We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.

注：医学のウェイクフォレストの学校の治験審査委員会によって承認された記載されたプロトコル。インフォームドコンセントを書面で得られた。すべての参加者は23から35までの範囲のBMIで、男女の健全な高齢者（65-79歳）であった。 1.骨格筋生検<ol><li>前述したように、 図9は、O / N絶食後の早朝にすべての生検を行う。生検の前に一週間出血、血小板、または挫傷に影響を与える可能性がアスピリン、処方店頭非ステロイド性抗炎症薬、または他の化合物を服用を控えるように被験者に依頼。また、生検の前に少なくとも36時間、どんな激しい運動を控えるよう、参加者に依頼する。 注：筋肉が広1％リドカインによる局所麻酔下で経皮針を経皮的針生検技術を使用してヘイケボタルから得られる。医学的合併症ないか、またはOTHERはプロシージャから有害事象は、当社の臨床研究ユニットで発生したと報告した。 </li><li>注：記載の生検手順は、バーグストロム10のそれに適合されている。 <ol><li>簡単に説明すると、ローカルで筋肉に侵入しないように注意しながら1％のリドカインを管理する。十分な麻痺を可能にするために10分間の待機期間でこれに従ってください。 </li><li>筋膜下とmyotendonous地域を避け筋肉（挿入と原点との筋肉の中間領域）の腹から生検を取る。 <ol><li>経皮的針（ウィンドウと内側の切断シリンダの切断面を吸引補助再利用可能なデバイス）を使用し、ガイドとしての筋膜の筋膜「ポップ」または抵抗に従ってください。 </li><li>麻酔針で深さを推定し、その後再び狭いメスの刃でそれを感じ、筋膜を通して4〜5ミリメ​​ートルの切開を作る。それは筋肉の中に挿入されるまで、切開部を通して針を進める。 </li><li>集めるウィンドウを持つ複数のサンプルは、異なる方向に回転。前進と異なる方向に経皮的針に2〜4回の筋肉サンプルを抜き出しながら60ccのシリンジを使用して連続的な吸引を適用する。吸引を中止し、針を取り除く。 注：各パス（挿入と針の除去）が分未満を取る必要があります。 </li><li>アシスタントは止血を確立するために5分間のサイトを穿刺するしっかりと圧力をかけています。吸引チューブから針を外し、慎重に窓やバレルから筋肉のサンプルを削除する。 </li></ol></li><li>より多くの筋肉は、上記の手順を繰り返すことによって必要とされる場合は、2番目のパスを作成します。 </li><li> 、鉗子を用いて、筋肉のサンプルから目に見える血の塊を削除するサンプルの重量を量ると、すぐに氷のように冷たいDPBSを含むチューブ内に配置。 注：この方法を使用して、平均収量は150±20 mgである。 </li></ol></li></ol> 2.ミトコンドリアの単離 &lt;OL&gt; <li>たての実験、またはアリコートの日にチャペル·ペリー（CP）とミトコンドリアアッセイソリューション（MAS）のバッファ（ 表1）を調製し、-20℃で保管してください。 -20℃で2.5 mMの濃度と分量や店舗でジメチルスルホキシド中の化合物を調製した。準備の日から2ヶ月以内に-20℃で保存バッファおよび化合物アリコートを使用してください。 </li><li>鋭いハサミとピンセットを使用してサンプルから見える結合組織を削除する。必要であれば、このステップのために解剖顕微鏡を使用しています。徹底的に血液を除去するために、氷冷DPBS緩衝液で検体を3〜4回​​洗う。生検から45以上の分を超えないように注意しながら、できるだけ早く氷のように冷たいDPBSとプロセス上のサンプルを保管してください。慎重に筋肉のサンプルから任意の腱または脂肪組織を除去するための予防策を取る。 </li><li>すぐにはさみの無菌のペアを使用して細かい破片に筋肉組織を切るとPRを含む1ミリリットルのCPIに500μlの一時停止0.2ミリグラム/ g組織の濃度でoteinase（Nagarse）。 RTで5分間のインキュベーションでこれに従ってくださいしてから氷に移す。 </li><li>自動化されたホモジナイザーを用いてNagarseで処理されたみじん切り組織を均質化する。このプロセスを通して氷上にサンプルを保管してください。 10000回転の速度設定で自動ホモジナイザーを用いて、2秒のパルスに対して各組織試料を4回、毎回ホモジナイズする。組織間の蒸留水に続いて70％エタノールでプローブを洗ってください。 </li><li> CP I（1 mlの500μlの）及びCP IIの2倍の体積（2 mlの1ml）を、等量のホモジナイズした組織を洗浄し、600×gで、4℃で遠心分離用チューブに遠心機でコンテンツを収集10分。濡れたチーズクロスを通して上清を渡し、ろ液を収集し、ペレットを廃棄し、したがって非ミトコンドリア画分の大部分を取り除く。 </li></ol> 3.