このプロトコルの全体的な目的は、大規模な生産におけるタンパク質アルギニンメチルトランスワサーゼの複数の構築物の発現スクリーニングであり、培地での生化学的、生物理学的、および構造研究のためのタンパク質のミリグラム量を得るために、発現プラットフォームS、バキュロウイルス発現ベクター系のカバレッジにおけるコスト効率の高いモードである。アルマ・セイトヴァ博士は以下のステップを紹介します。指数関数的に増殖するSF9細胞を無血清昆虫培地で1mil当たり0.4百万の最終的な細胞密度に希釈し、滅菌試薬貯留槽に注ぎます。
プログラム可能なマルチチャンネルピペットを使用して、希釈されたSF9細胞の0.5ミルを24ウェルプレートの各ウェルに播種します。このボリュームは、井戸の作業面のカバレッジを確保するのに十分です。同時に、トランスフェクションミックスをあまり希釈しすぎないようにして、トランスフェクション効率を可能にします。
プレートのウェルを細胞のみとしてラベル付けし、トランスフェクトされた細胞と非トランスフェクトされた細胞の比較のためのコントロールとして使用して、感染の潜在的な兆候を評価する。必要になるまでプレートを27度、約1時間でインキュベートし、細胞を細胞培養プレートに付着させます。無添加の昆虫培地と滅菌試薬の貯蔵槽に十分に混合されたトランスフェクション試薬を薄め、10秒間やさしく混ぜます。
12チャネルピペットを使用して、希釈されたトランザクション試薬の102マイクロリットルを滅菌96マイクロウェルプレートに移します。組み換えバクミドDNAのマイクロリットル当たり0.2マイクログラムの10マイクロリットルを96ウェルマイクロウェルプレートの対応するウェルに移し、側面からプレートをタップして穏やかに振って混ぜます。トランスフェクションミックスを15~20分間インキュベートし、複雑な形成を行います。
96と24ウェルプレート間の移動のために設計された調整可能な6チャンネルピペットを使用して、トランスフェクションミックスをトランスフェクションプレートの対応するウェルのドロップワイズにトランスフェクションミックスを重ね、27度で4時間インキュベートします。トランスフェクションミックスが細胞の単層に均等に分配されるように、インキュベーション時間中にプレートを数回ゆっくりと前後に揺らします。トランスフェクション時間の4~5時間後に、1.5ミルの無血清昆虫培地を加えます。
熱不活性化牛血清の10%末端と1%の抗生物質と抗ミヒコティックでそれを補う。27度インキュベーターで細胞を72〜96時間インキュベートする。可能な場合は、トランスフェクションプレートを1日1回軽く揺らします。
トランスフェクション後72~96時間のトランスフェクト細胞に明らかな感染の兆候を探します。トランスフェクションの4~5日後、転化した顕微鏡下でのコントロール細胞と比較して感染の兆候が明らかとなり、細胞培養培地に分泌される最初の組換えバキュロウイルスを収集する準備が整う必要があります。プログラム可能な電子マルチチャネルを使用して、P1ウイルスの収集、P1ウイルスの150マイクロリットルを有する24ウェルブロック内の懸濁細胞の感染における新種SF9細胞の感染を同時に可能にする。
一括P1ウイルス株の残りの部分を15分間スピンダウンし、感染したSF9細胞の懸濁液培養で24ウェルブロックをAirPoaシートで覆います。24 ウェル ブロックを 27 度でインキュベートし、245 RPM で 72 ~ 96 時間振動します。予定生産時間の4日前に、指数関数的に成長するSF9細胞を、1ミルあたり200万個の最終細胞密度で、1%末端の抗生物質および抗ミコティックを含む血清フリー昆虫培地のバッフルを含むバッフルを持つエルレンマイヤーガラスシェイクフロスに分割した。
このステップは、産生バッチ中の新しい細胞の感染のために上清中の感染した昆虫細胞およびP2ウイルスの懸濁培養を生成する。対応するP2ウイルスを追加し、細胞増殖を遅くするために25度の低い温度で感染細胞をインキュベートし、1インチのストロークで軌道シェーカー上の165 RPMで揺れます。予定生産時間の4日前に、昆虫血清フリー培地中のSF9細胞を2.8リットルのフェルンバッハシェイクフラスコで1ミル当たり100万個の細胞密度に指数関数的に増殖させるSF9細胞の種子2リットル。
150 RPMで揺れでフラスコを27度で振る。研究科学者アシュリー・ハッチンソンは次のプロトコルを実証します。指数関数的に成長するSF9細胞と昆虫血清フリー培地の4リットルを、1ミル当たり400万個の最終的な細胞密度に分割し、5リットル試薬ボトルを大量に使用します。
感染したバキュロウイルスの懸濁液培養液を10~12ミルに加える。SF9細胞の感染培養物をシェーカーにインキュベートし、摂氏25度の低温で145RPMを72〜96時間振り出す。SF9細胞におけるバキュロウイルス即時産生におけるPRMTファミリーから発現するいくつかの組換えタンパク質のミリグラム量は、図5に見られるように生化学的生化学的な生物学的教育研究に使用される。
SGCでは、結晶構造をタンパク質データバンクに全長または切り捨てられた形態のタンパク質PRMT4、6、7、および9に対して、様々な化学プローブおよび阻害剤を用いて解いた。これらのPRMTに対する発現プラスミドは、SGCによって遺伝子収集を加えるために堆積し、研究コミュニティに利用可能である。このビデオでは、バキュロウイルス発現系における大規模な生産におけるタンパク質アルギニンメチルトランスレシナーゼの複数の構成体の遠征スクリーニングを成功させるための重要な要素を強調しました。
定期的に調整可能でプログラム可能なマルチチャンネルピペットを使用することで、プロセス全体が効率的よりも迅速になりました。細胞に対して高性能かつ少ない細胞毒性の使用は、組換えウイルスの生成のためのトランスフェクション試薬は、よりコスト効率の高い、そしてこの細胞処理トランスフェクションプロトコルにつながった。6細胞に感染したバキュロウイルスの懸濁培養によるタンパク質産生のための大規模バッチの感染は、重要なスターター増幅における時間のかかるステップにおける労働を大幅に減少させた。
例えば、感染細胞の特殊培養でこれを遠心分離する。それはもちろん、ウイルスの分解の厳しい中で避けるために感染細胞の余分な取り扱いを除外しました。このスケールアップでの培養細胞維持を培養容器内でのサスペンション培養細胞維持は、生産量の限界を克服し、大規模なプラットフォームを採用するのに役立つ高い分野容積であった。
これは、バイオリアクターへのアクセスや生産パイプラインの限られたスペースを持たないラボに非常に便利です。我々のプロトコルは、タンパク質アルギニンメチルトランスレーゼファミリーのタンパク質について説明されているが、同じアプローチは、生化学的生化学的指導研究のために十分な量のタンパク質を得るために発現プラットフォームを必要とする他のタンパク質ファミリーに適用することができる。
