私たちは、クリストフBieniossek、サイモンTrowitzsch、ダニエル·フィッツジェラルド、雄一郎高木、クリスティSchaffitzel、イヴォンヌウンツィケル、ティモシーリッチモンド、ヘルプやアドバイスバーガー研究室のすべての過去と現在のメンバーに感謝。 MultiBacプラットフォームとその開発がされており、寛大にスイス国立科学財団（SNSF）、アジャンスナショナル·デ·ルシェルシュ（ANR）とセンターナショナル·デ·ルシェルシュ科学研究（CNRS）と欧州委員会（EC）を含む、資金提供機関によってサポートされていますフレームワークプログラムで（FP）6と7。国境を越えたアクセスのサポートはEC FP7プロジェクトP-CUBE（によって提供されます<a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a> ）とBioStruct-X（ <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a> ）。科学フランス語省は特にヴェスD&#39;アベニールプロジェクトFRISBIを通してEMBLでMultiBacプラットフォームをサポートするため認められている。

1。多重遺伝子発現構築物を作成するためのタンデムコンビニアリング（TR） <ol><li> 共発現戦略を計画 。供与体および受容体に興味のあるあなたの遺伝子を挿入するための設計手法。あなたの体の潜在的な生理的なサブモジュールは、特定のアクセプタとドナーで一緒にグループ化する必要があります。個々のドナーとアクセプターのプラスミドに発現カセットを組み合わせることのBstXIペア7,8は、in silicoで 、関連するすべての構成要素を作成し、実験的な作業に進む前に、徹底的に戦略を検証-ホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）で構成される乗算モジュールを使用します。例えば、目的の遺伝子は、HEまたは他の制限部位と正しいオープンリーディングフレーム（ORF）の存在が検証する必要があるが含まれていないか確認してください。タンパク質産生量ならびに任意のEXIの除去を改善するために昆虫細胞のコドン使用頻度およびmRNAの二次構造のために最適化合成遺伝子の順序を考慮HE目的の遺伝子からサイトを刺す。柔軟性のある、または露出したn-または選択のあなたの蛋白質のC末端に関する文献からのデータに基づいて、精製タグを配置することを検討。個々のタンパク質の相対量は、複雑で化学量論の問題のために制御する必要がある場合は複雑で、いくつかのタンパク質サブユニットの生産を目指すポリ戦略を適用することを検討。4詳述&quot;ハウツー&quot;文書（電子ラボ帳が推奨されます）を含むを準備すべての完全な多重遺伝子構築物（複数可）に至るまで、プロジェクトの実験手順を投影。バーガーグループのホームページ（からダウンロードできCRE-ACEMBLERソフトウェアを使用して、例えばCRE-のLoxP融合プラスミドの電子ファイルを作成<a href="http://www.embl.fr/multibac/%20multiexpression_technologies/cre-acembler" target="_blank">www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler</a> ）。 </li><li>選択したドナーに興味のあるあなたの遺伝子を挿入し、制限酵素とリガーゼを用いることにより、又は、代替的に、公開プロトコルに従ってライゲーションの独立した方法を用いて、アクセプタ。5,6,14は、液体ハンドリングワークステーションへのアクセス権を持っている場合は、生成される構築物の多数（予定がある場合コンビナトリアルアプローチのためなど）リキッドハンドリングワークステーションが使用できない場合はバーガーグループ（ 図2）。14,15によって開発され、実装されロボットスクリプトの使用を検討し、マイクロタイタープレートを使用して手動操作は、ファッションのようにHTにおいて遺伝子の挿入を可能にします。 </li><li>表現のサブユニットの化学量論を制御する必要性によって課される制約が顕在化することができる。タンパク質複合体の個々のサブユニットの化学量論的に不均衡な発現レベルの場合には、sであけ単一の大規模のORFであなたの体のいくつかのサブユニットと特異的プロテアーゼ（例えばタバコエッチウイルスNIAプロテアーゼ）を結合させるためにポリ戦略を適用することを検討pecificタンパク質分解のサイトは、多くのサブユニットと非常に大規模な複合体を持っていると広く、個々のサブユニットの分子量の範囲の場合。4,8つを共発現または単一の発現カセットを持ついくつかのポリタンパク質を検討します。そのタンパク質が低い歩留まりによって特徴づけされている場合はポリで、またはいくつかの同一の発現カセットと同じタンパク質をコードするいくつかの遺伝子を共発現することを検討してください。4,13は </li><li>制限マッピング（オプションで高スループット）とシーケンシングによりクローニングすべてのドナーとアクセプター構造を検証します。選択肢の多重遺伝子発現コンストラクトを生成するCRE-のLoxP組換えによってドナー - アクセプターの組み合わせを融合に進みます。制限マッピングによりアクセプタドナー融合プラスミドを精製した検証、CRE-ACEMBLERまたは基準と同様のプログラムで作成された電子のシーケンスを使用しています。 </li><li> -20℃で精製し、検証ドナー、アクセプタとドナー·アクセプター融合を保存したり、80℃アーカイブPLasmids、後で使用するために慎重にそれらの配列（Microsoft Excelのは、FileMaker、他）。 </li></ol> 2。複合多重遺伝子バキュロウイルスの生成、増幅およびストレージ<ol><li> DH10ウイルスゲノムを保有する細胞やトランスポゾンTn7転位のために必要な機能に変換することによって、多重遺伝子導入ベクターMultiBacバキュロウイルスゲノムを統合します。 MultibacバキュロウイルスゲノムがトランスポゾンTn7統合を先行する生体内のCre 反応して、独自のloxP部位への関心の特定の遺伝子（YFPマーカー、シャペロンなど）（トランスポゾンTn7結合部位より遠位ゲノムに設計）でプリロードできることに注意してください。 13トランスポゾンTn7移調した後、目的の遺伝子を含む複合バキュロウイルスと細胞は青/白スクリーニング（β-ガラクトシダーゼのα-相補性の喪失に成功トランスポゾンTn7移調結果によって選択されるため、正しいトランスポゾンTn7移調とコロニーが選択的に白のままガーX-galを含むプレート）及びゲノムはアルカリ溶解し、エタノール/イソプロパノール沈殿によって調製される。