Name: expression and purification of mammalian bestrophin ion channels
Uploaded: 2018-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels at JoVE.com

このプロジェクトは、立ち上げ資金のためのロチェスターの大学、GM127652、NIH 助成金 EY025290 で賄われていた。

1. 生産 BacMam 式バキュロ
<ol><li>BacMam ベクトル18 GFP 10 続くタバコ Etch ウイルス (TEV) プロテアーゼ認識シーケンス、ペグに必要な哺乳類 bestrophin 蛋白質のコーディング シーケンスを挿入、タンパク質の C 末端タグ x。</li>
	<li>一過性発現プラスミドを接着剤 HEK293 細胞19,20,21,22,23に transfect します。10 倍や 20 倍の倍率、488 nm 励起ソース 510 nm 発光フィルター (図 1 a) と蛍光顕微鏡下で GFP 融合タンパク質の発現を確認してください。 注: ポリマー ベースのトランスフェクションには、1 μ g のプラスミド DNA HEK293 細胞の 35 mm ディッシュ用、日常的に実行されます。</li>
	<li>前述の16,17として Sf9 昆虫細胞におけるバキュロを生成します。 注: 通路 3 (P3) ウイルス、タンパク質生産のため F HEK293 細胞に感染するために使用が、4 ° C で保存できる 1 ヶ月。</li>
	<li>プラーク形成アッセイ16,17P3 ウイルスの力価 (感染単位) を決定します。 注: 興味の蛋白質に GFP タグは、感染ユニットを確認するより高速な方法はウイルスのシリアル希薄と Sf9 細胞に感染して 48 時間後蛍光セルの数をカウントします。</li>
</ol>2. タンパク質発現
<ol><li>8% の CO2と 37 ° C 加湿インキュベーター HEK293 F 式培地と浮遊培養で HEK293 F 細胞を維持します。使い捨て文化フラスコ 2 〜 2.5 倍より大きい文化のボリュームよりも、回転で 135 回転軌道プラットフォーム上のカルチャを使用します。 注: お勧め 5 と 30 の通路の間にあるとき、細胞に感染して細胞文化フードの下でこれらのアクションを実行します。</li>
	<li>ウイルス感染前に 24 h は細胞培養の 15 μ 因数にトリパン ブルー色素の 15 μ L を追加してセル密度と生存率の顕微鏡下での検定を使用しています。各媒体の 500 ml で 37 ° C に加温 2 x 2 L フラスコに 10 の6セル/mL x 0.6 に細胞を希釈します。 注: 死んだ細胞がブルーで染色トリパン ブルー.目的のセル実行可能性は、> 95%。</li>
	<li>感染の日、細胞密度と生存率 (手順 2.2) を確認します。 注: の高い細胞生存率 > 95% は効率的な感染および蛋白質の表現のために不可欠です。予想される細胞密度は、~1.0 x 106セル/mL (10 6/mL の細胞培養 x 0.6 の 2 x 500 mL から成長した一晩) です。予想される総細胞数は ~1.0 x 109です。</li>
	<li>5 の感染 (MOI) の多様性で細胞に P3 バキュロを追加します。接種するウイルスの量を調べるには、するには、次の式を使用します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57832/57832eq1.jpg">
</li>
	<li>24 h の 8% の CO2と加湿の 37 ° C のインキュベーターで 135 の rpm の軌道プラットフォーム上のセルを振る。</li>
	<li>細胞培養に酪酸の 10 mM を追加し、48 時間の培養を続けます。 注: いくつかの蛋白質の細胞培養温度を 30 ° C に削減して後ナトリウム酪酸添加が式と安定性を向上します。</li>
	<li>10 倍や 20 倍の倍率、488 nm 励起ソース、510 nm 発光フィルター蛍光顕微鏡、割合と直接 (図 1 b) 蛋白質 (bestrophin-GFP-10xHis) 収量を表す緑の細胞の明るさを確認します。 注: 緑の細胞の割合によって計算されます: (緑色のセル/合計セル) × 100。良いタンパク質発現レベルは、顕微鏡下で強力な蛍光グリーンで示されます。</li>
	<li>4 ° C、20 分削除上清に 1,000 × g で遠心分離によって細胞を収穫し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ~ 80 mL の最終巻に、細胞ペレットを再中断します。分割 2 x 50 mL の円錐管に 4 ° C で 1,000 x g で 20 分間遠心細胞懸濁液は-80 ° C で細胞ペレットを格納します。</li>
</ol>3. 蛋白質の浄化
<ol><li>解凍するように 10-15 分間室温で攪拌水浴の細胞ペレットを含む円錐管を孵化させなさい。0.1 〜 1.0 プロテイナーゼ阻害剤 (特異ペプスタチン A、Leupeptin アプロチニン フッ化) 補われる (w/v) 量のバッファー (表 1) (例えば、 20 mL のバッファーで細胞ペレットの 10 g) x 2 のセル中断再 mM。上下ピペット広範囲に均一な細胞の懸濁液を得る。</li>
	<li>高圧ホモジナイザーを用いた細胞を溶解させます。細胞懸濁液を通すホモジナイザーの合計のための 7-10 MPa で 3-4 回完全な均質化を達成するために。ラウンドの間 2-3 分のため氷の上細胞ライセートをしてください。</li>
	<li>細胞ライセートに洗剤 [例えば2 w/v ソル グレード n-ドデシル-β-D-Maltopyranoside (DDM)] を追加します。膜タンパク質を抽出する 20 の ° C で 1 時間攪拌で孵化させなさい。 注: タイプの洗剤は、各蛋白質ターゲット18,24用に最適化する必要があります。</li>
	<li>1 h の 4 ° C で遠心で 150,000 × g で遠心分離機します。 注: 次の手順のすべては 4 ° C で実行されます。</li>
	<li>明確な細胞ライセートと流れ、5 mL の彼のトラップ Ni2 +-国税庁アフィニ ティー ・ カラムを通してそれは事前 (表 1) のバッファーで平衡を収集します。 注: 遠心分離の後明確な細胞ライセートは下部にペレットと曇りの層の上にサンドイッチされ。10 mL のピペットを使用して、慎重にクリア ライセートを収集、ライセートの数ミリリットル最後の 1 mL ピペットに切り替えています。Ni2 +列を詰まらせることが、ペレットを避けるためただし、最上位のレイヤーの少量は大丈夫ですまたは 1.5 μ m フィルターで除外することができます。</li>
	<li>洗浄バッファー B 25 mL とし、40 mL のバッファー C 列 (表 2 および 3、それぞれ)。 注: これは休憩合計浄化は最大 12 時間をかかることがあり、タンパク質は一晩の列に接続されている間安定している残ることができる良い場所です。</li>
	<li>タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システムに列を添付し、13 mL のバッファー D を持つ列から (表 3) をもつタンパク質分画を溶出します。UV 吸光度読み出しによるとタンパク質濃縮分数を収集します。 注: 、FPLC 条件は次のとおり: 1.0 mL 分数サイズ、0.3 MPa、流量を 0.5 mL/min に設定前のカラムの圧力警報。</li>
	<li>微量分光光度計で溶離されたタンパク質製品の濃度を測定します。280 吸光度を読み nm。</li>
