Name: isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies at JoVE.com

NIH tarafından desteklenen çalışma AI102838 ve AI117739 (CRW) verir. Richard Rossoll teknik yardım için teşekkür ederiz. Akış sitometrik analiz DartLab, Dartmouthsupported (P30CA023108-37) tarafından ve (P30GM103415-15) paylaşılan kaynak gerçekleştirilmiştir.

İnsan denekler içeren çalışmalar Helsinki Bildirgesi içinde ifade edilen ilkelere göre yapılmıştır. Çalışmalar Dartmouth kolej Kurumsal değerlendirme Komitesi ve komite için koruma, insan denekler (CPHS) tarafından kabul edildi. Yazılı Onam hysterectomies Dartmouth Hitchcock Tıp Merkezi (Lübnan, NH) geçiren HIV-negatif kadın ameliyattan önce elde edildi. Eğitimli patologlar EM, CX ve ECX, patolojik lezyonlar içermez ve patoloji sitelerden uzak doku örnekleri seçilir. Kan örnekleri Dartmouth Hitchcock Tıp Merkezi işe gönüllü sağlıklı bağışçılardan elde edilmiştir. Kan Bağış anonim. Ameliyathane taze izole EM, CX ve ECX dokulardan patoloji yalıtım ve sınıflandırma önceki bizim laboratuvar ayrı, steril polipropilen borular içinde transfer etmek için transfer.
1. Enzimatik sindirim dokuların
Not: biyolojik Emanet dolabı iş ve steril malzemeler kullanabilirsiniz.
<ol><li>Değiştirilmiş bir Hank'in dengeli tuz çözüm (1 x HBSS fenol red, 100 U/mL penisilin-streptomisin, 0.35 g/L NaHCO3ve 20 mM HEPES ile kullanarak HBSS) hazırlayın.</li>
	<li>Enzimatik kokteyl hazırlamak (değiştirilmiş HBSS, 450 U/mL collagenase IV, %0.01 [wt/vol] deoksiribonükleaz ben ve 2 mg/mL D-glikoz). Çözüm bir steril 0,22 µm filtreden geçmek. İdeal olarak, sindirim enzim kullanımı gününde hazırlamak, ancak depolama için-20 ° C'de dondurulmuş olması. Tekrarlanan dondurma ve çözme döngüleri kaçının.</li>
	<li>Değiştirilmiş HBSS ve 100 x 15 mm2 Petri kabına yerde dokuyla durulayın. Doku mevcut miktarına göre Petri kabına boyutu ve kullanılan enzim kokteyl hacmi ayarlayın (bkz. Adım 1.4.2 aşağıda). Not: Dokulara bağlı olarak 1-10 g arasında değişen patoloji, elde edilen cerrahi örnek boyutu değişir.</li>
	<li>Fiziksel işlem tek kullanımlık neşter ve Forseps ile:<ol>
<li>Sindirim enzim kokteyl yaklaşık 3 mL kesme iken kurutma önlemek için doku ekleyin.</li>
		<li>Forseps doku stabilize etmek ve sindirim enzim kokteyl maruz doku yüzey alanını artırmak için bir neşter ile bin dereden su getirmek için kullanın. Doku küçük parçalara (< 2 mm bir tarafta) kes. Tüm doku parçaları (5 mL/g doku) karşılamak için yeterli sindirim enzim kokteyl ekleyin. Kapağı üzerinde Petri kabına yerleştirin.</li>
		<li>%5 CO2 yaklaşık 80 rpm 45 dk. rotator hız iyice sindirim enzim kokteyl dökülmesini veya baloncuklar üreten olmadan karışımları olduğunu sağlamak için bir rotator 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Doku hazırlık ile ters bir ışık mikroskobu ile 4 X ve 10 X hedefleri görselleştirin. Not: sindirim sonra küçük doku parçaları ve bir karma hücre süspansiyon görünür epitel bezleri de dahil olmak üzere mevcut olmalıdır ( şekil 1A' ya bakınız).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. fiziksel ayırma tek hücre
<ol><li>Steril bir ortamda, gergin 250 µm mesh sahibi ile 150 x 15 mm2 Petri kabına yerleştirin. Mesh yaklaşık 0.5 cm Petri kabına yüzeyi üzerinde olduğundan emin olun.</li>
	<li>Mesh ile değiştirilmiş HBSS 2 mL ıslak ve sindirilmiş doku mesh üzerine aktarın.</li>
	<li>10 mL şırınga dalgıç düz yüzeyini kullanarak, nazikçe ama sıkıca, sindirilmiş kıyılmış doku mesh ile eziyet. Dikkat: çok agresif taşlama, mesh zarar ve hücre ölüm artırmak. Bu adımı epitel hücreleri ve stromal hücreler (bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere) bağ dokusu ve mukus ayrı.</li>