5,6 </li><li> トランスフェクションおよび初期ウイルス産生 。滅菌フードに代えて6ウェル組織培養プレート。対数期たSf21昆虫細胞培養物から、説明したように培養培地中で混合精製バキュロウイルスゲノムおよびトランスフェクション試薬を添加することによりウェルとトランスフェクトの細胞のアリコートのうちシード。媒体を除去することにより、48〜60時間後に収穫6の初期ウイルス（高品質、低力価ウイルスV 0、ウェルあたり通常3ミリリットル）。新鮮なメディアを補完し、さらに2〜3日後のタンパク質生産（と、YFPマーカーが蛍光について、存在する場合）のためのテスト。6,7 </li><li> ウイルスの増幅、低MOI養生法 。小（100〜250ミリリットル）三角シェーカーフラスコ撹拌で対数増殖期にある細胞25〜50ミリリットル（1mlあたりの細胞密度は&lt;1×10 6個の細胞）を感染させるために、V 0ウイルスを使用軌道プラットフォームシェーカー上で（ 図3）。細胞をカウントし、細胞が倍加（増殖停止を）停止するまで24時間毎に分割。 （セルあたりのウイルス粒子の感染すなわち番号の多重度）MOI低いレジメン従い細胞を倍増する必要があります（少なくとも）一回（MOI &lt;1）を、そうでなければ、V 0より小さい音量で実験を繰り返した。通常は、V 0 3mlを0.5×10 6細胞/ mlの密度でたSf21昆虫細胞を25mlを感染するために使用される。これは有害な防ぐために必要不可欠である目的の異種遺伝子の損失につながることができるウイルスの過剰増幅と自動削除。細胞をペレット化し、ウイルスを含む培地を除去することにより48-60時間後に収穫V 1ウイルス（25〜50ミリリットル）。 6、1×10 6個の細胞ごとに12または24時間を削除しペレット化し、タンパク質の生産とマーカータンパク質（YFP）信号を検証すること。によってYFPとタンパク質生産のための新鮮な培地とテストと補足、（へウイルスを増幅V 2）は、さらに大きいの発現量は、上記の低MOIレジメン（細胞がV 1と感染後に少なくとも一度は倍増しなければならない）尊重V 1ウイルスに2 Lシェーカーフラスコで400ミリリットルの細胞にまで感染させることにより目的としている場合。厳密に興味のある遺伝子を含む、もはや欠陥ウイルスの蓄積を避けるためないように増幅中タンパク質の生産とマーカータンパク質シグナルをテストします。各増幅で蓄積5-7使用細胞ペレットは、関心の発現タンパク質複合体の精製プロトコールを確立するために、既に手順。 </li><li> 生産ウイルスのBIICストレージ 。我々は強く、組換えウイルスの修飾（ 例えば 、目的の遺伝子の損失）を防止し、高発現を維持するために、BIIC（B aculovirus- 私はCエルボをnsect nfected）メソッドを使用して生産ウイルスとしてV 2ウイルスを保管することをお勧めレベル。増殖停止後の16ペレット感染細胞を24時間が観察さ-彼らがメディアに（出芽によって）解放される直前に、この段階で細胞が完全なウイルス粒子を含んでいます。液体窒素でメディアや細胞ペレットの凍結アリコートを取り出し、無期限に保管してください。7,16は </li></ol> 3。タンパク質の生産と下流の処理<ol><li> 大（r）は文化や監視YFPに感染 。生産ラン（通常2 Lフラスコ中の400ミリリットル）のため大きな細胞培養に感染するV 1、V 2または冷凍BIICアリコートを使用してください。低MOI養生法（感染した文化が少なくとも一度は倍増するような感染症に使用されたウイルスの音量を調節する）に準拠しています。フラスコの数を乗じて、必要に応じて感染文化ボリュームを拡大します。 YFPマーカータンパク質が存在する場合は、定義された間隔で1×10 6細胞、ペレットを回収し、プラトーインドールを達するまで細胞を溶解し、YFP信号の変化を監視する最大の組換えタンパク質産生をicating。 YFPレベルは、蛍光信号（ 例えばテカンSPECTRAFluor）を記録することのできる標準的な96ウェルプレートリーダーで測定することができる。この段階で細胞を回収。 -20°C（短期）または-80°C（長期）で保存細胞ペレット。 </li><li> 細胞溶解と分別 。あなたの蛋白質の要件（凍結融解、超音波処理、フレンチプレス、他）に合わせて、選択したお好みの方法で細胞を溶解。興味のあるタンパク質の存在のための5-7分画細胞質と核とテスト。タンパク質精製を簡略化するためにその結果に基づいて精製プロトコールを開発する。あなたのタンパク質が核内に存在する場合、高KClの条件の下で核画分からタンパク質を抽出するために浸漬手続きを適用することを考えてみましょう。7,18 </li><li> タンパク質精製（マイクロスケール、大規模）。細胞培養のしばしば小さなボリュームが（10または25 ml）のSUであることに注意してくださいバキュロウイルス/昆虫細胞系（L培養物より当たりのタンパク質しばしば10〜100 mg）の中で異種タンパク質の典型高い又は非常に高い生産レベルに起因する関心のあるタンパク質の実質的な量の精製細胞ペレットを得るためのfficient。マイクロ精製（マルチウェルプレート、マイクロチップ法、GEヘルスケアÄKTAmicro系、その他）と一緒に、それはまた、多くの場合、ナノリットル規模ハイスループット結晶化（HTXは、目的のタンパク質との複合体の十分な量の生化学的および活動データを得ることができると）。小さなにおけるイオン交換およびサイズ​​排除クロマトグラフィーと組み合わせて、精製を容易にするために複雑なあなたの蛋白質の露出したサブユニットの金属アフィニティー精製（クロンテックタカラTALON、キアゲンNiNTA金属キレート樹脂）とオリゴヒスチジン（6-10残基）タグを使用することを検討して例えばÄKTAmicroまたは類似少量浄化機（ 図4を使用してボリューム</st栄&gt;）。オリゴヒスチジンタグや他のタグ（GST、MBP、CBP、他人から選択）との親和性精製に加えて、他のアフィニティ精製工程、イオン交換（IEX）ステップ缶やタンパク質の生化学的特性に応じて、考慮すべきである関心や個々の好みの。浄化効率を高めるために親和性タグで1サブユニットよりタギング以上を考えてみましょう。あなたの精製されたタンパク質複合体を集中し、グリセリンの有無にかかわらず凍結などのストレージ·プロトコルを確立します。今精製タンパク質のバッチ間変動を評価するために（活性アッセイ、生化学的および生物物理学的試験）標準的に適用することができる品質管理基準を開発する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+Grip+on+Complexes.">Getting a Grip on Complexes.