Name: isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
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NIH がサポートした調査は、AI102838、AI117739 (CRW) を付与します。リチャード ・ Rossoll は、技術支援を感謝いたします。DartLab、Dartmouthsupported (P30CA023108 - 37) と (P30GM103415-15) で共有リソースのフローサイトメトリーによる解析を行った。

ヒトを対象研究は、ヘルシンキ宣言の表現の原則に基づき実施されました。研究は、ダートマス大学治験審査委員会との人間被験者保護 (CPHS) の委員会によって承認されました。書面によるインフォームド コンセントは、ダートマス Hitchcock 医療センター (レバノン、ニューハンプシャー) で子宮を受ける HIV 陰性女性から術前に得られました。訓練を受けた病理医は、EM、CX、ECX には、病変と病理のサイトから遠いから組織サンプルを選択しました。ダートマス Hitchcock 医療センターで募集されたボランティアの健康なドナーから血液サンプルを得た。献血者は匿名だった。手術室から新鮮単離の EM、CX、ECX の組織は、分離と分類以前独立した滅菌ポリプロピレン チューブの研究室に転送するために移されました。
1 組織の酵素の消化力
注: 滅菌材料を使用し、生物学的安全キャビネットで働きます。
<ol><li>変更されたハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) 1 x HBSS を用いたフェノール赤、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、0.35 g/L NaHCO3、および 20 mM HEPES を準備します。</li>
	<li>酵素カクテルを準備 (2 mg/mL D-グルコース ・ HBSS、450 U/mL コラゲナーゼ IV, 0.01% [wt/巻] デオキシリボヌクレアーゼに変更)。ソリューションを滅菌 0.22 μ m フィルターを通過します。理想的には、消化酵素を使用、当日準備が、ストレージの-20 ° C で凍結することができます。繰り返しの凍結と融解の繰り返しは避けてください。</li>
	<li>変更された HBSS 100 × 15 mm2シャーレ内の場所と組織をすすいでください。利用可能な組織の量に基づくシャーレ サイズと使用される酵素カクテルのボリューム調整 (1.4.2 以下の手順を参照してください)。 注: 組織は、1 10 g に至る理から得られる手術のサンプルによってサイズが異なります。</li>
	<li>使い捨てメスと鉗子の物理的な処理:<ol>
<li>切削しながら乾燥を防ぐためにティッシュに消化酵素カクテル約 3 mL を追加します。</li>
		<li>組織を安定化し、カクテルの消化酵素にさらされている組織の表面積を高めるためメスでミンチに鉗子を使用します。小さな断片 (側の < 2 mm) に組織を切断します。すべての組織の部分 (組織の 5 mL/g) をカバーする十分な消化酵素カクテルを追加します。シャーレに蓋を配置します。</li>
		<li>45 分回転速度は徹底的にこぼしたり、泡を生産せず消化酵素カクテルをミックス確認のため約 80 rpm で回転上 5% CO2と 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>4 X を倒立顕微鏡で組織の準備作業と 10 X 目標を視覚化します。 注: 消化力の後小さな組織片と見える上皮腺を含む混合細胞懸濁液になければならない (図 1A参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 単一のセルの物理的な分離
<ol><li>無菌環境で 150 × 15 mm2シャーレにホルダーにピンと張った 250 μ m メッシュを配置します。メッシュがペトリ皿の表面上約 0.5 cm であることを確認します。</li>
	<li>ウェットは 2 ml の変更された HBSS のメッシュとメッシュに消化組織を転送します。</li>
	<li>10 mL シリンジのプランジャーの平らな面を使用して、優しく、しっかりと、挽くメッシュを通して消化みじん切りにした組織です。 注意: 研削も積極的にメッシュを損傷し、細胞の死亡率を高めます。この手順は、結合組織、粘液から上皮細胞と間質細胞 (免疫細胞を含む) が分離されます。</li>
	<li>組織片を徹底的に分散させた、一度昇格メッシュとホルダー上にペトリ皿 3 mL でリンス 2 ~ 3 cm 変更 HBSS で追加のセルを回復します。</li>
	<li>細胞懸濁液を収集します。ペトリ皿と変更された HBSS の 2 mL でウェットにホルダーを 20 μ m メッシュを配置します。メッシュを保持メッシュを通して細胞懸濁液を注ぐ 2-3 cm シャーレと変更された HBSS の 6 mL でリンス。 メモ: この手順は、メッシュを通過する単一セルから、上に残されている上皮シートを区切ります。流れによる混合細胞懸濁液は免疫細胞や間質線維芽細胞です。</li>
	<li>混合細胞懸濁液と 10 分間吸引液 500 × g で遠心分離を収集し、密度勾配遠心法修正 HBSS 4 mL にペレットを再懸濁します。</li>
	<li>ないブレーキ付け層の混合細胞懸濁液 3 mL 以上 polysucrose ソリューションと 500 x g で部屋の温度で 30 分間遠心します。Polysucrose ソリューションの上から白いバンドを収集し、PBS で洗浄します。 注: この分数は濃縮混合細胞懸濁液、免疫細胞が豊富ですし、いくつかの間質線維芽細胞が含まれています。</li>
</ol>3. 死んだ細胞の除去
注: 死んだ細胞 (> 20%) の大きいパーセントが密度勾配遠心分離後濃縮混合細胞懸濁液に存在する磁気ビーズの死んだ細胞の除去が推奨です。死んだ細胞は、彼らは肯定的な磁気ビーズの選択プロセスを妨げる可能性がありますので削除する必要があります。
<ol><li>対物レンズ 10 倍の顕微鏡で診断を使用してセルをカウントします。濃縮混合細胞懸濁液 (500 × g、10 分、4 ° C) のすべてのセルをスピンダウンします。完全に吸引し、上清を破棄します。1 x 107合計のセルごと (ライブとデッド)、製造元の指示に従って死んだ細胞除去ビーズの 100 μ L を追加します。15 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>磁気の列に 30 μ m フィルターを配置、細胞懸濁液を適用し、ビード標識細胞は、磁気の列を該当します。</li>
	<li>推奨 (3 mL) として死んだ細胞の除去バッファーの列をすすいでください。生きた細胞を含む流れを収集します。死んだ細胞を除去した後の細胞回復の範囲は、図 1 bに提示されます。 注: これらの細胞は染色表現型研究 (セクション 5) のフローサイトメトリーを実行する使用ことができますまたは DC アイソレーション (セクション 4) に進みます。</li>
</ol>4. DC 正磁気ビーズの選択による浄化
<ol><li>次の死んだ細胞の除去 (ステップ 3.2)、セルをスピンダウン、上清を除去、1 x 10 の7セル (PBS、0.5% 熱不活化 AB 血清 (HS)、2 ミリメートルの EDTA) あたり 80 μ L 磁気選択バッファー内細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>DC 集団の肯定的な選択は、製造元の指示 (20 1 x 10 の7セルあたり μ L 磁気ビーズ) に従って CD1a または CD14 の磁気ビーズを追加します。4° Cで 15 分間インキュベートします。
</li>