洗濯ミトコンドリア<ol><li> 10で上記のステップからの上清を遠心、000×gで、10分間、4°C。を10,000×g、10分間、4℃でCP IIバッファし、さらに遠心分離機の4ミリリットル中にペレットを一時停止します。 注：まれに、血液の薄いペレットはミトコンドリアのペレットの下に形成されている。その場合には、CPII緩衝液で穏やかな吸引によってミトコンドリアのペレットを削除します。このステップは、十分に、ステップ2で血液を洗い流すことによって回避することができる。 </li><li> CP Iのバッファの2ミリリットルで得られたペレットを一時停止します。この段階で、タンパク質の推定のために、この懸濁液から少量を使用しています。私は上記のようにバッファリングし、遠心機CPの残りのサンプルを懸濁します。ミトコンドリアアッセイソリューション（MAS）の最小量（200μL）で最終ペレットを一時停止します。 メモ：CP Iバッファは、BSAを持っていないため、サンプルは、後に中断されているMASがそれにBSAを持っているのに対し、タンパク質は、この段階でアッセイされる。 </li></ol> 4.見積もりBCAタンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を測定することによるミトコンドリアコンテンツ<pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;注：呼吸計測測定のために、またはウェスタンブロット実験のために24ウェルマイクロプレート上にロードするために使用されるミトコンドリアの量を計算するためにこの濃度を使用してください。タンパク質濃度の計算のために考慮に希釈係数（10）を取る。 ロジャース、GW らによって記載されているように5 XFアッセイを行う。12 NOTE：ピコモルO 2 /分でO 2消費率（OCR）を可視化するか、データ出力中のO 2およびpHの絶対レベル。 <ol><li>化合物を調製するための1x MASを使用する注入される。次のように最終濃度を得たポートのADへの化合物の10倍の濃度を追加します。ポートA、ADP [アデノシン5 &#39;二リン酸、2mMの、50μL];ポートB、オリゴマイシン（2μM、55μL）;ポートC、FCCP [カルボニルシアン化4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン、6μM、60μL];とポートD、2μMのアンチマイシンA（65μL）。準備する井戸の必要な数のための化合物の十分なボリューム。 </li><li>滴定によってミトコンドリアの最適量を決定します。たとえば、負荷1.0μgの、2.5μgの、そしてウェルあたりのミトコンドリアの5.0μgの基質を含む氷冷1X MASの50μl容量で。ウェル間のばらつきを最小限に抑えるために、最初に冷たい1X MAS +基板に10倍のミトコンドリアを希釈。次に、（バックグラウンド補正ウェルを除く）を各ウェルにこの懸濁液50μlをお届け。 </li><li>遠心機で4℃で2000×gで、20分でプレート。各ウェルに、遠心分離した後、軽く1XのMAS +コハク酸（10 mM）をし、ロテノン（2μM）（下記参照初期条件）の450μlを添加する。 XFアナライザにプレートを転送をウェルに均質な遵守を確保するために顕微鏡下でミトコンドリアを表示します。 注：使用される初期条件は、呼吸がETC複合体Iまたは複合体IIのどちらかで駆動されているかどうかに依存します。複合体II主導の呼吸のため、SUを使用ccinate（10 mM）を、初期条件としてロテノン（2μM）。ロテノンブロック複合体Iおよびコハク酸は、複合体II（コハク酸デヒドロゲナーゼ）のための燃料を提供しています。複合体Iによって駆動呼吸を研究するために、初期条件として10mMの最終濃度で5mm以上のグルタミン酸とリンゴ酸各の最終濃度でピルビン酸とリンゴ酸、それぞれのいずれかを使用する。後者は、トリカルボン酸サイクルと基板搬送の間で機能不全とを区別するのに役立つことができる。複合体Iおよび複合体IIの両方で駆動呼吸を研究するために、初期条件としてロテノンまたはリンゴ酸なしでピルビン酸およびコハク酸が含まれています。 β酸化の基質としてミトイルカルニチンを使用してください。 </li><li>順次以前に12を説明したように、それをプログラムすることによって呼吸計を使用してリアルタイムでミトコンドリア呼吸を測定する。 表2に設けられた呼吸の設定を使用してください。 注：次のようにさまざまなミトコンドリア呼吸状態の簡単な説明は以下のとおりです。 </li><li&gt;状態2 =基板存在との結合状態。 ADPを飽和の存在下で呼吸をリン酸化状態3 =;オリゴマイシンにより誘導された状態4 O =非リン酸化呼吸。脱共役剤FCCPによって刺激状態3U =最大の脱共役呼吸。アンチマイシン-Aによる複合体III阻害後の残留非ミトコンドリア呼吸=呼吸。