</a> Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).</li><li>Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+sociology+of+the+cell.">The molecular sociology of the cell.</a> Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+expanding+the+research+toolbox+for+multiprotein+complexes.">MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).</li><li>Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complex+expression+by+using+multigene+baculoviral+vectors.">Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).</li><li>Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+multigene+baculovirus-based+eukaryotic+protein+complex+production.">MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).</li><li>Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+baculovirus+expression+tools+for+recombinant+protein+complex+production.">New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production.</a> J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).</li><li>Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robots,+pipelines,+polyproteins:+enabling+multiprotein+expression+in+prokaryotic+and+eukaryotic+cells.">Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells.</a> J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).</li><li>Thomas, M. C., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+transcription+machinery+and+general+cofactors.">The general transcription machinery and general cofactors.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).</li><li>Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+eukaryotic+ribosome.">Atomic structures of the eukaryotic ribosome.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).</li><li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+core,+two+shells:+bacterial+and+eukaryotic+ribosomes.">One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).</li><li>Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+RNA+polymerase+II+and+implications+for+the+transcription+mechanism.">Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism.</a> Science. 288 (5466), 640-649 (2000).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).</li><li>Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering.">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li><li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.D.+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+(TIPS)+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+(sGC)+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus.">H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).</li><li>Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mitotic+checkpoint+complex.">Structure of the mitotic checkpoint complex.</a> Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).</li><li>Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a.">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li></ol>