	<li>磁気選択バッファーを持つセルを洗って、スピンダウン バッファーを完全に削除します。500 μ L 磁気選択バッファーの最小の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>磁石に列を添付し、残りの細胞塊を保持する列の上に 30 μ m のフィルターを追加します。フィルターおよび列磁気選択バッファー推奨されているようにすすいでください。</li>
	<li>細胞懸濁液を列に適用します。磁気選択バッファーで 3 回を洗い流してください。</li>
	<li>15 mL チューブに列を転送磁気選択バッファー 5 mL を追加して、列の選択したセルを解放するプランジャーを適用します。</li>
	<li>純度を高め、新しいカラムを使用して回復した細胞と手順 4.4 4.6 を繰り返します。磁気ビーズを選択した後の細胞回復の範囲は、図 1で示されます。</li>
</ol>5. 細胞純度の評価: 流れの Cytometry と顕微鏡
<ol><li>フローサイトメトリー用染色抗体:<ol>
<li>20% を含む PBS 100 μ L の 10 の6セル × 1 まで再懸濁します熱非動化 Fc 受容体をブロックし、氷で 10 分間インキュベートする HS。</li>
		<li>追加希望蛍光標識抗体と死んだ細胞の同定のための試薬 (例については、セクション 6.5 を参照してください)。蛍光マイナス ゲートを確立し、補償のための単一染色コントロールを準備する補償ビーズを使用する 1 つの (FMO) コントロールを設定します。抗体の例を表 1に示した。光から保護、4 ° C で 20 分間インキュベートします。</li>
		<li>2 ml の磁気選択バッファーのセルを洗浄します。 メモ: EDTA の存在は細胞のフローサイトメトリーによる解析の凝集の形成を避けるために重要です。スピン ・ ダウンと上澄みを廃棄します。</li>
		<li>チューブあたり 2% パラホルムアルデヒド溶液 100 μ L を追加することによって、セルを修復します。</li>
		<li>流れの cytometer10,11のサンプルを分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(例えばcytospin) 列をスピンし、ギムザ染色形態を分析するを使用します。<ol>
<li>磁気選択バッファーを 200 μ l 添加の細胞を再懸濁します。</li>
		<li>スピン列と 5 分スピンで読み込みます。スライドが完全に乾燥しなさい</li>
		<li>脱イオン水でスライド浸漬リンス 2 分の 100% メタノールでスライドを修正し、それを空気乾燥を許可します。</li>
		<li>標準ライト-ギムザ染色を行います。エオシンでセルをカバーし 10 分間インキュベート、脱イオン水で洗浄し、乾燥させてください。ライツ Geimsa 染色した細胞をカバー、1 分間インキュベート、脱イオン水ですすいでください、エアーで乾燥させます。</li>
		<li>倒立顕微鏡 (図 2 a、40 × 対物) と準備を確認します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6 DC 細胞機能を評価するために同種の刺激法
<ol><li>解凍冷凍の末梢血単核球 (PBMCs)<ol>
<li>10% の細胞培養媒体を暖かい 37 ° c. に HS</li>
		<li>凍結細胞培地量が少ないまま、cryotube までに、37 ° C の水浴中、cryotube を配置することによって、PBMCs を解凍します。無菌環境で、cryotube の内容を 10% に予め温めておいた細胞培地 10 mL に転送 15 mL チューブに HS。</li>
		<li>遠心分離機 〜 500 x g で 7 分間、メディアを取り出して、ペレットを分散、10%、HS と遠心分離機の細胞培養媒体の 10 mL で、PBMCs を再懸濁しますセル。</li>
		<li>洗浄ステップを 3 回繰り返します。セルをカウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ナイーブ T 細胞の選択:<ol>
<li>負の淘汰磁気抗体細胞選択キットを使用すると、製造元のプロトコルに従ってナイーブ T 細胞を分離します。</li>
		<li>分離後 CD45RA と CCR7 抗体を用いて純度を確認します。 注: 一般的な純度です > 99% ナイーブ T 細胞です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ナイーブ T 細胞増殖染料染色:<ol>
<li>細胞増殖の染料、染料を光への暴露から保護する 2 x 溶液の 600 μ L を準備します。</li>
		<li>ナイーブ T 細胞 2 を洗う PBS で x。500 μ L の PBS のセルを再懸濁します。</li>
		<li>軽くボルテックス中キャビネット、バイオ セーフティにおける細胞はナイーブ T 細胞に増殖染料 500 μ L を追加します。</li>
		<li>37° Cで 10 分間細胞をインキュベートします。
</li>
		<li>10% の細胞培養媒体の 5 mL を追加することによって細胞ラベリングを停止のセルに HS。光から保護、5 分間氷の上を孵化させなさい。</li>
		<li>細胞を遠心分離機 ~ 7 分、500 x g メディアを吸引し、10% の細胞培養媒体の 4 ° C で細胞を再懸濁します HS。3 洗浄の合計にさらに 2 回を繰り返します。最後の遠心分離前にカウントするセルの因数を取る。 注: 通常、最終的なナイーブ T 細胞の数は 5% と初期の PBMC 細胞数の 15% の間が範囲です。</li>
		<li>10% の細胞培養媒体の細胞を再懸濁します目的細胞濃度で HS。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC 同種ナイーブ T 細胞共培養:<ol>
<li>1:15 で孤立した Dc と 96 ウェル、丸底板のナイーブ T 細胞をプレート Dc T 細胞の比率。Dc 範囲 3,000 〜 5,000 細胞/ウェル間の最適な数を確認します。</li>
		<li>プレートを遠心分離機 ~ セルは、井戸の中心にあるように 3 分間 500 × g。細胞間接触が発生する適切なシグナリングのために重要です。</li>
		<li>37 ° C で 6 日間インキュベートします。井戸のように増殖が発生した (図 3 a) 顕微鏡による細胞のクラスターを監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フローサイトメトリー評価増殖する染色します。<ol>
<li>6 日後、フローサイトメトリーによる細胞を調べることができます。フローサイトメトリー用共培養を染色します。</li>
		<li>PBS で黄色性色素 (最大排出量 572 nm) の 2 x ソリューションを準備します。 注: 血清なし PBS の使用は重要な血清としてタンパク質、色素を妨げる)。</li>
		<li>細胞をプレートを遠心分離機 ~ 500 × g で 5 分。</li>
		<li>上清の 100 μ L を削除します。 注: この時点で収集し、可溶性因子の分離解析の上清を保存します。</li>
		<li>PBS で 2 回細胞を洗う: PBS の 150 μ L/ウェルを追加、遠心分離機 〜 5 分 500 × g を 150 μ L ピペットで上澄みの削除します。各ウェルに残った上清を 50 μ l 添加があることを確認します。</li>
		<li>2 x 性色素の 50 μ L を各ウェルに追加します。光から保護、10 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>、インキュベーション中に目的とする抗体のマーカーのマスターの混合物を準備します。たとえば: CD3 APC/Cy7, PE CD4, CD8 FITCなど
</li>