	<li>(省略可能)10xHis GFP タグを削除するには、1:1 の質量比で TEV プロテアーゼを追加し、4 の ° C で 30 分間インキュベートします。 メモ: タグ、関数または浄化されたチャネルの構造には影響があります。TEV ボリューム ステップ 3.7 3.8 から収集された蛋白質の濃度から算出します。例えば、10 mL の溶出物を収集し、0.1 mg/ml、総蛋白測定質量は TEV の 10 × 0.1 = 1 mg、および 1 mg が消化に使用されます。</li>
	<li>(50 または 100 kDa) 15 ml 遠心蛋白質を集中 (2 mL サンプル読み込みループ FPLC) の 400-500 μ L の最終巻に 4 ° C で 4,000 x g で回してフィルター ユニット。 注: 濃度の遠心時間は濃度と蛋白質のサイズによって異なります。過集中を避けるため、可能性があります蛋白質の沈殿物を引き起こす、最初は、10 分間スピンし、残りのボリュームを観察および後続のスピンに時間を見積もる (例えば2-5 分) というように、最終的なボリュームを取得します。フィルターの下に引かれているタンパク質を分散させるためにスピン間ピペットで移しなさい。</li>
	<li>新しい 1.5 mL チューブまたは削除する任意の沈殿物の泡集中製品から高濃度のタンパク質を転送します。スピン > 4 ° C および収集新しい 1.5 mL チューブに上清を 5-10 分のための 12,000 × g。</li>
	<li>あらかじめバッファー E (表 5) が平衡サイズ排除カラム 1 mL シリンジとサイズ排除クロマトグラフィー用 FPLC システムのラウンド チップ針で最終製品をロードします。 注: 、FPLC 条件は次のとおり: 0.5 mL 分数サイズ、2.50 MPa に設定前のカラムの圧力警報、30 mL のバッファー E に設定流量(表 5)、流量を 0.5 mL/min に設定します。</li>
	<li>行儀蛋白質 (図 2 a) 単一のピークとして実行 (図 2 a) をピークに対応するタンパク質 fraction(s) を集めることに注意します。</li>
	<li>(ステップ 3.10 のように同じ分子量カットオフ) の 4 mL または 0.5 mL の遠心フィルター ユニットとスピンを最終濃度 5-10 μ g/μ L の 4 ° C で 4,000 x g でタンパク質を集中します。分光光度計を使用して、最終製品濃度 (ステップ 3.8) をチェックします。 注: 遠心時間、最終製品ボリュームことができます浄化試験間で異なるとは異なります。遠心分離は、通常、10 〜 20 分かかります。フィルターの下に引かれているタンパク質を分散させるためにスピン間のピペットにそれをお勧めします。</li>
	<li>高濃度のタンパク質を新しい 1.5 mL チューブに転送します。遠心分離によって任意の沈殿物を削除 > 4 ° C で 5 ~ 10 分の 12,000 × g上清を新しい 1.5 mL チューブに転送します。ストレージのための 10 の μ 因数-80 ° c、9 V/cm (図 2 b) 4 15% 勾配 SDS ページのゲル上で実行する 1 つの 2-5 μ L 小さい因数を保存します。</li>
	<li>質量8によって浄化された蛋白質のアイデンティティを確認します。 注: 関数のIn vitro解析と浄化された蛋白質の構造平面脂質二分子膜と x 線結晶構造解析、それぞれ5,8を介して実行できます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+bestrophins:+multifunctional+membrane+proteins+linked+to+best+disease+and+other+retinopathies.">Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies.</a> Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bestrophin,+the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Marquardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+a+novel+gene,+VMD2,+encoding+a+protein+of+unknown+properties+cause+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+(Best's+disease).">Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease).</a> Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).</li><li>Petrukhin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+gene+responsible+for+Best+macular+dystrophy.">Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy.</a> Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+mutations+impair+BESTROPHIN1's+essential+role+in+mediating+Ca2+-dependent+Cl-+currents+in+human+RPE.">Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Tsunenari, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+the+bestrophin+family+of+anion+channels.">Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).</li><li>Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+insights+into+the+function+of+a+Ca(2+)-activated+Cl(-)+channel.">Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel.</a> Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels.">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li><li>Johnson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bestrophin+1+and+retinal+disease.">Bestrophin 1 and retinal disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).</li><li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies.">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).</li><li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans.">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+a+retinal+pigment+epithelium+protein,+bestrophin-1,+cause+retinitis+pigmentosa.">Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa.</a> American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).</li><li>Kramer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+VMD2+gene+are+associated+with+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+(Best+disease)+and+adult+vitelliform+macular+dystrophy+but+not+age-related+macular+degeneration.">Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration.</a> European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).</li><li>Yardley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+VMD2+splicing+regulators+cause+nanophthalmos+and+autosomal+dominant+vitreoretinochoroidopathy+(ADVIRC).">Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).</li><li>Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEST1:+the+Best+Target+for+Gene+and+Cell+Therapies.">BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies.</a> Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).</li><li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells.">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers.">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nature Communications. 4, 2540 (2013).</li><li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2+-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A/16B+Ca2+-gated+Cl-+channels.">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li><li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2/CaV2.2+channels.">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).</li><li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels.">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).</li><li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rem,+a+member+of+the+RGK+GTPases,+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase.">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+cryo-electron+microscopy+(cryo-EM)+and+cross-linking+mass+spectrometry+(CX-MS)+for+structural+elucidation+of+large+protein+assemblies.">Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies.</a> Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).</li><li>Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+and+development+for+rare+genetic+disorders.">Drug discovery and development for rare genetic disorders.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは、将来の in vitro解析に使用される哺乳類 bestrophin イオン チャネルの発現と精製に有用なパイプラインについて説明します。サイズ排除クロマトグラフィー用 FPLC デバイス、シリンジ ポンプはアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーのバインド、洗濯、溶出性などのすべてのステップのために十分。列を (注射器) でプッシュ ソリューションにシリンジ ポンプを使用する場合列に空気の泡を押すことを避けるためにスプリング側をアンダーレイに欠かせません。後アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー蛋白質の純度は、その後の実験のために十分が既にいる場合、FPLC デバイス可能性があります必要はありませんすべてのサイズ排除クロマトグラフィーを省略できます。
PBacMam プラスミドからバキュロを作るのに約 2 週間かかる、効率化行儀タンパク質同族体の初期画面を実現できる一時的に transfected HEK293 細胞を収穫 (e.g、60 mm ディッシュから) と。テスト方法、興味の蛋白質の表現 (例えばDDM) 洗剤の蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー (FSEC)18,24動作 (GFP タグ付き)。FSEC の安定と状単分散良い transfected HEK293 細胞で強い蛍光を示すタンパク質の構造に焦点を当てる最も生産的です。
蛋白質の浄化の収率を増加させるのにいくつかの推奨事項があります。まず、TEV 消化のための条件は、各蛋白質のために最適化する必要があります。これは、タンパク質-TEV 質量比 (例えば10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10) の範囲をテスト (など0.5 h、1 h、2 h、5 h と一晩) 回インキュベートして行うことができます。その後、開裂の効率をチェックするゲルの SDS のページで扱われたサンプルを実行することをお勧めします。また、FPLC またはシリンジの接続から遠心上清または溶離液流出をさせることが重要です。同様に、高濃度のタンパク質をピペッティング時に泡を避けるために重要です。
様々 な後続の in vitro解析手順この議定書から蛋白質を利用するは、脂質二重層、x 線結晶構造解析、クライオ電子顕微鏡、分光、ハイスループットス クリーニング8,25,26。