また、ミトコンドリアの濃度と組み合わせたOCR測定の長さは、測定期間中に酸素を枯渇させることにより、データに影響を与える可能性があることが指摘されるべきである。 </li></ol> 6.ウエスタンブロット注：最終サンプル中のミトコンドリアの濃縮を確実にするためにウェスタンブロッティングによってミトコンドリアのマーカーCOX IVおよび全組織GAPDHを決定<ol><li> 12％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルによって単離されたミトコンドリアと全体の組織抽出物を分離する。 </li><li>ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜にタンパク質を移す。</li><li>二次抗体 - 結合、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に続く：COX IV抗体（20,000 1）と共にインキュベートする。 GAPDHの決定のために、GAPDHモノクローナル抗体（1：2000 1）とブロットとプローブを取り除く。 注：ER汚染の違いが懸念される場合は、そのような分析においてERp72、カルネキシン、またはカルレティキュリンなどのERマーカーを含む。 </li></ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle.">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+isolating+rat+brain+mitochondria+with+high+metabolic+activity:+effects+of+EDTA+and+EGTA.">A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA.</a> Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).</li><li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization.">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PloS One. 8, e82392 (2013).</li><li>Chappell, J. B., Perry, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+and+adenosinetriphosphatase+activities+of+skeletal-muscle+mitochondria.">The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria.</a> The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).</li><li>Tyrrell, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respirometric+Profiling+of+Muscle+Mitochondria+and+Blood+Cells+Are+Associated+With+Differences+in+Gait+Speed+Among+Community-Dwelling+Older+Adults.">Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).</li><li>Nicklas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+physical+function+to+vastus+lateralis+capillary+density+and+metabolic+enzyme+activity+in+elderly+men+and+women.">Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women.</a> Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).</li><li>Bergstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Percutaneous+needle+biopsy+of+skeletal+muscle+in+physiological+and+clinical+research.">Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research.</a> Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317 (2011).</li></ol>