IBは、ここに記載された技術の一部を詳述する特許および特許出願に発明者である。

図2と図3のビデオスナップショットは多重遺伝子発現のcDNAからロボット支援世代から全体のプロセスを説明すると、タンパク質生産のための昆虫細胞培養の感染にすべての方法を構築します。新しい試薬（プラスミドおよびウイルス）と堅牢なプロトコルは、SOPのに頼ってパイプラインを有効にするために開発されてきた。パイプライン全体は、グルノーブルのEMBL?...

生物学的活性は、タンパク質および細胞機能を触媒するために協調して作用する他の生体分子のアセンブリによって制御される。顕著な例は、メッセンジャーRNAへのDNAに含まれる遺伝情報を転写する機械があります。ヒトでは、100以上のタンパク質であるRNAポリメラーゼIIや、TFIID、TFIIHおよび他のような一般的な転写因子。9その他の例を含む10以上のサブユニットを持つ大規模な多タンパク質複合体を形成し、遺伝子を転写するために定義され、規制のプロセスで一緒に来るリボソーム、タンパク質合成、または真核生物の核膜を介して生体分子を往復する責任が核膜孔複合体を触媒する多くのタンパク質およびRNA分子からなる。セル内の本質的にすべての多成分のマシンの詳細な建築と生化学解剖はその機能を理解することが不可欠です。原核生物とeukarの構造解明yoticリボソーム、例えば、これらの高分子マシンはセルでの指定機能を実行する方法に前例のない洞察力を得て構成特徴的なイベント。10,11 リボソームは、最大細胞の質量の30％にすると、リボソームから構成されるという事実のため、培養細胞から内因性の物質を精製することにより詳細な研究のための十分な質および量を得ることができる。 RNAポリメラーゼIIは、桁違いにすでに少ない豊富で、酵母培養の多くは千リットルは、転写の中心、この本質的な複合体の詳細な原子のビューを取得するために処理されなければならなかった。他の本質的な複合体の12圧倒的多数でしかし存在している天然の細胞において非常に低い量、従って、天然源材料から十分に浄化できない。このような複合体をレンダリングするために詳細にアクセス可能な構造と機能解析、組換えTEを使用して異種の生産を必要とするchniques。 組換えタンパク質の生産は、生命科学研究に大きな影響を与えた。多くのタンパク質は、組換え生産され、それらの構造および機能は、高解像度で解剖した。構造的ゲノミクスプログラムは、ハイスループット（HT）モードで全体の生物の遺伝子産物のレパートリーに対処するための多くの生物のゲノムの解明を利用している。タンパク質構造の数千人は、このように決定されている。現在までに、組換えタンパク質の生産に最も豊富に使用されるシステムは、E.されている大腸菌 、多くの発現系は、このホストにおける異種生産のために長年にわたって開発され洗練されてきた。 E.のタンパク質産生を可能にするために官能基の過多を保持するプラスミド大腸菌は、商用プロバイダの全体のカタログを埋める。 しかし、E.大腸菌は、多くの真核生物タンパク質を産生することが適さない特定の制限があり、およびpで多くのサブユニットを有する関節タンパク質複合体。したがって、真核生物宿主におけるタンパク質生産はますます近年の選択の方法となっています。真核生物タンパク質を生成するために特によく適したシステムは、研究室で栽培昆虫細胞培養物を感染させるために異種遺伝子を担持する組換えバキュロウイルスに依存するバキュロウイルス発現ベクター系（BEVS）である。 MultiBacシステムは、特に、多くのサブユニット（ 図1）真核生物タンパク質複合体の製造に合わせて調整され、より最近開発BEVSある。 MultiBacが最初に2004年に導入された図13は 、その導入以来、MultiBacを連続洗練されており、処理を簡略化する標的タンパク質の品質を向上させ、一般的に効率的な標準業務手順書（SOP）を設計することにより、非専門家のユーザーにシステムがアクセスできるようにするためにストリーム並ぶ。 4 MultiBacは、ACで、世界中の多くの研究室で実施されているademiaや業界。グルノーブルEMBLで、国境を越えたアクセスプログラムは、自分の研究を進めるために、この生産システムを利用することを望んだ科学者のためMultiBacプラットフォームで専門的なトレーニングを提供するために、欧州委員会によって所定の位置に置かれた。これまでアクセスできていなかった多くのタンパク質複合体の構造および機能はMultiBacで生成試料を用いて明らかにした。以下、4彼らはEMBLグルノーブルでMultiBac施設で稼動しているように、MultiBac生産の本質的なステップは、プロトコルにまとめる。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bluo-Gal</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15519-028 (1 g)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetracycline</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>UT2965-B (25 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycine</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0420 (25 g)</td>
 <td>1,000X at 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycine</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>G3632 (5 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0008-B (5 g)</td>
 <td>1,000X at 1M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cre-recombinase</td>
 <td>New England BioLabs</td>
 <td>M0298</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>X-Treme GENE HP transfection reagent</td>
 <td>Roche</td>
 <td>06 366 236 001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hyclone SFM4 Insect</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH 30913.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well plate Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357507</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357543</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml cryotube Nunc</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>55005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211919</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 L shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Certomat Orbital Shaker + plateau</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>4445110, 4445233</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen tank dewar 35 L</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>M76801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biological Safety Cabinet Faster</td>