Bestrophins は、人間1細菌からさまざまな種を保存するイオン チャネルの家族です。ヒトでは、 BEST1の遺伝子、染色体 11q12.3 に位置するエンコード膜タンパク質 Bestrophin-1 (BEST1) 目2,3 の網膜色素上皮 (RPE) 細胞の基底膜で主に表される ,4。うち最初の 〜 350 種間保存性が高いと、膜貫通領域を含む、585 アミノ酸から成る BEST1 人間1,5,6に CaCC を果たします。さらに、鶏の BEST1 同族体および肺炎桿菌の両方として機能する homopentamers7、8、進化を通じて保全の高レベルを示唆しています。
ヒトでは、200 以上BEST1遺伝子変異を臨床的に bestrophinopathies1,9と呼ばれる網膜変性疾患のグループにリンクされています。ベスト病、成人発症卵黄状黄斑ジストロフィー、常染色体優性の支配的な vitreoretinochoroidopathy、常染色体優性劣性 bestrophinopathy、網膜色素変性症3,4 など 5 つの特定の bestrophinopathies が報告されています。 ,,1011,12,13,14。視力の低下、さらには失明につながるが、これらの病気、現在治療されます。治療上の処置および可能性のある個人化された薬を開発するために関数と BEST1 チャネル15の構造のこれらのBEST1病気を引き起こす突然変異の影響を理解するが重要です。これらの目的のための研究者の in vitro解析5,8を行い精製 bestrophin (野生型および変異) チャンネルを取得する必要があります。
最初の重要なステップは、哺乳類細胞における高い種から bestrophin チャンネルの式です。このプロトコルが堅牢な発現の最適化された BacMam ベクトル (BacMam pEG) を利用して F HEK293 細胞 (BacMam システム) のバキュロ ウイルス伝達はクローン膜タンパク質16,17を表現する強力な方法は、ターゲット蛋白質18, この場合 bestrophin 哺乳類ホモログであります。このベクターは、G タンパク質共役受容体、核内受容体、イオン チャンネル18など、各種の膜タンパク質の発現のために使用されています。また、作り出されたタンパク質が結晶18に適している証拠です。F HEK293 細胞における発現の高レベルの蛋白質できます、精製するクロマトグラフィー具体的には、bestrophins、場合親和性とサイズ排除クロマトグラフィーを使用することができます。
このプロトコルは bestrophin チャンネルの微調整が、浄化された蛋白質は関数と平面脂質二分子膜とそれぞれ5,8、x 線結晶構造解析による構造を分析できます。完全に、これらのテクニックは、bestrophins と他のイオン チャネルの構造と機能の調査のため強力なパイプラインを提供します。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327265000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446212500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC301870010</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC197530010&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA4058704&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ63039MA</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ61188MB&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ20037MB</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC215740050</td><td></td></tr><tr><td>DDM sol-grade</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>DDM anagrade</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>ThermoFisher</td><td>10902179</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle medium</td><td>ThermoFisher</td><td>12338018</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop spectrophotometer</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>High pressure homogenizer</td><td>Avestin</td><td>Emulsiflex-C5</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap column</td><td>GE</td><td>17-5248-01</td><td></td></tr><tr><td>Superdex-200 column</td><td>GE</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Pure</td><td>GE</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-15 centrifugal filter units</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-4 centrifugal filter units</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-0.5 centrifugal filter units</td><td>Millipore</td><td>UFC505024</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN precast gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet transfection reagent</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>pEG BacMam vector</td><td></td><td></td><td>Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute</td></tr></tbody></table>