The author, George Rogers, is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument used in this article. Open Access fees were supported by Seahorse Biosciences.

単離されたミトコンドリアは、多くの場合、基板搬送とTCAサイクルの機能を含むETC機能の役割を調べる研究、ならびに他のミトコンドリアの活動に利用される。孤立した小器官を使った呼吸アッセイは、酸化的リン酸化の基本的なプロセスや、ETCの固有の特性の直接検査を可能にする全細胞または透過処理筋線維と比較して単離されたミトコンドリアの呼吸計測プロファイリングは、比較的容易なデータ解釈の利点とミトコンドリアの質量/生合成における非ミトコンドリアのプロセスや変更からの「干渉」が存在しないことがあります。データの正規化は、それによって、サンプル間のミトコンドリアの直接的な相互比較を可能にする、ミトコンドリアのタンパク質含有量に基づいている。単離されたミトコンドリアの呼吸計測プロファイリングは、研究の目的は、メカニズムの基礎となる、そのようなETC部品などの特定の標的を同定するかを決定することである好ましい方法であるS /複合体、またはミトコンドリアの輸送メカニズム。 小さな組織試料から筋生検および機能ミトコンドリアの単離のためのプロトコルについて説明する。手がダウンスホモジナイザーを運営に対してこの方法は、自動化されたホモジナイザーの利用にユーザー間の再現性のある結果が得られます。ミトコンドリアの単離は、筋肉組織のわずか20ミリグラムで行うことができる。このサンプルサイズから得ることができる単離されたミトコンドリアの量がさらに分子分析のための他の実験と保存のための余剰ミトコンドリアを残しシーホースプレートベースの呼吸計測を実行するのに十分である。この方法は、ミトコンドリアのより小さな量が（ウェル当たり1〜2μgの）を使用することができるXF 96に変換することができることに留意されたい。 ミトコンドリアを単離するためのいくつかのプロトコルは、初期の組織破壊のためのダウンスホモジナイザーに依存している。この方法の欠点は、実践的な初期組織の性質である均質化。ホモジナイザーで乳棒の力とスピードが事業者6の間に大きく変化することができます。これは、実験間の変動、ならびに実験室対実験室変動をもたらし、実験間のデータを比較することの難しさをもたらすことができる。これは、典型的には、処置前および処置後の、潜在的に複数の部位で、参加者からのデータは別々の時点で採取されたヒトの介入研究で特に懸念される。私たちは、限られた個人対個人の変動をより再現性のある結果が得られ、より一貫性のあるアプローチのための自動化されたホモジナイザーを使用しています。製剤の速度も同時に複数のサンプルを処理するのに適したこのアプローチを行う。典型的には、最大3つの実験を1日で行うことができる。 ここに記載された技術の潜在的な制限は、孤立した小器官の使用とプレートベースのフォーマットを使用することから生じる。例えば、ピカードら 。悪魔を持っている単離されたミトコンドリアは、透過性筋線維における無傷ミトコンドリアのものとは根本的に異なる機能特性を有することがstrated。彼らは、ミトコンドリアの分離技術は、より大きな活性酸素種の生成13を伴って透過性に筋線維と比較して有意に増加したRCRとして、変更された生体エネルギー機能をもたらすことを提案した。透過処理した筋線維と比較して、ミトコンドリアの単離は、長い準備時間を必要としない。また、細胞内容物の損失は、細胞全体、さらには、透過性の繊維内に保持されているものを生理学的関連性を減少させる。記載された技術が許すとプレートベース呼吸計測の使用は、サンプルあたりランを複製する。しかし、ミトコンドリアは、各ウェルの底に接着しなければならない。この構成は、それらの通常の環境とは異なり、機能的特性に影響を及ぼし得る。また、THER、ミトコンドリアの単離のためにこのプロトコルを使用していることに留意すべきである電子は、依然として、ミトコンドリア調製物中の小胞体（ER）からの汚染であってもよい。 ER汚染の違いはミトコンドリアの収率および影響の結果の決定に影響を与え得る。 結論として、この研究は、この手順を使用して組織から単離されたミトコンドリアは、機能的に活性であり、研究/骨格筋サンプルの最小量から高品質の単離されたミトコンドリアを必要とする用途に使用できることを確認するデータを提示する。この方法の利点があることは、i）は、骨格筋の最小量からミトコンドリアを単離することが可能であり、ii）の手順は、iii）のプレートに基づく技術では、同時に複数のサンプルを実行することが可能であり、迅速であるおよびiv）試料保存および他の分子生物学的研究のために生体エネルギーアッセイ後の十分な余剰組織および単離されたミトコンドリアがある。