		<li>各ウェルに抗体の混合物を追加します。光から保護、10 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>2 セルを洗浄して PBS + 2% x HS: PBS + 2% の 150 μ L/ウェルを追加 HS。遠心分離機 〜 5 分削除 150 μ L ピペットで上澄みの 500 x g。</li>
		<li>100 μ L/ウェル 2% パラ ホルムアルデヒドを追加することによって、セルを修復します。必要な場合: ポリプロピレン流れ cytometry チューブに細胞とメディアを転送します。チューブは 4 ° C で保管し、フローサイトメトリーによる解析まで、光から保護できます。</li>
		<li>流れの cytometer で読み取りチューブ。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+sex+hormones+in+immune+protection+of+the+female+reproductive+tract.">The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract.</a> Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+monocyte-derived+cells:+Two+complementary+and+integrated+functional+systems.">Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems.</a> Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).</li><li>Tagliani, E., Erlebacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+function+at+the+maternal-fetal+interface.">Dendritic cell function at the maternal-fetal interface.</a> Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).</li><li>Kaldensjo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intraepithelial+and+stromal+Langerin+and+CCR5+positive+cells+in+the+human+endometrium:+potential+targets+for+HIV+infection.">Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection.</a> PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).</li><li>Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+dendritic+cell+populations+during+the+normal+menstrual+cycle.">Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).</li><li>Ballweber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+langerhans+cells+nonproductively+transporting+HIV-1+mediate+infection+of+T+cells.">Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells.</a> J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).</li><li>Hladik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+events+in+establishing+vaginal+entry+and+infection+by+human+immunodeficiency+virus+type-1.">Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1.</a> Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).</li><li>Duluc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+human+vaginal+APC+subsets+in+directing+T-cell+responses.">Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).</li><li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+flow+cytometry+data:+a+guide+for+the+perplexed.">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).</li><li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+isolation,+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples.">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Givan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+leukocytes+in+the+human+female+reproductive+tract:+comparison+of+fallopian+tube,+uterus,+cervix,+and+vagina.">Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina.</a> Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).</li><li>Rodriguez-Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+from+the+human+female+reproductive+tract+rapidly+capture+and+respond+to+HIV.">Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).</li><li>Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+susceptibility+to+HIV+infection+of+CD4++Th17+cells+in+the+human+female+reproductive+tract.">Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract.</a> Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).</li><li>Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune+cells+and+infection+by+HIV+in+human+ovarian+tissues.">Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues.</a> Am J Reprod Immunol. , (2017).</li></ol>