	<li>Doku parçaları iyice dağınık sonra mesh ve tutucu yükseltmesine 2-3 cm yukarıda Petri kabına ve durulama 3 mL ile değiştirilen ek hücreleri kurtarmak için HBSS.</li>
	<li>Hücre süspansiyon toplamak. 20 µm mesh sahibi ile bir Petri kabına ve ıslak değiştirilmiş HBSS 2 mL ile yerleştirin. Hücre süspansiyon tutan mesh mesh dökün 2-3 cm yukarıda Petri kabına ve durulama ile değiştirilmiş HBSS 6 mL. Not: Bu adımı kafes geçmek tek hücrelerden üst korunur epitel sayfaları ayrı olacak. Akış yoluyla bağışıklık hücreleri ve stromal fibroblastlar içeren bir karma hücre askıya alınmasıdır.</li>
	<li>Karma hücre süspansiyon ve 10 dk. aspiratı sıvı 500 x g, santrifüj toplamak ve Pelet yoğunluk gradient Santrifüjü için değiştirilmiş HBSS 4 ml resuspend.</li>
	<li>Karma hücre süspansiyon üzerinde 3 mL polysucrose çözüm ve 30 dk için 500 x g de oda sıcaklığında santrifüj fren yok ile katman. Beyaz bant polysucrose çözüm tepesinden toplamak ve PBS ile yıkayın. Not: Bu kesir bağışıklık hücreleri zengindir ve bazı stromal fibroblastlar içeren zenginleştirilmiş karma hücre askıya alınmasıdır.</li>
</ol>3. ölü hücre kaldırma
Not: ölü hücreleri (> %20) büyük bir yüzdesi yoğunluk gradient Santrifüjü sonra zenginleştirilmiş karma hücre süspansiyon varsa, manyetik boncuklar ile ölü hücre kaldırma önerilir. Ölü hücreleri olumlu manyetik boncuk seçim süreci ile girişime neden olabilir beri kaldırılması gerekir.
<ol><li>Bir hemasitometre 10 X amacı ile hafif bir mikroskop kullanarak hücreleri saymak. Spin aşağı zenginleştirilmiş karma hücre süspansiyon (500 x g, 10 min, 4 ° C) tüm hücrelerde. Tamamen Aspire edin ve süpernatant atın. Ölü hücre kaldırma boncuk başına 1 x 107 toplam hücreleri (canlı ve ölü), üreticinin yönergelerine göre 100 µL ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>30 µm filtre manyetik sütunun üstüne yerleştirin, hücre süspansiyon uygulamak ve manyetik sütunu boyunca düşmeye boncuk etiketli hücreleri sağlar.</li>
	<li>Ölü hücre kaldırma arabellek sütununda önerilen (3 mL) yıkayın. Canlı hücreleri içeren aracılığıyla akış-toplamak. Ölü hücre çıkarıldıktan sonra hücre Kurtarma aralığı şekil 1Badımında sunulur. Not: Bu hücreler phenotypical çalışmalar (Bölüm 5) Boyama Akış Sitometresi gerçekleştirmek için kullanılabilir veya DC yalıtım (Bölüm 4) ile devam edin.</li>
</ol>4. DC arıtma olumlu manyetik boncuk seçime göre
<ol><li>Ölü hücre kaldırma (Adım 3.2), spin hücreleri aşağı, süpernatant kaldırmak ve 1 x 107 hücreleri (PBS, % 0.5 ısı inaktive insan AB serumu (HS), 2 mM EDTA) başına 80 µL manyetik seçimi arabellek hücre Pelet resuspend.</li>
	<li>DC nüfus pozitif seçim için üreticinin yönergelerini (20 µL manyetik boncuklar başına 1 x 107 hücreleri) göre CD1a veya CD14 manyetik boncuklar ekleyin. 4° c de 15 dakika kuluçkaya
</li>
	<li>Manyetik seçimi arabellek hücrelerle yıkama, spin aşağı ve arabellek tamamen kaldırın. En az 500 µL manyetik seçimi arabelleği hücrelerde resuspend.</li>
	<li>Mıknatıs için sütun ekleyin ve 30 µm filtre üst kısmında kalan herhangi bir hücre kümeleri korumak için sütun ekleyin. Filtre ve sütun olarak tavsiye manyetik seçimi arabelleği ile yıkayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon sütun için geçerlidir. 3 kez manyetik seçimi arabellek ile yıkayın.</li>
	<li>Sütun bir 15 mL tüp transfer manyetik seçimi arabellek 5 mL ekleyin ve pistonu sütun Seçili hücrelerden serbest bırakmak için geçerlidir.</li>