 <td>Sodipro</td>
 <td>FASV20000606</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>451207</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sf21 Insect cells</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hi5 Insect cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B855-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan freedom EVO running Evoware plus</td>
 <td>TECAN</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 &mu;l conductive tips (black),</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l conductive tips (black)</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>disposable trough for reagents, 100 ml</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 613 049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>twin.tec PCR plate 96, skirted</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0030 128.648</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well V bottom, non sterile</td>
 <td>BD falcon</td>
 <td>353263</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate color natural, PP)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>M3752M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PS microplate, 96 well flat bottom</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>655101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate</td>
 <td>Thermo scientific</td>
 <td>AB-0932</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24 well blocks RB</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DpnI restriction enzyme</td>
 <td>NEB</td>
 <td>R0176L</td>
 <td>20 U/uL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEBuffer 4 10X</td>
 <td>NEB</td>
 <td>B7004S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix HF</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-531L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix GC</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-532L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DGLB 1.5X</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td>7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10496-016</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10068-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-gel 48 1% agarose GP</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>G8008-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 708.24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 707.2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gotaq green master mix</td>
 <td>Promega</td>
 <td>M7113</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA polymerase, LIC-qualified</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>70099-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT 100 mM</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea 2 M</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA 500 mM pH 8.0</td>
 <td>Homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth (Miller) 500 g</td>
 <td>Athena ES</td>
 <td>103</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