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粘膜 Dc、組織3に入る彼らの表現型と機能が変更された組織の環境の影響を強く珍しいセル人口です。血が派生した Dc が非常に有用なモデル、完全に DC の個体数と組織での多様性を反映しません。そのため、粘膜 Dc のユニークな特性を理解する組織からの一次電池の分離が必要です。Frt 社の別の解剖学的サイトから Dc の分離では、DC 機能の in vitro研究し、DC サブセ?...

Frt 社は、着床と妊娠1しながら病原体からの保護のデュアル機能を有しています。これを達成するためには、ユニークな組織学的、免疫学的、および機能特性1を表示するそれぞれの解剖学的領域で、frt 社を区分します。
Dc の粘膜表面に存在する肺、腸、生殖管における微生物との接触し、潜在的な病原体2免疫監視を提供します。DCs は、首相のナイーブ T 細胞と免疫3をトリガーするユニークな能力を持っています。Frt 社の Dc も専門にする精子や胎児、妊娠の成功4を許可するなどの外国の抗原を容認します。そのため、場所によっては、DC の表現型と機能が、異なっています。それは彼らの数、表現型、および関数は、3存在する組織環境によって変更するよう Dc が組織環境によって強く影響を受けている知られています。したがって、FRT Dc は、感染症、妊娠、および、FRT でがんに果たす役割を理解し、居住者の Dc を派生の DC モデルが FRT 組織に規制の複雑さに対処する十分な血から、勉強する必要があります。
人間の組織の評価バイオハザード Dc 細胞粘膜組織中に存在数が少ないと人間の組織サンプルを入手できないのために困難です。Dc は、免疫組織化学5,を使用して6にして、組織内のセル位置について通知が機能研究を排除、細胞マーカー分析することができますを識別する数に制限は FRT で研究されています。一度に。また、フローサイトメトリーによる解析のための単一のセル隔離のプロトコル開発7,8,9をされています。これらのプロトコルの一部は移行これらのセルを隔離する Dc の渡り鳥の容量を活用します。これらのメソッドは、通常夜通し孵化し活性化された Dc の選択を必要とするが、定常状態における DCs の研究を可能にしません。
ここでは、子宮摘出標本を使用して、子宮内膜 (EM)、FRT で異なる解剖学的サイトから Dc を分離するためのプロトコルを最適化されたコルポ (CX) と、子宮頸膣部 (ECX)、表現型および機能解析を可能にします。非蛋白分解酵素の消化力のプロトコルを使用して、細胞の活性化せず細胞分離と流れフローサイトメトリー評価組織消化後すぐに進めることができます。フローサイトメトリー マルチ カラーを使用して、機能に関する細胞の低い数字を適応、我々 を識別でき、ビームステアの異なるサイトの Dc のまれなサブセットを特徴付ける

