present the protocols for utilizing the insect cell and baculovirus protein expression system to produce large quantities of plant secreted proteins for protein crystallization. A baculovirus expression vector has been modified with either GP67 or insect hemolin signal peptide for plant protein secretion expression in insect cells.

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. PRMTs can either mono- or dimethylate arginine guanidino groups symmetrically or asymmetrically. The enzymology of these proteins is a complex and intensely investigated area that requires milligram quantities of high-quality recombinant protein. The baculovirus expression vector system (BEVS) employing Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) and Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insect cells has been used for expression screening and production of many PRMTs, including PRMT 1, 2, and 4 through 9. To simultaneously screen for the expression of multiple constructs of these proteins, including domains and truncated fragments as well as the full-length proteins, we have applied scalable methods utilizing adjustable and programmable multichannel pipettes, combined with 24- and 96-well plates and blocks. Overall, these method adjustments enabled a large-scale generation of bacmid DNA, recombinant viruses, and protein expression screening. Using culture vessels with a high-fill volume of Sf9 cell suspension helped to overcome space limitations in the production pipeline for single batch large-scale protein production. Here, we describe detailed protocols for the efficient and cost-effective expression of functional PRMTs for biochemical, biophysical, and structural studies.

The baculovirus expression vector system (BEVS) is a robust platform for expression screening and production of protein arginine methyltransferases (PRMTs) to be used for biochemical, biophysical, and structural studies. Milligram quantities of material can be produced for the majority of PRMTs and other proteins of interest requiring a eukaryotic expression platform.

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

溶質キャリアトランスポーターの発現および精製戦略

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

著者スポットライト:コドン最適化遺伝子を用いたヒト溶質キャリアトランスポーターの発現と精製 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

生物学

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

生産およびバキュロウイルスの遺伝子治療応用のための浄化

要約

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昆虫細胞 (sf9) 蛋白質機能の試金のための外国遺伝子の一過性発現

哺乳類 Bestrophin イオンチャネルの発現と精製

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロウイルス発現ベクターを変更します。

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

生産およびバキュロ ウイルスの遺伝子治療応用のための浄化

要約

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昆虫細胞 (sf9) 蛋白質機能の試金のための外国遺伝子の一過性発現

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

生産およびバキュロウイルスの遺伝子治療応用のための浄化

哺乳類 Bestrophin イオンチャネルの発現と精製

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロウイルス発現ベクターを変更します。