	<li>Saflık artırmak için yeni bir sütun kullanarak kurtarılan hücrelerle adımları 4.4-4,6 yineleyin. Manyetik boncuk seçimden sonra hücre Kurtarma aralığı şekil 1 ciçinde sunulur.</li>
</ol>5. hücre saflık değerlendirilmesi: Akış Sitometresi ve mikroskopi
<ol><li>Antikor: Akış Sitometresi için boyama<ol>
<li>1 x 100 µL 106 hücrelerde resuspend % 20 içeren PBS, ısı-Fc reseptörü engellemek ve buz üzerinde 10 min için kuluçkaya HS inaktive olur.</li>
		<li>İstenen fluorescently antikorlar ve ölü hücreleri tanımlanması için reaktif etiketli ekleyin (örneğin, Bölüm 6.5 bakın). Floresans eksi bir (FMO) denetimleri kapıları kurmak ve tek leke denetimleri için tazminat hazırlamak için tazminat boncuk kullanmak için ayarlayın. Antikorların kullanılan örnek Tablo 1' de verilmiştir. Işıktan korunan 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Manyetik seçimi arabelleğinin 2 mL hücrelerle yıkayın. Not: EDTA varlığı akış sitometrik çözümlemesi için topaklanma hücre oluşumunu önlemek önemlidir. Spin aşağı ve süpernatant atın.</li>
		<li>Hücreleri % 2 paraformaldehyde çözüm tüp başına 100 µL ekleyerek düzeltmek.</li>
		<li>Örneklerinde bir Akış Sitometresi10,11tarafından analiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sütun (örneğin, cytospin) spin ve Morfoloji analiz etmek için boyama Giemsa kullanın:<ol>
<li>Manyetik seçimi arabelleği 200 µL hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Bir spin sütun ve 5 min için spin yük. Tamamen kurumasını slayt izin.</li>
		<li>Slayt Slayt deiyonize su ile %100 metanol 2 dk. durulama için daldırma tarafından tamir ve kuru hava sağlar.</li>
		<li>Bir standart Wrights-Giemsa boyama gerçekleştirmek. Eozin hücrelerle kapak ve 10 dakikadır kuluçkaya, deiyonize su ile yıkayın ve kurumaya bırakın. Wrights Geimsa leke hücrelerle kapak, 1 dk. için kuluçkaya, deiyonize suyla durulayın ve kuru hava.</li>
		<li>Hazırlıklar bir ters mikroskopla (şekil 2A, 40 X hedef) inceleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. allojeneik stimülasyon tahlil DC hücre işlevi değerlendirmek için
<ol><li>Dondurulmuş periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) çözme<ol>
<li>Hücre kültür medya % 10 ile sıcak HS ile 37 ° c</li>
		<li>PBMCs kadar donmuş hücre medya az miktarda cryotube içinde kalır 37 ° C su banyosu cryotube koyarak çözülme. Steril bir ortamda 10 mL % 10 ile Önceden ısıtılmış hücre kültür ortamının cryotube içeriğini aktarmak HS 15mL tüp içinde.</li>
		<li>Santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 7 dakika süreyle medyayı çıkarın, pelet dağıtmak, PBMCs 10 ml %10 HS ve santrifüj ile hücre kültür ortamının resuspend hücreleri.</li>
		<li>Yıkama adım üçüncü kez tekrarlayın. Hücreleri saymak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saf T-hücre seçimi:<ol>
<li>Bir negatif seçim manyetik antikor hücre seçimi kiti üreticinin protokole göre saf T-hücreleri belirlemek için kullanın.</li>
		<li>Yalıtım sonra CD45RA ve CCR7 antikorları kullanarak saflık denetleyin. Not: > %99 saf T-hücreleri tipik Saflık derecesi var.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saf T-Hücre proliferasyonu boya boyama:<ol>
<li>Hücre çoğalması boya, boya ışığa maruz kalma korumak, 2 x çözümünün 600 µL hazırlayın.</li>
		<li>Saf T-hücreleri 2 yıkama x PBS ile. 500 µL PBS hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Yavaşça vortexing Biyogüvenlik kabini, hücrelerde nükleer silahların yayılmasına karşı boya 500 µL saf T-hücreleri ekleyin.</li>
