著者は、アシスタントと科学的な議論について Tessem とハンコックのラボのメンバーに感謝したいと思います。著者は、アンドリュー ・ ニールソン博士 (バージニア工科大学) がココア派生エピカテキン単量体の一部を提供することをありがちましょう。本研究は、JST に糖尿病アクション ・ リサーチと教育財団からの助成金によって支えられました。

1. 細胞培養
<ol><li>文化 INS 1 派生 10% 牛胎児血清 (FBS)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、10 mM HEPES、グルタミン 2 mM、1 mM ピルビン酸ナトリウム 0.05 mM 2-メルカプトエタノール9,10,11 と添加 RPMI 1640 年に 832/13 β 細胞 ,12,13。</li>
	<li>完全な RPMI 1640 メディアの 8 mL を追加して 10 分 Neutralize トリプシンの 37 ° C で培養、0.25% トリプシンの 2 mL を使用して T75 フラスコから 832/13 セルを削除します。</li>
	<li>診断を使用してセルをカウントし、ステップ 1.2 で 900 μ L の PBS からの細胞容積の 100 μ L を希釈します。</li>
	<li>6 2 × 106セル/ml の密度でプレート 832/13 セルはよく料理します。</li>
	<li>呼吸の実験を開始する前に 48 h 37 ° C および 5% CO2で加湿のインキュベーターでの細胞を培養します。</li>
</ol>2. 高解像度呼吸用細胞の調製
<ol><li>
ココアの派生エピカテキン単量体と 832/13 セルを扱います。
	<ol>
<li>37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターでめっき後 24 h の 832/13 細胞を培養します。</li>
		<li>めっき後メディア 24 h に変更し、車両制御 (3 ウェルズ) や 100 nM ココア モノマー (3 井戸)、37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターで追加 24 h (合計 48 h) の文化に続いて 832/13 セルを扱います。</li>
		<li>1 低グルコース分泌の試金 (SAB) のバッファー 5 分吸引バッファー x 832/13 セルを洗浄し、変更低血糖 SAB x 1 時間ごと、3 時間の低血糖 SAB x 1 に 832/13 セルを孵化させなさい。<ol>
<li>33.32 g の NaCl、KCl、1.73 g、KH2PO4MgSO4 0.7 g の 0.82 g を 10 x SAB と H2O 500 mL の最終巻を追加。滅菌フィルター最終的な解決策。</li>
			<li>0.25 M CaCl235 %bsa 溶液、NaHCO3 0.21 g 0.57 mL 作る低血糖 SAB SAB、100 μ L の 45% のグルコース、1 M HEPES、1 mL の 2 mL x 10 の 10 ml × 1 H2O に 100 mL の最終巻を追加。滅菌フィルター最終的な解決策。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
クルクミンと 832/13 セルを扱います。
	<ol>
<li>37 ° C、5% CO2で加湿のインキュベーターでめっき後 48 時間 832/13 細胞を培養します。</li>
		<li>1 低血糖 SAB x 5 分吸引バッファーの 832/13 セルを洗浄し、変更低血糖 SAB x 1 時間ごと、3 時間の低血糖 SAB x 1 に 832/13 セルを孵化させなさい。</li>
		<li>1 低血糖 SAB x 3 時間培養の 2.5 時間後バッファーを吸引し、車両制御と低グルコース SAB または 30 分の 40 μ M クルクミン x 1 のセルを孵化させなさい。次の孵化、バッファーを吸引します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
高解像度の呼吸のトリプシンで細胞を収穫
	<ol>
<li>1 低血糖 SAB x 3 時間培養後 250 μ L/ウェル 0.25% トリプシンのプレートからセルを削除します。</li>
		<li>車両制御または 4 ml を 15 mL の円錐管に SAB の関心の複合治療 3 井戸からトリプシンのセルを結合します。</li>
		<li>診断を使用してセルをカウントし、ステップ 2.3.2 で 900 μ L の PBS からの細胞容積の 100 μ L を希釈します。</li>
		<li>低糖各商工会議所の適切な濃度で 3 mL にする SAB x 1 のセルの適切な数を希釈します。データは、1 × 106セル/mL の濃度が最も有効であることを示します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
高解像度の呼吸の機械的解離でセルを収穫
	<ol>
<li>1 x 3 時間培養後低血糖、SAB は、それぞれに低グルコース SAB もゆっくりと機械的解離でプレートからセル 1000 μ L ピペット チップでピペッティングによる爆破 1 x の 1 mL を追加します。</li>
		<li>車両制御または呼吸のための 15 mL の円錐管に 3 mL SAB の合計への関心の複合治療 3 井戸からセルを結合します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 高解像度の呼吸
<ol><li>高解像度の呼吸の準備。
	<ol>
<li>高解像度の呼吸および呼吸の分析プログラムを起動して、デスクトップに接続します。</li>
		<li>両院から 70% エタノールを吸引します。45 分以上 70% エタノールでこれらの部屋を浸します。</li>
		<li>70% エタノール, 各ステップ後吸引で 2 回部屋を洗ってください。</li>
		<li>3 回で ddH2O、各ステップ後吸引チャンバーを洗います。</li>
		<li>DdH2O. 商工会議所プランジャーをすすいでください。これは、プランジャーとチタン ポートから残留エタノールをクリーンアップします。</li>
	</ol></li>
	<li>ポーラロ グラフ法による酸素センサーの校正。
	<ol>
<li>継続的に 2.0 データ記録間隔と 750 rpm、37 ° C でチャンバー内電磁攪拌バーを使用してバッファーを攪拌各 oxygraph 室に 2.4 x 低グルコース SAB バッファー 1 mL を追加 s f7 キーのボタンを押すと、タブを開く「システム」というラベルの付いた。プランジャーを押すすべての方法で、レンチの曝気設定に撤回し。安定した酸素流量が得られるまで 1 時間の最小値の平衡機をしましょう。</li>
		<li>実験の期間中、37 ° C でマシンを設定します。偏波電圧を 800 に設定 mV、f7 キーのボタンを押すと「酸素、O2」というラベルの付いたタブを開いて 2 ゲインを持つ。酸素濃度の変化が安定している間、少なくとも 30 分間 SAB バッファーの酸素濃度を平衡 (未満 2 pmol/(s*mL))。</li>
		<li>酸素濃度安定化、次の酸素濃度の変化が安定して酸素濃度変化のバック グラウンド測定を確立する地域を選択します。<ol>
<li>Shift キーを押し、マウスを左クリックして選択した領域でマウスをドラッグして領域を選択します。2 つの部屋のそれぞれに対応する、各トレースの選択した領域と"R1"への変更に関連付けられている文字をクリックします。</li>
			<li>左下の「O2校正」ボックスをダブルクリックして、画面の角を右、R1 として「空気校正」の「マークの選択」ボタンをクリック、衆参両院の「調整とクリップボードにコピーします」を選択。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>2.1.5 または 2.2.5 832/13 β 細胞の呼吸の評価は手順で準備。
	<ol>
<li>1 x 低グルコースお手元で 2.4 mL 各商工会議所 (車両処理細胞、化合物の処理セルと 1 つの室を用いて 1 つの区域) のサンプルを読み込む機械的解離方法 (測定後の-20 ° C で凍結) を使用する場合 (ビシンコニン酸) BCA アッセイによってタンパク質濃度の細胞サンプルの 0.5 mL を保持します。<ol>
