この方法により、ヒト以外の霊長類やヒトなどの関連種の少数の小島からの酸素消費量を定量化し、ミトコンドリア機能の評価を可能にする。この技術は少数の一次小島で実行でき、技術的な複製を増やし、複数の条件のテストを可能にし、アッセイの厳格さと再現性を向上させることができます。この技術は、糖尿病でしばしば損なわれ、成功した島の移植の重要な予測者である島の機能およびインスリン分泌の主要な確定であるミトコンドリアの健康を評価する。
島が移入後の井戸の中心に局在していることを確認することが不可欠です。そうしないと、酸素消費量の測定に一貫性がありません。この手順を実証する, ヴァレリー リッチャルディ, 私の研究室で働く学部生.
アッセイの前日に、2.8ミリリットルの0.1モル重炭酸ナトリウム溶液に細胞および組織接着剤を200マイクロリットル加え、得られた溶液の20マイクロリットルを96ウェルスフェロイドマイクロプレートの各ウェルの底に加える。すべての気泡がピペットチップから取り除かれていることを確認します。すべての井戸が積み込まれたら、プレートを37°Cの非二酸化炭素インキュベーターに入れる。
1時間後、無菌環境内でプレートから細胞粘着液を吸引し、37度の無菌水の400マイクロリットルで各ウェルを2回洗浄します。その後、ウェルを30〜40分間空気乾燥させてから、プレートを覆って摂氏4度で一晩保管します。センサーカートリッジを水和するには、滅菌環境でセンサーカートリッジパッケージを開き、内容物を取り外します。
ユーティリティプレートの隣にセンサーカートリッジを逆さまに置き、ユーティリティプレートの各ウェルに200マイクロリットルの無菌水を充填します。すべての井戸が積み込まれたら、センサーカートリッジをユーティリティプレートに下げ、組み立てたセンサーカートリッジとユーティリティプレートを摂氏37°Cの非二酸化炭素インキュベーターに一晩置きます。アッセイの日に、センサーカートリッジの蓋を取り外し、ユーティリティプレートの井戸から水をデカントします。
各ウェルに200ミリリットルのプリウォームキャリブラントを加え、センサーカートリッジの蓋を交換します。その後、センサーカートリッジをインキュベーターに約1時間戻します。移管のために小島を調製するために、組み立てられた培地を含む60%15ミリメートルの細胞培養皿に小島を100%近い純度に選ぶ。
すべての島が採取されたら、調製したスフェロイドマイクロプレートの各ウェルに175マイクロリットルの組み立て培地をセットし、P20ピペットを15マイクロリットルにセットして、細胞培養皿から15マイクロリットルの培地に15個の小島を吸引します。小島をスフェロイドマイクロプレートに播種するには、ピペットチップをウェルの底まで下げ、先端を持ち上げるのがやっとで、約5マイクロリットルの培地をゆっくりと分配します。小島を井戸に積み込むには、小島をピペットチップに落ち着かせ、少量の中でウェルセンターの底の真上に静かに放出します。
すべての島がピペットチップを離れ、時折顕微鏡の下でスフェロイドマイクロプレートをチェックし、小島がプレートの底に播種され、ウェルの側面にくっついないことを確認します。すべての島が移された場合は、マイクロプレートを37°Cの非二酸化炭素インキュベーターに入れる。アッセイ手順を開始する前に、20マイクロモルオリゴマイシンの20マイクロリットル、22マイクロリットルの新たに調製された10マイクロモルFCCPのポートB、および25マイクロモルロテロンAAの25マイクロリットルでポートCをセンサーカートリッジのポートAにロードします。次に、30分のベースライン呼吸時間、42分間のオリゴマイシン測定期間、30分のFCCP期間、および30分のロテノーネAA期間に対する細胞外フラックス分析アッセイをプログラムする。
次に、センサーを校正し、マイクロプレートを挿入するための画面の指示に従ってアッセイを実行します。このアッセイプレートへの島分送については、図示した15マイクロリットルの培地で15個の島を吸引する必要があります。この技術は、各マイクロプレートウェルの底中央に島を一貫して配置し、正確な酸素消費測定を可能にします。
個々の井戸の酸素消費量を示すこの代表的な実験では、井戸の負荷が低く、酸素消費量のベースラインレベルが非常に低く、FCCPに対する反応はほとんどありませんでした。この実験では、ほとんどの井戸は、薬物に対する有意なベースライン呼吸および応答を実証した。しかし, 2 つの井戸はロテノーネに応答を示さなかった, 薬物が適切に井戸に放出されないことを示唆.
これらの井戸はさらなる分析から除外された。ここでは、ウェルに島が適切にロードされ、薬物を正しく注射された成功したアッセイの結果が観察できる。試薬とプレートを調製する試薬とプレートは、試薬を調製する前に、それらが単離または受信された直後に使用されるように、試薬とプレートを実行する必要があります。
アッセイ後、この小島は、タンパク質またはDNA抽出のために回収して、酸素消費量データを正規化するか、ミトコンドリアDNA含有量を定量化することができる。少数の一次霊長類小島でミトコンドリア機能を測定する能力は、単一の生物学的複製における複数の薬物および他の操作の検査を可能にする。原始霊長類の小島で働く個人は、これらの組織で適切かつ安全な取り扱いの訓練を受けるべきである。
特に、適切な個人用保護具の使用およびこれらのサンプルの適切な廃棄。