expression and purification of mammalian bestrophin ion channels

人間のゲノムは、4 つの bestrophin paralogs、すなわち BEST1、BEST2、ベスト 3、ベスト 4 をエンコードします。BEST1の遺伝子によって符号化される BEST1 は、Ca2 +-アクティブに Cl-チャネル (CaCC) 主に網膜色素上皮 (RPE) で表されます。BEST1 の生理学的および病理学的意義がBEST1遺伝子の 200 以上の異なる変異が最高の卵黄など少なくとも 5 つの網膜変性疾患のスペクトルに遺伝的リンクされているという事実によって強調表示されます。黄斑ジストロフィー (疾患)。したがって、非常に大きな意義を保持 bestrophin チャネルを単一分子レベルでの生物物理を理解すること。ただし、精製された哺乳類のイオン チャネルを得ることはやりがいのある仕事ではしばしばです。ここで、哺乳類 bestrophin BacMam バキュロ ウイルスの遺伝子の転送システムと親和性とサイズ排除クロマトグラフィーの浄化蛋白質の表現のためのプロトコルを報告します。浄化された蛋白質脂質二重層と結晶の電気生理学的記録など、以降の機能・構造解析に活用される可能性があります。重要なは、このパイプラインは他のイオン チャネルの構造と機能を研究する合わせることができます。