ミトコンドリアは、細胞内の一次エネルギー生産拠点であり、高齢化に重要な役割だけでなく、心血管疾患、アルツハイマー病、糖尿病、癌、および肥満などの様々な加齢関連疾患を有している。単離されたミトコンドリアの呼吸計測プロファイリングは、電子伝達鎖（ETC）関数の直接分析を提供し、ミトコンドリアの生物学と健康と病気におけるその役割の理解に大きく貢献してきました。単離されたミトコンドリアは、本稿に記載された方法は、ヒト被験体から得られた骨格筋組織生検から単離したミトコンドリアの呼吸計測分析を可能にするために最適化された基板等の輸送、ATPシンターゼ活性、プロトンリークのような生体エネルギー論の様々な側面を研究するために使用される。この原稿に記載されて生検プロトコルは過去12年間、私たちのスタッフが利用されている。当社グループは、様々な年齢の大人に700以上の手順を実行しました90歳までの、および任意の有害な安全性の問題のないさまざまな慢性疾患条件に。このプロトコルの重要な側面は、それが具体的に、それによって臨床調査研究での使用を容易にする、組織の最小量を利用するように設計されていることである。 様々なプロトコルは、ミトコンドリアを単離するために開発されてきた。フェルナンデス- Vizarra ら 1,2は、様々なラット組織ならびに培養細胞からミトコンドリアを単離するための方法を記載した。ガルシア·Cazarin ら 3は、ラットやマウスからの骨格筋からのミトコンドリアを単離する方法を報告している。ラット脳からミトコンドリアを単離するための方法は、イグレシアス、ゴンザレスら 4グロスらによって報告されている。 図5は barocyclerおよび/ ​​またはPCTシュレッダーを使用してミトコンドリアを単離する方法を報告した。最近、フランコら 6抗を使用して、高度に濃縮されたミトコンドリアを単離する方法が報告され-TOM22磁気ビーズ。 これらのプロトコルは、優れた結果をもたらす一方で、組織のサイズ要件は、この原稿に記載された方法に比べて高い。例えば、Gross ら 5は、腓腹筋の1.5〜1.8グラム、および腎臓組織の約2gを使用した。同様に、フランコら 6は、500 mgのマウス肝臓組織を使用する。私たちの経験から、骨格筋の経皮針生検から期待される典型的な収量は、（ 外側広はヘイケボタル ）100〜200 mgの範囲である。ここに記載されたプロトコルを使用して筋肉組織の20〜50 mgのミトコンドリア機能を評価する能力は、生検ごとに複数の評価を実行し、他の分子生物学実験において将来使用するためにサンプルを格納するようにユーザーに許可する。これは臨床研究とサンプルの勤勉な使用を必要とする他の研究で重要な機能です。これは、以前に凍結さミトコンドリアが原因OUTEに結合された呼吸を研究するための良いではないことに留意すべきであるミトコンドリア膜損傷およびチトクロームCの活性の損失をrは。提案手法では、適応とチャペルとペリー7によって発表された方法から変更されている。 この原稿に記載された方法を使用して、我々は最近、ヒト広筋から単離されたミトコンドリアの呼吸計測プロファイルが直接歩行速度8として測定身体能力、と相関するヘイケボタルことを報告している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Equipment</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of the Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer Bio-Gen PRO200</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5804 R</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deepwell late Rotor&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6mm University College Hospital Needle</td>
			<td>Cadence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60cc syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well plate reader</td>
			<td>Tecan (Genios-basic)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seahorse XF 24-3 analyzer</td>
			<td>Seahorse Biosciences, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein gel system</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak Gel Logic 112</td>
			<td>Carestream Health, Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak camera assembly</td>
			<td>Carestream Health, Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;">XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge</td>
			<td rowspan="2">Seahorse Bioscience</td>
			<td>100850-001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100867-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>221473</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>12421-0010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP308</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>A9187</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fatty acid-free BSA</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>126575</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>S0389</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial proteinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>P-8038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M9546</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P284</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>M9272</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>H3784</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA protein assay kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>PI23227</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Succinic Acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>S3674</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvic acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>P5280</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Malic acid*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>2288</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ADP(K+ salt)*</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co</td>
			<td>A5285</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XF Cell mito stress test kit</td>
			<td>Seahorse Biosciences</td>
			<td>101706</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&#160;</td>
			<td>SC-29113</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0343BOX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immobilin Transfer Membranes (0.45um)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH20200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter</td>
			<td>Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td>NP0006-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14734</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies (mAB to GAPDH)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9484</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEF822E001EA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEF812E001EA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy

単離されたミトコンドリアの呼吸計測プロファイリングは、一般に電子伝達鎖の機能を調べるために使用される。我々は、細胞外フラックス（XF）アナライザを使用して、人間の広さヘイケボタルのサンプルを取得する骨格筋組織の最小量からミトコンドリアを単離するための方法、およびプレートベースの呼吸計測プロファイリングを記載する。ミトコンドリアの1.0、2.5および5.0μgのを使用して得られた呼吸プロファイルの比較は、1.0μgの呼吸を測定するのに十分であると5.0μgの標準誤差の比較に基づいて、最も一貫性のある結果を提供することをことを示している。ミトコンドリアマーカーCOX IVおよび非ミトコンドリアの組織マーカーのGAPDHのための単離されたミトコンドリアのウェスタンブロット分析は、このプロトコルを使用して制限された非ミトコンドリアの汚染が存在することを示している。筋肉組織のわずか20 mgのミトコンドリア呼吸計測を研究する能力は、ユーザが、臨床試験で複数のエンドポイントの個々の生検を利用することを可能にする研究プロジェクト。