<li>すべての方法プランジャーを押し、残留量を吸引します。750 rpm とすべての後続のステップの 37 ° C で実験を通して継続的に細胞をかき混ぜます。F4 をクリックしてサンプルが読み込まれるときに「セル」としてラベル付けによって印を作りなさい。</li>
			<li>30 分のサンプルを測定します。信号の安定化後、3.2.3 で説明するように低血糖状態 (2.5 mM グルコース) に対応する酸素濃度変化の領域を選択します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>信号の安定化に達した後は、注射器を使用してポートをロード チタンを通して各商工会議所に 45% 滅菌グルコース溶液 (16.7 mM 最終濃度) の 12.5 μ L を追加します。マーク測定「ブドウ糖」として治療を追加 3.3.1 に記載されているを確認します。Let の信号を安定させるため、安定した酸素流量を達成するまでに細胞呼吸を記録。3.2.3 で説明するように酸素濃度の変更のこの地域を選択します。16.7 mM グルコース読書、刺激条件7に対応します。</li>
		<li>信号の安定化に達した後は、5 mM オリゴマイシン (2.5 μ M 最終濃度) 各チャンバーに読み込みポート経由の 1 μ L を追加します。マーク測定"OligoA"としてトリートメントを追加 3.3.1 に記載されているを確認します。Let の信号を安定させるため、安定した酸素流量を達成するまでに細胞呼吸を記録。3.2.3 で説明するように曲線のこの領域を選択します。オリゴマイシン A は ATP 合成酵素を阻害する、電子と酸化的リン酸化されない7のリークでは唯一酸素磁束発生します。</li>
		<li>信号の安定化に達した後は、最大呼吸が確立されるまで、1 μ L 単位で 1 mM FCCP を追加します。これは最大の共役呼吸を表します。3-4 μ L の間 FCCP 濃度である十分な (1.5-2.0 μ M 最終) INS 1 832/13 セルの最大の共役呼吸を誘発します。治療が追加されるときに、3.3.1 で説明したよう「FCCP」というラベルの付いた印を作りなさい。Let の信号を安定させるため、安定した酸素流量を達成するまでに細胞呼吸を記録。3.2.3 で説明するように曲線のこの領域を選択します。FCCP は、脱共役剤です。これは共役呼吸7を測定することができます。</li>
		<li>信号の安定化に達した後は、読み込みポートを介して各部屋に 5 mM アンチマイシン A の 1 μ L (最終濃度が 2.5 μ M) を追加します。治療が追加されるときに、3.3.1 で説明したよう「アンティア」というラベルの付いた印を作りなさい。Let の信号を安定させるため、安定した酸素流量を達成するまでに細胞呼吸を記録。3.2.3 で説明するように曲線のこの領域を選択します。 注: アンチマイシン A シトクロム C レダクターゼをバインド、ユビキノン酸化を抑制する、すべての呼吸をブロックします。これにより、呼吸7を完全に停止することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 β 細胞タンパク質濃度と呼吸の正規化を測定します。
	<ol>
<li>BCA 法13を使用して測定蛋白質のサンプルをロードで保持されるサンプルの 0.5 mL を使用しています。</li>
		<li>製造元の指示に従って希釈せず、3 通で各サンプルを実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞をトリプシンから 832/13 β 細胞呼吸計算。<ol>
<li>計解析プログラムの F3 ボタンを押してアッセイに mL 使用あたりのセル数を入力します。単位をセル/mL に変更、細胞濃度を入力し、お手元に媒体を変更</li>
		<li>選択し O2校正フォーム 3.2.3 で説明するように入力データを正規化するバック グラウンド測定値を選択します。</li>
		<li>2.5 mM グルコース、16.7 mM グルコース、オリゴマイシン A、FCCP およびアンチマイシン A 3.3.1 に記載からの測定値の選択を行います。</li>
		<li>計解析プログラム内でタンパク質濃度を入力し、呼吸測定時にそれぞれの治療のため適切な平均値を選択後各商工会議所の測定値をエクスポートします。これは F2 をクリックして、クリップボードの機能に「コピー」を押します。その他の解析プログラムで使用するデータをエクスポートします。計算のため「O2斜面ネガティブ"値を使用します。</li>
		<li>車両の 3-5 独立した実行処理コントロールと天然化合物の INS 1 832/13 β 細胞の無傷の細胞呼吸に及ぼす影響を決定するための処理セルは、データをコンパイルします。</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 β 細胞呼吸計算から機械的に細胞を分離しました。<ol>
<li>計解析プログラムの F3 ボタンを押して BCA アッセイからタンパク質計算を入力します。単位を mg に変更、BCA 濃度を入力し、お手元に媒体を変更</li>
		<li>選択し O2校正フォーム 3.2.3 で説明するように入力データを正規化するバック グラウンド測定値を選択します。</li>
		<li>2.5 mM グルコース、16.7 mM グルコース、オリゴマイシン A、FCCP およびアンチマイシン A 3.3.1 に記載からの測定値の選択を行います。</li>
		<li>計解析プログラム内でタンパク質濃度を入力し、呼吸測定時にそれぞれの治療のため適切な平均値を選択後各商工会議所の測定値をエクスポートします。これは F2 をクリックして、クリップボードの機能に「コピー」を押します。その他の解析プログラムで使用するデータをエクスポートします。計算のため「O2斜面ネガティブ"値を使用します。</li>
		<li>車両の 3-5 独立した実行処理コントロールと天然化合物の INS 1 832/13 β 細胞の無傷の細胞呼吸に及ぼす影響を決定するための処理セルは、データをコンパイルします。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Mueckler, M., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SLC2+(GLUT)+family+of+membrane+transporters.">The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes.">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).</li><li>Strat, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+by+which+cocoa+flavanols+improve+metabolic+syndrome+and+related+disorders.">Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders.</a> J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).</li><li>Rowley, T. J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monomeric+cocoa+catechins+enhance+&#946;-cell+function+by+increasing+mitochondrial+respiration.">Monomeric cocoa catechins enhance &#946;-cell function by increasing mitochondrial respiration.</a> J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).