一過性トランスフェクション接着 HEK293 細胞 (図 1 a) の蛍光強度は、サスペンション F HEK293 細胞 (図 1 b) に投影されたタンパク質発現レベルの良い指標です。表現の構成要素を変更することを検討する場合はターゲット蛋白質が発現された、または、誤 HEK293 細胞にトランスフェクション後ローカライズされて、お勧め (e.gGFP タグの位置を変更する、または突然変異/切り捨て。ターゲット蛋白質のために)。小さな HEK293 F サスペンション文化 (例えば、 25 mL 文化) は、その中で MOI 感染、培養温度が過去の経験の中で最も重要なされている蛋白質の表現のための条件を最適化するために使用されます。
成功の浄化は、サイズ排除クロマトグラフィー (図 2 a) と変性の SDS ページのゲル (図 2 b) の単一の支配的なバンドで予想される溶出ボリュームで単一主要なピークで示されます。サイズ排除クロマトグラフィーに複数のピークがある場合は、各ピークを収集し、どのピークを含む機能チャネル ポリアクリルアミドゲルを決定するためのネイティブのゲルを実行することが重要です。それは、2 つの蛋白質の構造の間式レベル示されている収穫の時に蛍光強度でない nesessarily は最終的な収量と関連付ける浄化中に各蛋白質の構造が異なりますので注意してください。行儀 bestrophin 蛋白質のため、最終精製製品の 200-500 μ g は、HEK293 F 懸濁細胞の 1 L から通常入手できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57832/57832fig1.jpg"> 図 1: 哺乳類 bestrophin 蛋白質発現。GFP 付けられた哺乳類 bestrophin の顕微鏡画像で表現 (A) 接着剤 HEK293 細胞 (B) 懸濁液でプラスミド トランスフェクションを HEK293F セル バキュロ ウイルス感染によって。左 = 緑の蛍光性;右 = 明るいフィールド。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57832/57832fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57832/57832fig2.jpg"> 図 2: 哺乳類 bestrophin タンパク質の精製します。(A) 親和性浄化された GFP 付けられた蛋白質は 1 つの主要なピークとしてサイズ排除ゲルろ過カラムに走った。破線の間の分数を集めました。(B) 最終蛋白質の製品は、はしご (左の列) と SDS ページのゲルに走った。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57832/57832fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>MW</td>
			<td>1 L あたりの金額</td>
			<td>最終的な</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>238.3</td>
			<td>11.9 g</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>58.44</td>
			<td>17.529 g</td>
			<td>300 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>グリセロール</td>
			<td>92.09</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>5% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>イミダゾール</td>
			<td>68.1</td>
			<td>1.3616 g</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>203</td>
			<td>0.20331 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>tris(2-carboxyethyl) ホスフィン</td>
			<td>287</td>
			<td>2.5 mL 200 mM 在庫</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 蛋白質の浄化のバッファー (バッファー巻き上がり)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>MW</td>
			<td>1 L あたりの金額</td>
			<td>最終的な</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>238.3</td>
			<td>11.9 g</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>58.44</td>
			<td>17.529 g</td>
			<td>300 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>グリセロール</td>
			<td>92.09</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>5% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>イミダゾール</td>
			<td>68.1</td>
			<td>2.7232 g</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>203</td>
			<td>1.01655 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>tris(2-carboxyethyl) ホスフィン</td>
			<td>287</td>
			<td>0.5 mL 200 mM 在庫</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DDM (anagrade)</td>
			<td>510.6</td>
			<td>0.5 g</td>
			<td>0.05% (w/v)</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: タンパク質精製バッファー B (最初洗浄バッファー)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>MW</td>
			<td>1 L あたりの金額</td>
			<td>最終的な</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>238.3</td>
			<td>5.95 g</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>58.44</td>
			<td>29.2 g</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>グリセロール</td>
			<td>92.09</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>5% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>イミダゾール</td>
			<td>68.1</td>
			<td>5.1 g</td>
			<td>75 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>tris(2-carboxyethyl) ホスフィン</td>
			<td>287</td>
			<td>0.5 mL 200 mM 在庫</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DDM (anagrade)</td>
			<td>510.6</td>
			<td>0.5 g</td>
			<td>0.05% (w/v)</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3: タンパク質精製バッファー C (2 番目の洗浄バッファー)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>MW</td>
			<td>1 L あたりの金額</td>
			<td>最終的な</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>238.3</td>
			<td>7.74 g</td>
			<td>32.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>58.44</td>
			<td>11.686 g</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>グリセロール</td>
			<td>92.09</td>
			<td>25 mL</td>
			<td>2.5% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>イミダゾール</td>
			<td>68.1</td>
			<td>17.02 g</td>
			<td>250 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>tris(2-carboxyethyl) ホスフィン</td>
			<td>287</td>
			<td>0.5 mL 200 mM 在庫</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DDM (anagrade)</td>
			<td>510.6</td>
			<td>0.5 g</td>
			<td>0.05% (w/v)</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4: タンパク質精製バッファー D (溶出バッファー)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>MW</td>
			<td>1 L あたりの金額</td>
			<td>最終的な</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>238.3</td>
			<td>9.53 g</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>58.44</td>
			<td>11.686 g</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>tris(2-carboxyethyl) ホスフィン</td>
			<td>287</td>
			<td>0.5 mL 200 mM 在庫</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DDM (anagrade)</td>
			<td>510.6</td>
			<td>0.5 g</td>
			<td>0.05% (w/v)</td>
		</tr>
</tbody></table>表 5: タンパク質精製バッファー E (ゲルろ過バッファー)