図1は、全体のプロトコルの詳細なフローチャートを示している。 COX IV / GAPDH（ 図2）のウェスタンブロットプロファイルは、ミトコンドリアタンパク質、COX IV、及び非ミトコンドリアマーカー、GAPDHの発現を示す。 COX IVおよびGAPDHの両方の発現は、全体の筋肉溶解物において明らかである。ミトコンドリアは、このプロトコルに記載された技術を用いて単離された後、GAPDHは、同じ露出で休んでいる間に、COX IVバンドは依然として明らかである。長い曝露は、かすかなGAPDHバンドを公開してもよい。これらのブロットは、単離されたミトコンドリアは、最小限の非ミトコンドリアの汚染を持っていることを示している。さらに、単離されたミトコンドリアにおけるCOX IV発現は、サンプル間の一貫性があります。 図3は 1.0μgの、2.5μgの、及びミトコンドリアの5.0μgのを使用して、複合体II（コハク酸およびロテノン）で駆動される典型的な呼吸計測プロファイルを示す。予想されるように、全体的なOCRはワット増加するi番目のミトコンドリアの高い量。このアッセイのために計算された呼吸調節比（RCR）は、ミトコンドリア調製物が高品質であることを示す、7.95。さらに、状態3uのOCRは、ミトコンドリアの品質を確認し、状態3のそれよりもわずかに高い。 ミトコンドリアの異なる量をプロファイルするとき、結果の一貫性を比較するために、我々は、ANOVA（分散分析）を行い、1.0μgの、2.5μgのを使用して分散の実際の値と二乗和（SS）を計算し、ミトコンドリアの5.0μgのあたりにロードよく（ 図4）。 SSは、状態2、状態3、状態3uに、アンチマイシンA、およびRCRのために提示されている。状態2と状態3の測定のために、一方向ANOVAを（それぞれp &lt;0.01およびp &lt;0.05）、統計的に有意であった。同様に、一方向ANOVAをマイシン及びRCRた（p &lt;0.01およびp &lt;0.0001ための統計的に有意であった、それぞれ有意差は群間状態3uに見られなかった。のThESEの結果は、ウェルあたりのミトコンドリアの5.0μgの他の濃度に比べて最低のSSを与え、参加者の私達の人口はXF 24システムで使用する最適な量であることを示している。 図5は、ミトコンドリアタンパク質が初期筋標本の大きさに基づいて予測することができる量を示すためのガイドとして機能する。予想されるように処理された筋肉量（mg）の量は、最終試料の総ミトコンドリアのタンパク質含有量（mg）との間には強い相関がある。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> チャペル·ペリーバッファI（CPI） </td></tr><tr><td>化学物質</td><td>濃度</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 100 mMの</td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mMの</td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mMの</td></tr><tr><td> MgSO 4を</td><td> 5 mMの</td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 mMの</td></tr&gt; <tr><td> pHは</td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> チャペル·ペリーバッファーII（CPII） </td></tr><tr><td>化学物質</td><td>濃度</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 100 mMの</td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mMの</td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mMの</td></tr><tr><td> MgSO 4を</td><td> 5 mMの</td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0.2 mMの</td></tr><tr><td>脂肪酸フリーのBSA </td><td> 0.50％ </td></tr><tr><td> pHは</td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ミトコンドリアアッセイソリューション（MAS）（2X） </td></tr><tr><td>化学物質</td><td>濃度</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td> 35 mMの</td></tr><tr><td>マンニトール</td><td> 110 mMの</td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2.5 mMの</td></tr><tr><td>のMgCl 2 </td><td> 2.5 mMの</td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1.0 mMの</td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.5 mMの</td></tr><tr><td>脂肪酸フリーのBSA </td><td> 0.10％ </td></tr><tr><td> pHは</td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 複合体II初期条件とミトコンドリアアッセイソリューション（MAS） </td></tr><tr><td>化学物質</td><td>濃度</td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td>コハク酸塩</td><td> 10 mMの</td></tr><tr><td>ロテノン</td><td> 2μM </td></tr><tr><td> pHは</td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 複合体I初期条件とミトコンドリアアッセイソリューション（MAS） </td></tr><tr><td>化学物質</td><td>濃度</td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸塩</td><td> 5 mMの</td></tr><tr><td>リンゴ酸塩</td><td> 5 mMの</td></tr><tr><td> pHは</td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> *すべてのバッファは、脱イオン水で作られる</td></tr></tbody></table> 表1.液、緩衝レシピ。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> プロトコルステップ </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> コマンド </td><td> 時間（分） </td><td> ポート </td></tr><tr><td>調整する</td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td>待って</td><td> 10.00 </td><td></td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td>待って</td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td>待って</td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td>メジャー</td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td>メジャー</td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td>注入する</td><td></td><td> A </td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td>メジャー</td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td>注入する</td><td></td><td> B </td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td>メジャー</td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td>注入する</td><td></td><td> ℃ </td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td>メジャー</td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td>注入する</td><td></td><td> D </td></tr><tr><td>ミックス</td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td>メジャー</td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> 表2.ミックス、測定、および呼吸のための周期設定を混在させる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> プロトコル全体の図1のフローチャート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; 図2.全骨格筋組織、ならびに単離されたミトコンドリアのための代表的なウエスタンブロット。全組織抽出物、ならびに単離されたミトコンドリアは、非ミトコンドリアの制御のためのミトコンドリアマーカーとGAPDH抗体としてCOX IV抗体で免疫ブロットした。いいえGAPDHバンドは、非ミトコンドリアのソースからほとんど、あるいは全く汚染を示す単離されたミトコンドリアでは観察されなかった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> 人間広筋から単離されたミトコンドリアの図3.代表呼吸計測プロファイルがヘイケボタル 。単離されたミトコンドリアの3つの濃度を、5.0μgの、2.5μgの、及び1.0μgの我々<html>このアッセイで使用される再。ポート注射後の化合物の最終濃度は2 mMのADP（ポートA）であった。 2μMのオリゴマイシン（ポートB）; 6μMFCCP（ポートC）;と（ポートD）をアンチマイシン2μM。この実行のための計算されたRCRは7.95だった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> 5.0μgの、2.5μgの、及び1.0μgのミトコンドリアを使用して、異なるミトコンドリア呼吸の状態とRCRのための正方形の図4.二乗の合計合計。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; 。筋肉の量（mg）および総ミトコンドリアタンパク質の収量（mg）を： 図5は、これは、初期の筋肉試料重量回帰分析に基づいて予測することができるミトコンドリアタンパク質の量を推定するためのガイドとして使用することができる 。予想されるように、筋肉の量および得られた総ミトコンドリアタンパク質との間の直接的な正の相関がある。