</li><li>Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+Respirometry+to+Assess+Mitochondrial+Function+in+Permeabilized+and+Intact+Cells.">High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li><li>Reynolds, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Cell+deletion+of+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors+impedes+mitochondrial+respiration+and+insulin+secretion.">beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).</li><li>Hals, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Respiration+in+Insulin-Producing+beta-Cells:+General+Characteristics+and+Adaptive+Effects+of+Hypoxia.">Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia.</a> PLoS One. 10 (9), e0138558 (2015).</li><li>Ray, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nkx6.1-mediated+insulin+secretion+and+beta-cell+proliferation+is+dependent+on+upregulation+of+c-Fos.">Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos.</a> FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).</li><li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1.">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li><li>Tessem, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nkx6.1+regulates+islet+beta-cell+proliferation+via+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors.">Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).</li><li>Hobson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+Kinase+A+is+critical+for+the+Nkx6.1+mediated+beta-cell+proliferation+pathway.">Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway.</a> Islets. 7 (1), e1027854 (2015).</li><li>Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5r1+Overexpression+Induces+Primary+beta-Cell+Proliferation.">Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation.</a> J Diabetes Res. 2016, 6375804 (2016).</li><li>Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+and+curcumin+enhance+pancreatic+beta-cell+function+by+inhibiting+phosphodiesterase+activity.">Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity.</a> J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).</li><li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+reduces+beta-cell+mitochondria+and+induces+distinct+morphological+abnormalities,+which+are+reproducible+by+high+glucose+in+vitro+with+attendant+dysfunction.">Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction.</a> Islets. 4 (3), 233-242 (2012).</li><li>Chavanelle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high-intensity+interval+training+and+moderate-intensity+continuous+training+on+glycaemic+control+and+skeletal+muscle+mitochondrial+function+in+db/db+mice.">Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice.</a> Sci Rep. 7 (1), 204 (2017).</li><li>Jelenik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Insulin+Resistance+in+Primary+and+Secondary+Nonalcoholic+Fatty+Liver.">Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver.</a> Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).</li><li>Spacek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-stimulated+insulin+secretion+of+insulinoma+INS-1E+cells+is+associated+with+elevation+of+both+respiration+and+mitochondrial+membrane+potential.">Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).</li><li>Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2-Activated+Mitochondrial+Phospholipase+iPLAgamma+Prevents+Lipotoxic+Oxidative+Stress+in+Synergy+with+UCP2,+Amplifies+Signaling+via+G-Protein-Coupled+Receptor+GPR40,+and+Regulates+Insulin+Secretion+in+Pancreatic+beta-Cells.">H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).</li><li>Johnson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressed+insulin+signaling+and+increased+apoptosis+in+CD38-null+islets.">Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets.</a> Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルの目的は、高解像度の呼吸を使用してそのまま膵 β 細胞における呼吸速度を測定することです。このメソッドは、高められたブドウ糖のレベルに β 細胞応答の測定できます。プロトコルは、この自然に発生する単量体エピカテキンやクルクミン4,5プロトコルで示されて様々 な化合物の前処理でできます。?...