		<li>37° c de 10 dakika için hücreleri kuluçkaya
</li>
		<li>5 mL % 10 ile hücre kültür medya ekleyerek hücre etiketleme durdurmak hücrelere HS. Işıktan korunan 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Senaryo Özeti santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 7 dk, medya Aspire edin ve 4 ° C % 10 ile hücre kültür ortamının hücrelerde resuspend HS. İki kez daha 3 yıkar toplam için yineleyin. Bir aliquot önce son Santrifüjü saymak için hücre al. Not: Normal olarak, % 5 ve ilk PBMC hücre sayısı % 15 arasında son saf T-hücre sayı aralığı olacaktır.</li>
		<li>Hücre kültür medya % 10 ile hücrelerle resuspend istenen hücre konsantrasyonu, HS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC allojeneik saf T hücreli ortak kültür:<ol>
<li>01: 15'de izole DCs ve saf T-hücreleri bir 96-şey, yuvarlak alt plaka, plaka T-hücreleri DC'lere oranı. DCs aralıkları arasında 3000 ve 5000 hücre/iyi için en uygun numarası sağlamak.</li>
		<li>Plaka santrifüj kapasitesi ~ 500 x g hücreleri iyi merkezinde yer alan olduğundan emin olmak 3 dakika. Hücre hücre iletişim yapılmasına uygun sinyal için önemlidir.</li>
		<li>37 ° C'de için 6 gün kuluçkaya. Nükleer silahların yayılmasına karşı mikroskobu (şekil 3A) ile gerçekleştiği sırada wells görünür hücreleri, küme izlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış Sitometresi nükleer silahların yayılmasına karşı değerlendirmek için boyama:<ol>
<li>6 gün sonra hücreleri Akış Sitometresi tarafından incelenebilir. Akış Sitometresi için ortak kültür leke.</li>
		<li>Sarı canlılığı boya PBS (maksimum emisyon 572 nm) 2 x çözeltisi hazırlamak. Not: PBS kullanmadan serum önemli, serum proteinler boya ile müdahale).</li>
		<li>Senaryo Özeti ile plaka santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 5 min için.</li>
		<li>100 µL süpernatant ile kaldırın. Not: Bu noktada toplamak ve süpernatant çözünür faktörler ayrı analiz için saklayın.</li>
		<li>Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın: PBS 150 µL/kuyu eklemek, santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 5 min için bir pipet ile süpernatant ile 150 µL kaldırın. Her kuyuya kalan süpernatant ile 50 µL olduğundan emin olun.</li>
		<li>2 x canlılığı boya 50 µL her şey için ekleyin. Oda sıcaklığında ışıktan korunan 10 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Kuluçka sırasında istenen antikor işaretleri ana karışımı hazırlayın. Örneğin: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC, vb
</li>
		<li>Her şey için antikor karışımı ekleyin. Oda sıcaklığında ışıktan korunan 10 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreler 2 yıkama x PBS + %2 HS: PBS + %2 150 µL/iyi eklemek HS. Santrifüj kapasitesi ~ 500 x g 5 dk. 150 kaldırmak µL süpernatant bir pipet ile için.</li>
		<li>Hücreleri 100 µL/de %2 para-formaldehit ekleyerek düzeltmek. Gerekirse: Polipropilen Akış Sitometresi tüpler için hücreleri ve medya aktarma. Tüpler 4 ° C'de muhafaza ve akış sitometrik çözümlemesi kadar gelen ışık, korumalı.</li>