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Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

広筋のヘイケボタルの生検、精製されたミトコンドリアの準備、および呼吸計測プロファイリングのための方法が記載されている。小さな筋肉量の使用は、臨床研究用途のためにこの技術に適しています。

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

preparation-respirometric-assessment-mitochondria-isolated-from

Research

JoVE Journal

Medicine

19.2K ビュー.  Wake Forest School of Medicine.  広筋のヘイケボタルの生検、精製されたミトコンドリアの準備、および呼吸計測プロファイリングのための方法が記載されている。小さな筋肉量の使用は、臨床研究用途のためにこの技術に適しています。 

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

単離骨格筋のミオ - 機械的分析

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

医学

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

プロテオミクスから骨格筋の性別二型

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

経胸壁心エコー検査による肺動脈狭窄のマウスモデルにおける右室の構造と機能の評価

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&amp;#246;m Technique

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

変更されたベルイストローム法を用いたヒト骨格筋生検手順

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Substernal Thyroid Biopsy Using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the lack of a standardized definition for STG. Biopsy is often required to differentiate benign from malignant lesions. Unlike cervical thyroid, the overlying sternum precludes ultrasound-guided percutaneous fine needle aspiration of STG. Consequently, surgical mediastinoscopy is performed in the majority of cases, causing significant procedure related morbidity and cost to healthcare. Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration (EBUS-TBNA) is a frequently used procedure for diagnosis and staging of non-small cell lung cancer (NSCLC). Minimally invasive needle biopsy for lesions adjacent to the airways can be performed under real-time ultrasound guidance using EBUS. Its safety and efficacy is well established with over 90% sensitivity and specificity. The ability to perform EBUS as an outpatient procedure with same-day discharges offers distinct morbidity and financial advantages over surgery. As physicians performing EBUS gained procedural expertise, they have attempted to diversify its role in the diagnosis of non-lymph node thoracic pathologies. We propose here a role for EBUS-TBNA in the diagnosis of substernal thyroid lesions, along with a step-by-step protocol for the procedure.