膵臓のベータ細胞の主な目的は、グルコース刺激によるインスリン分泌を介してシステムな場合を維持することです。Β 細胞感覚主低親和性、高容量グルコーストランスポーター GLUT2 によりブドウ糖の循環の生理学的変化 (ブドウ糖トランスポーター 2、Km 16.7 mM)1。循環のブドウ糖のレベルの上昇とこの高容量低親和性トランスポーターは β 細胞内でブドウ糖を細胞内に比例して増加を促進します。グルコースは解糖系、TCA サイクル (トリカルボン酸) 細胞 ATP (アデノシン三リン酸) レベルの上昇で、その結果ミトコンドリア呼吸代謝されます。高架の ATP 濃度は ATP 敏感な K+チャネル、膜の脱分極の結果をブロックします。膜の脱分極を引き起こす電圧依存性 Ca2 +チャネルの開口部と小胞の後続のリリース バインド インスリン顆粒2。Β 細胞機能不全を示し、低下し、コントロール不良インスリン分泌と最終的には β 細胞死3(T2D) 2 型糖尿病の特徴です。ダグラス T2D 用治療薬として維持または β 細胞機能を改善するメカニズムを使用できます。
研究は、天然の有益な効果を示している膵 β 細胞4植物化合物。これらの化合物増加 β 細胞の増殖、生存、またはグルコース刺激によるインスリン分泌に効果があります。例として、最近の研究は、エピカテキン単量体ミトコンドリア呼吸の増加を介してのグルコース刺激によるインスリン分泌を高め、レベル5の細胞の ATP を増加を実証しています。したがって、これらの化合物は機能の β 細胞を増やすことができますどのように理解質量は潜在的な治療としてこれらの化合物を活用することが重要です。
細胞呼吸は、ツールの数を測定できます。高解像度計グリセリンまたはそのままのセル人口6化学変調器の滴定の使用します。このツールは、このように幅広い情報を与える異なる濃度で様々 な化合物の添加を許可します。
糖代謝と β 細胞機能との間に親密な関係を考えると、細胞呼吸の測定が重要です。細胞呼吸の測定を行うことができます独自の利点と欠点の7,8のセットを持っているそれぞれのグリセリンまたは無傷のベータ細胞を使用して。Β 細胞の透過電子輸送チェーンのさまざまな側面を測定することができます、なしで β 細胞は、グルコース取り込み代謝呼吸を誘発するメカニズムに関しては。したがって、unpermeabilized のベータ細胞の呼吸の使用は、読み出しとして酸素消費量を使用して様々 な血糖値のレベルに対する β 細胞の応答を判断する非常に有用なテクニックです。
この手法の目的は、そのまま INS 1 の酸素消費量を測定する派生 832/13 β 細胞です。この手法では、条件刺激グルコース (ブドウ糖 16.7 mM) だけでなく、unstimulatory グルコース条件 (2.5 mM グルコース) に対する β 細胞の応答を判断出来ます。Unpermeabilized 細胞を私たちは複合体を個別にテストすることはできません私は、II または III の電子輸送チェーン、手法が複雑な IV 阻害 (オリゴマイシン A) 非呼吸 (FCCP カルボニル シアン化物 - を扱う測定を許可4-(フッ素系低分子) phenylhydrazone)、呼吸 (アンチマイシン A) を完全に抑制します。本研究は、2 つの自然発生する化合物、エピカテキン単量体とクルクミン、β 細胞呼吸に及ぼす影響と同様に、そのまま unpermeabilized 膵 β 細胞における呼吸の測定の有効性を示しています。