		<li>Akış Sitometresi tüplerde okunur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+sex+hormones+in+immune+protection+of+the+female+reproductive+tract.">The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract.</a> Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+monocyte-derived+cells:+Two+complementary+and+integrated+functional+systems.">Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems.</a> Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).</li><li>Tagliani, E., Erlebacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+function+at+the+maternal-fetal+interface.">Dendritic cell function at the maternal-fetal interface.</a> Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).</li><li>Kaldensjo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+intraepithelial+and+stromal+Langerin+and+CCR5+positive+cells+in+the+human+endometrium:+potential+targets+for+HIV+infection.">Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection.</a> PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).</li><li>Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+dendritic+cell+populations+during+the+normal+menstrual+cycle.">Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).</li><li>Ballweber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+langerhans+cells+nonproductively+transporting+HIV-1+mediate+infection+of+T+cells.">Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells.</a> J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).</li><li>Hladik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+events+in+establishing+vaginal+entry+and+infection+by+human+immunodeficiency+virus+type-1.">Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1.</a> Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).</li><li>Duluc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+of+human+vaginal+APC+subsets+in+directing+T-cell+responses.">Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).</li><li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+flow+cytometry+data:+a+guide+for+the+perplexed.">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).</li><li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection,+isolation,+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples.">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Givan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+leukocytes+in+the+human+female+reproductive+tract:+comparison+of+fallopian+tube,+uterus,+cervix,+and+vagina.">Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina.</a> Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).</li><li>Rodriguez-Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+from+the+human+female+reproductive+tract+rapidly+capture+and+respond+to+HIV.">Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).</li><li>Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+susceptibility+to+HIV+infection+of+CD4++Th17+cells+in+the+human+female+reproductive+tract.">Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract.</a> Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).</li><li>Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune+cells+and+infection+by+HIV+in+human+ovarian+tissues.">Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues.</a> Am J Reprod Immunol. , (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Mukozal DCs şiddetle doku3girdiğinizde hangi onların fenotip ve işlev değişiklikleri doku çevre tarafından etkilenmiş bir nadir hücre nüfus vardır. Kan türetilmiş DCs çok kullanışlı bir model vardır, onlar tamamen dokularda bulunan DC nüfus çeşitliliği temsil etmemektedir. Bu nedenle, Mukozal DCs benzersiz özellikleri anlamak için birincil hücre dokuları yalıtım gereklidir. Yalıtım DC'lerin FRT farklı anatomik sitelerden DC işlevi vitro çalışma ve DC al...

FRT implantasyon ve gebelik1izin verirken patojenlere karşı korumanın çift işlevi vardır. Bunu yapmak için FRT, görünen benzersiz histolojik, immünolojik ve fonksiyonel özellikleri1her anatomik bölge ile bölümlere.