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels at JoVE.com

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

イオン チャネルの浄化はしばしば困難、しかし、一度は、それが悪意のチャネルの構造と機能の生体外で調査。ここでは、式と哺乳類 bestrophin 蛋白質、Ca2 +の家族の浄化の段階的な手順を述べる-Cl-チャンネルを活性化します。

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

expression-and-purification-of-mammalian-bestrophin-ion-channels

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.3K ビュー.  University of Rochester, School of Medicine and Dentistry. イオン チャネルの浄化はしばしば困難、しかし、一度は、それが悪意のチャネルの構造と機能の生体外で調査。ここでは、式と哺乳類 bestrophin 蛋白質、Ca2 +の家族の浄化の段階的な手順を述べる-Cl-チャンネルを活性化します。

ビデオ: Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe the application of this novel label-free technique to study the interaction of human EAG1 (hEAG1) channel proteins with the small molecule PIP2. hEAG1 channel has been recognized as potential therapeutic target because of its aberrant overexpression in cancers and a few gain-of-function mutations involved in some types of neurological diseases. We purified&#160;hEAG1 channel proteins from a mammalian stable expression system and measured the interaction with PIP2 by BLI. The successful measurement of the kinetics of binding between hEAG1 protein and PIP2 demonstrates that the BLI assay is a potential high-throughput approach used for novel small-molecule ligand screening in ion channel pharmacology.

The protocol here describes the interactions of purified hEAG1 ion channel protein with the small molecule lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). The measurement demonstrates that BLI could be a potential method for novel small-molecule ion channel ligand screening.

バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

生化学

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

神経組織再生のための可溶性および不溶性ビオチン化タンパク質の発現、分離、および精製

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

生物工学

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

生物学

溶質キャリアトランスポーターの発現および精製戦略

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

著者スポットライト:コドン最適化遺伝子を用いたヒト溶質キャリアトランスポーターの発現と精製 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

哺乳類 Bestrophin イオンチャネルの発現と精製

要約

さらに動画を探す

この動画の章

バイオ層干渉法による小分子とイオンチャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオンチャネル TRPC3 の精製

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

神経組織再生のための可溶性および不溶性ビオチン化タンパク質の発現、分離、および精製

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

要約

さらに動画を探す

この動画の章

バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

神経組織再生のための可溶性および不溶性ビオチン化タンパク質の発現、分離、および精製

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

哺乳類 Bestrophin イオンチャネルの発現と精製

バイオ層干渉法による小分子とイオンチャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオンチャネル TRPC3 の精製