<table><tbody><tr><td>O2k Core: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Instrument for high-resolution respirometry</td></tr><tr><td>DatLab 6 Program</td><td>Oroboros Instruments</td><td>27141-01</td><td>Computer program for analysing high-reolution respirometry</td></tr><tr><td>INS-1 832/13 cell line</td><td>Duke University Medical Center</td><td>NONE</td><td>Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard</td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>C7727</td><td>Pre-treatment of beta cells</td></tr><tr><td>Cocoa epicatechin monomer</td><td>Virginia Polytechnic Institute and State University</td><td>NONE</td><td>Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>832/13 beta cell media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3662</td><td>832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Caisson</td><td>GLL01</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>832/13 beta cell media component</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td>Component of 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Component of 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Component of 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Component of 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose Solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Component of 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>35% BSA Solution</td><td>Sigma</td><td>A7979</td><td>Component of 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Component of 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>200 proof ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Washing Oxygraph O2k Chambers</td></tr><tr><td>Oligomycin A</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Chemicals for respiration assay</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Chemicals for respiration assay</td></tr><tr><td>Anitmycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Chemicals for respiration assay</td></tr><tr><td>BCA Protein Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td>For determining protein concentration</td></tr></tbody></table>

high-resolution respirometry to measure mitochondrial function of intact beta cells in the presence of natural compounds

高解像度の呼吸は、分離ミトコンドリア、細胞、組織の酸素消費量の測定が可能です。Β 細胞は、高グルコース濃度に応じてインスリン分泌を制御血糖レベルが体内で重要な役割を果たします。インスリン分泌は、糖代謝とミトコンドリアの呼吸によって制御されます。したがって、そのまま β 細胞呼吸を測定する糖尿病の治療として β 細胞機能を改善することが不可欠です。Β 細胞の細胞呼吸のグルコース濃度の増加の効果を測定することができますを派生そのまま 832/13 プラグイン-1 を使用します。このプロトコルは、ベータ細胞の呼吸を可能にする効果を決定する種々 の化合物の存在の有無で測定することができますそのまま細胞の呼吸に化合物を与えられました。低 (2.5 mM) または高グルコース (16.7 mM) の条件の存在下で β 細胞呼吸に及ぼすクルクミン、エピカテキン単量体、2 つの自然発生する化合物を示します。この手法は、様々 な化合物が異なるグルコース濃度の存在下でそのまま β 細胞呼吸に及ぼす影響を決定する使用できます。