Substernal thyroid lesions are common, and need to be differentiated from malignancy. Obtaining percutaneous fine needle biopsy is not possible due to its retrosternal location. This article proposes a protocol for biopsy of substernal thyroid lesions using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration (EBUS-TBNA).

気管支超音波ガイド下経気管支穿刺吸引を使用して、胸骨下甲状腺生検

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real time images with a 15 &#181;m axial resolution at an effective tissue penetration of 2-3 mm. Within the OCT images the loss of signal intensity per millimeter of tissue penetration, the attenuation coefficient, is calculated. The attenuation coefficient is a tissue specific property, providing a quantitative parameter for tissue differentiation. 
Until now, renal mass treatment decisions have been made primarily on the basis of MRI and CT imaging characteristics, age and comorbidity. However these parameters and diagnostic methods lack the finesse to truly detect the malignant potential of a renal mass. A successful core biopsy or fine needle aspiration provides objective tumor differentiation with both sensitivity and specificity in the range of 95-100%. However, a non-diagnostic rate of 10-20% overall, and even up to 30% in SRMs, is to be expected, delaying the diagnostic process due to the frequent necessity for additional biopsy procedures. 
We aim to develop OCT into an optical biopsy, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication provides a detailed step-by-step approach for percutaneous, needle based, OCT of renal masses.

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is a high resolution imaging technique that allows analysis of tissue specific optical properties providing the means for tissue differentiation. We developed needle based OCT, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication describes a method for percutaneous, needle based OCT of renal masses.

生体内 、経皮、ニードルベース、腎大衆の光コヒーレンストモグラフィーで

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real ...

Povidone Iodine Rectal Preparation at Time of Prostate Needle Biopsy is a Simple and Reproducible Means to Reduce Risk of Procedural Infection

Single institution and population-based studies highlight that infectious complications following transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy (TRUS PNB) are increasing. Such infections are largely attributable to quinolone resistant microorganisms which colonize the rectal vault and are translocated into the bloodstream during the biopsy procedure. A povidone iodine rectal preparation (PIRP) at time of biopsy is a simple, reproducible method to reduce rectal microorganism colony counts and therefore resultant infections following TRUS PNB.
All patients are administered three days of oral antibiotic therapy prior to biopsy. The PIRP technique involves initially positioning the patient in the standard manner for a TRUS PNB. Following digital rectal examination, 15 ml&#160;of a 10% solution of commercially available povidone iodine is mixed with 5 ml&#160;of 1% lidocaine jelly to create slurry. A 4 cm x 4 cm sterile gauze is soaked in this slurry and then inserted into the rectal vault for 2 min after which it is removed. Thereafter, a disposable cotton gynecologic swab is used to paint both the perianal area and the rectal vault to a distance of 3 cm from the anus. The povidone iodine solution is then allowed to dry for 2 - 3 min prior to proceeding with standard transrectal ultrasonography and subsequent biopsy.
This PIRP technique has been in practice at our institution since March of 2012 with an associated reduction of post-biopsy infections from 4.3% to 0.6% (p = 0.02). The principal advantage of this prophylaxis regimen is its simplicity and reproducibility with use of an easily available, inexpensive agent to reduce infections. Furthermore, the technique avoids exposing patients to additional systemic antibiotics with potential further propagation of multi-drug resistant organisms. Usage of PIRP at TRUS PNB, however, is not applicable for patients with iodine or shellfish allergies.

Here, we present a protocol for use at the time of transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy (TRUS PNB) that is a simple and cost-effective means to reduce infections following the procedure.

前立腺針生検の時のポビドンヨード直腸準備手続き感染のリスクを軽減するためにシンプルで再現性のある手段であります

Single institution and population-based studies highlight that infectious complications following transrectal ultrasound guided prostate needle biopsy ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

人間<em&gt;外側広筋</emワイル・ブレークスリーConchotomeを使用&gt;骨格筋生検

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...