the multibac protein complex production platform at the embl

プロテオミクス研究は、前例のない詳細に真核生物のプロテオームの印象的な複雑さを明らかにした。それは今では、細胞内のタンパク質はほとんど孤立実体としてではなく存在するが、ほとんどすべてではない重要な機能のため、セル内組立ラインを形成し、人間の10以上では、多くの他のタンパク質に関連してその生物学的活性を発揮することが一般的に受け入れられている概念です。1 、これらの多アセンブリの機能とアーキテクチャの2知識は優れた品質と詳細な分析のために十分な量のそれらの提供を必要とします。細胞内の多くのタンパク質複合体の不足は、真核生物において、特に、天然のソースからそれらの抽出を禁止し、組換え生産を必要とする。バキュロウイルス発現ベクター系（BEVS）は真核生物タンパク質を製造するために特に有用であることが証明されて、活性は、多くの場合、翻訳後プロセシングに依存する他の一般的に使用される発現系は、しばしばできることサポートしていない。3 BEVSは、目的の遺伝子が交互に選択したタンパク質を産生昆虫細胞培養物を感染させるために挿入された組換えバキュロウイルスを使用します。 MultiBacは、多くのサブユニットを含有する真核タンパク質複合体の製造に特に調整されているBEVSある。4タンパク質およびそれらの複合体を効率よく製造するための極めて重要な前提条件は、理想的として実装することができる発現実験に関与するすべてのステップのための堅牢なプロトコルである標準作業手順書（SOP）と比較的容易に非専門家ユーザーがまた続く。欧州分子生物学研究所（EMBL）におけるMultiBacプラットフォームは、タンパク質の小規模な分析に異種タンパク質の生産特性のために最適化設計されたバキュロウイルスゲノムに遺伝子を挿入することから開始し、多複雑な式実験に関与するすべてのステップのためのSOPを使用しています生産標本。5-8プラットフォームEMBLグルノーブルでのオープンアクセスモードでインストールされており、タンパク質の複雑な研究​​プロジェクトを加速するために学界と産業界から多くの科学者を支援してきました。

MultiBacシステムによって達成異種タンパク質の強力な同時発現は、 図1d（懸濁細胞培養物を感染後48時間を取ったプローブ）に示されている。過剰発現したタンパク質のバンドは、全細胞抽出物（SNP）と清澄化ライセート（SN）で明確に識別されています。産生されたタンパク質材料の質と量は、多くの場合、 図1eに示されるように、有糸分裂チェックポイント複合MC...

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The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

タンパク質複合体は、重要な細胞機能を触媒する。多くの重要な複合体の詳細な機能と構造解析、組換え生産を必要とします。 MultiBacは、特に真核生物タンパク質及びそれらの複合体を発現するために調整バキュロウイルス/昆虫細胞系である。 MultiBacはオープンアクセスプラットフォーム、およびその有用性を最大化するために開発された標準的な操作手順として実装されました。

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

the-multibac-protein-complex-production-platform-at-the-embl

Research

JoVE Journal

Biology

15.8K ビュー.  EMBL Grenoble Outstation and Unit of Virus Host Cell Interactions (UVHCI) UMR5322. タンパク質複合体は、重要な細胞機能を触媒する。多くの重要な複合体の詳細な機能と構造解析、組換え生産を必要とします。 MultiBacは、特に真核生物タンパク質及びそれらの複合体を発現するために調整バキュロウイルス/昆虫細胞系である。 MultiBacはオープンアクセスプラットフォーム、およびその有用性を最大化するために開発された標準的な操作?...

ビデオ: The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

ロブスターの胃の肉眼解剖、ロブスター属Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

生物学

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

ヒトタンパ​​ク質アトラス内の組織マイクロアレイ、免疫組織化学染色とデジタル化の生産

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

を経て製造複合抗生物質エリスロマイシンをフィーチャーロジック、実験の手順、および異種天然物合成の可能性<em&gt; E大腸菌の</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

途上胚性マウス心臓弁地域からのタンパク質の単離

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...