準備され、プロトコルで説明されているように収穫 INS 1 832/13 β 細胞は酸素消費量 (図 1 a) 様々 な化学的介入に基づく変調を示します。呼吸の増加が観測される時グルコース濃度は 16.7 mM グルコース (図 1 b) に増加します。そのままセルはオリゴマイシン A と扱われるとき呼吸が減少します。この呼吸は、基底、nonphosphorylating 呼吸状態として定義?...

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High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

このプロトコルの目的は、高解像度の呼吸を使用してそのまま 832/13 ベータ細胞に及ぼす天然化合物の存在下でのミトコンドリアの呼吸にグルコース依存性の変化を測定するためです。

天然化合物の存在下でそのまま β 細胞のミトコンドリア機能を測定するための高解像度の呼吸

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

high-resolution-respirometry-to-measure-mitochondrial-function-intact

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K ビュー.  Brigham Young University. このプロトコルの目的は、高解像度の呼吸を使用してそのまま 832/13 ベータ細胞に及ぼす天然化合物の存在下でのミトコンドリアの呼吸にグルコース依存性の変化を測定するためです。

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Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

発生生物学

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate the measurement of islet oxygen consumption using a 96-well microplate designed for the measurement of oxygen consumption in spheroids. In this assay, spheroid microplates are coated with a cell and tissue adhesive on the day prior to the assay. We utilize a small volume of adhesive solution to encourage islet adherence to only the bottom of the well. On the day of the assay, 15 islets are loaded directly into the base of each well using a technique that ensures optimal positioning of islets and accurate measurement of oxygen consumption. Various aspects of mitochondrial respiration are probed pharmacologically in non-human primate islets, including ATP-dependent respiration, maximal respiration, and proton leak. This method allows for consistent, reproducible results using only a small number of islets per well. It can theoretically be applied to any cultured spheroids of similar size.

This protocol demonstrates the accurate and reproducible measurement of oxygen consumption in non-human primate pancreatic islets. The islet loading techniques and coating of the microplate provide a framework for efficient measurement of respiration in other types of cultured spheroids.

非ヒト霊長類膵島酸素消費量の分析

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

生化学

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

医学

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

生物学

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

高分解能呼吸測定によるヒト精子細胞の呼吸測定

High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm mitochondrial activity, so the measurement of sperm mitochondrial function is an indicator of sperm quality. High-resolution respirometry is a method of measuring the oxygen consumption of cells or tissues in a closed-chamber system. This technique can be implemented to measure respiration in human sperm and provides information about the quality and integrity of the sperm mitochondria. High-resolution respirometry allows the cells to move freely, which is an a priori advantage in the case of sperm. This technique can be applied with intact or permeabilized spermatozoa and allows for the study of intact sperm mitochondrial function and the activity of individual respiratory chain complexes. The high-resolution oxygraph instrument uses sensors to measure the oxygen concentration coupled with sensitive software to calculate the oxygen consumption. The data are used to calculate respiratory indices based on the oxygen consumption ratios. Consequently, the indices are the proportions of two oxygen consumption rates and are internally normalized to the cell number or protein mass. The respiratory indices are an indicator of sperm mitochondrial function and dysfunction.

著者スポットライト:精子代謝とミトコンドリア機能を解明することで男性不妊症研究を進める 

The analysis of sperm mitochondrial function by high-resolution respirometry permits the measurement of the oxygen consumption of freely moving spermatozoa in a closed-chamber system. The technique can be applied to measure respiration in human spermatozoa, which provides information on sperm mitochondrial characteristics and integrity.

ヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活法

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.

天然化合物の存在下でそのまま β 細胞のミトコンドリア機能を測定するための高解像度の呼吸

要約

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ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

非ヒト霊長類膵島酸素消費量の分析

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

ヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活法

ヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活法

ヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活法

チャンバーおよびプレートベースの呼吸計を使用して細胞および組織の生体エネルギーを評価するための高解像度呼吸法