<table><tbody><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30015.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Hyclone</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002140</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldritch</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um Stericup 500 mL&amp;nbsp; filter</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm polystyrene petri dish</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 15mm polystyrene petri dish</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 25mm polystyrene dish</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Treated cell culture dish</td></tr><tr><td>Isotemp Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FICO3500TABB</td><td>5.0% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>American Rotator V</td><td>American DADE</td><td>R4140</td><td></td></tr><tr><td>250 um nylon mesh</td><td>Sefar</td><td>03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>20 um nylon mesh</td><td>Sefar</td><td>03-20/14</td><td></td></tr><tr><td>Beckman GS-6R Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>358702</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldritch</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Pre-separation filter (30um)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-410</td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS multi-stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>CD1a Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-001</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 670 cell proliferation dye</td><td>eBiosciences</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>96 well round bottom plate</td><td>Falcon</td><td>9/8/2866</td><td></td></tr><tr><td>Zombie yellow viability dye</td><td>Biolegend</td><td>423104</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC/Cy7, anti-human</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>25-0038-T100</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PE, anti-human</td><td>eBiosciences</td><td>12-0048-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC, anti-human</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0086-T100</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B43618</td><td>10 color, VBR</td></tr><tr><td>MACSquant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>8 color, VBR</td></tr></tbody></table>

isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies

ひと樹状細胞 (Dc) 粘膜組織における居住者の特性は、サンプルの取得の難しさのために挑戦し、組織あたりの Dc の低い数字を提示します。まだ、組織環境によって表現型と Dc の機能を変更すると、組織 DC 住民を分析、血が不完全な Dc を得られるので組織で DCs の複雑さを反映する必要は。人間女性の生殖器官 (FRT) 子宮摘出標本を用いた表現型および機能解析を可能にするから Dc を分離するためのプロトコルをご紹介します。プロトコルは、肯定的な磁気ビーズの選択に続いて、細胞懸濁液を混合、1 つのセルを生成する組織消化で構成されます。私たちの組織の消化力のプロトコルはない表面マーカーを切断一晩培養や細胞活性化せず、定常状態における DCs の表現型および機能分析が可能。このプロトコルは、他の免疫細胞の種類の分離または他の組織からの Dc の分離の合わせることができます。

図 1 a; のように、次の組織消化、上皮と腺のリリースを観察できます。この酵素の消化力が成功したことを示す肯定的なコントロールです。それぞれ、生菌数および組織の 1 グラムあたり回復の Dc の数は図 1 bと図 1は表示も。5-30% 密度遠心分離12,13前に間?...

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Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

人間の女性の生殖器官から樹状細胞の表現型および機能研究の分離

ここで分離し、その表現型および機能特性評価のための人間の女性の生殖器官の別の解剖学的なコンパートメントから樹状細胞を浄化する手法について述べる。このメソッドは、他の免疫細胞やその他の粘膜組織から樹状細胞を分離する合わせることができます。

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

isolation-dendritic-cells-from-human-female-reproductive-tract-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K ビュー.  Geisel School of Medicine at Dartmouth. ここで分離し、その表現型および機能特性評価のための人間の女性の生殖器官の別の解剖学的なコンパートメントから樹状細胞を浄化する手法について述べる。このメソッドは、他の免疫細胞やその他の粘膜組織から樹状細胞を分離する合わせることができます。

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Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their antigen presentation and T cell activation capacities. Since most vaccinations of experimental tumor models require millions of DC, they are widely isolated from the bone marrow or spleen. However, these DC significantly differ from blood and tumor DC in their responses to immune complexes (IC), and presumably to other Syk-coupled lectin receptors. Importantly, given the sensitivity of DC to danger-associated molecules, the presence of endotoxins or antibodies that crosslink activation receptors in one of the isolating steps could result in the priming of DC and thus affect the parameters, or at least the dosage, required to activate them. Therefore, here we describe a detailed protocol for isolating MoDC from blood and tumors while avoiding their premature activation. In addition, a protocol is provided for MoDC activation with tumor IC, and their subsequent analyses.

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Monocyte-derived DC (MoDC) can sense minor amounts of danger-associated molecules and are therefore easily primed. We provide a detailed protocol for the isolation of MoDC from blood and tumors and their activation with immune complexes while highlighting key precautions that should be considered in order to avoid their premature activation.

マウス単球由来樹状細胞とその後続の in Vitro活性化腫瘍免疫複合体との隔離のプロトコル

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

がん研究

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

マウス肺樹状細胞の分離

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

免疫・感染学

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

生物学

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

マウスの腸からの樹状細胞およびマクロファージの単離とキャラクタリゼーション

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.