DCs Mukozal yüzeyler mevcut mikroplar akciğer, gut ve genital sistem ile ulaşın ve olası patojenler2için immün gözetim sağlayın olun. DCs saf T-hücreleri Başbakan ve adaptif bağışıklık yanıtı3tetiklemek için benzersiz yeteneği var. DCs FRT içinde de sperm ve başarılı gebelik4izin vermek için gelişmekte olan fetus bulunanlar gibi yabancı antijenleri tolere uzmanlaşmıştır. Bu nedenle, DC fenotip ve işlev konumuna bağlı olarak farklı olacaktır. Öyle ki onların numarası, fenotip ve işlevleri3bulundukları doku çevre tarafından değiştirilir DCs şiddetle doku çevre tarafından etkilenmiştir bilinir. Bu nedenle, bulaşıcı hastalıklar, gebelik ve FRT Kanserinde FRT DCs oynadığı rol, ikamet DCs türetilmiş DC modelleri FRT dokularda bulunan düzenleyici karmaşıklığı gidermek yetersiz kan beri incelenecektir anlamalısın.
İnsan dokusu karakterizasyonu ikamet DCs zorlu hücre içinde Mukozal doku mevcut düşük sayı ve insan doku örnekleri alınırken zorluk nedeniyle. DCs kullanarak doku içinde hücre konumu hakkında bilgilendirir ama fonksiyonel çalışmalar önler ve analiz edilebilir hücre işaretleyicileri tanımlama sayısı sınırlı immünhistokimya5,6, FRT incelenmiştir hemen. Ayrıca, tek hücre izolasyon protokolleri akış sitometrik analizi için gelişmiş7,8,9olmuştur. Bu protokollerin bazıları, geçiş hücreleri izole etmek için DCs göçmen kapasitesi avantajlarından yararlanın. Bu yöntemler genellikle gece incubations ve aktif DCs yelpazesi gerektirir ancak DCs çalışmada kararlı duruma için izin vermez.
Burada, histerektomi örnekler kullanarak, biz optimize DCs FRT, endometrium (EM), farklı anatomik sitelerden yalıtmak için bir protokol endocerviks (CX) ve ectocervix (ECX), phenotypical ve fonksiyonel analiz sağlar. Proteolitik Enzimatik sindirim protokolünü kullanarak, biz hemen sonra doku sindirim olmadan hücre aktivasyonu hücre izolasyon ve akım sitometrik karakterizasyonu için devam edebilirsiniz. Çok renkli Akış Sitometresi kullanarak ve fonksiyonel çalışmalar hücre düşük numaraları için adapte, biz tanımlamak ve DCs FRT. farklı sitelerdeki nadir kümelerine karakterize

<table><tbody><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30015.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Hyclone</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002140</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldritch</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um Stericup 500 mL&amp;nbsp; filter</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm polystyrene petri dish</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 15mm polystyrene petri dish</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 25mm polystyrene dish</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Treated cell culture dish</td></tr><tr><td>Isotemp Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FICO3500TABB</td><td>5.0% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>American Rotator V</td><td>American DADE</td><td>R4140</td><td></td></tr><tr><td>250 um nylon mesh</td><td>Sefar</td><td>03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>20 um nylon mesh</td><td>Sefar</td><td>03-20/14</td><td></td></tr><tr><td>Beckman GS-6R Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>358702</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldritch</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Pre-separation filter (30um)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-410</td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS multi-stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>CD1a Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-001</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 670 cell proliferation dye</td><td>eBiosciences</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>96 well round bottom plate</td><td>Falcon</td><td>9/8/2866</td><td></td></tr><tr><td>Zombie yellow viability dye</td><td>Biolegend</td><td>423104</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC/Cy7, anti-human</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>25-0038-T100</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PE, anti-human</td><td>eBiosciences</td><td>12-0048-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC, anti-human</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0086-T100</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B43618</td><td>10 color, VBR</td></tr><tr><td>MACSquant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>8 color, VBR</td></tr></tbody></table>

isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies

İnsan dendritik hücreler (DC) içinde Mukozal doku ikamet karakterizasyonu örnekleri alınırken zorluk nedeniyle zordur ve DCs az sayıda doku mevcut. Fenotip ve DCs işlevinin değiştirilmiş doku çevre tarafından henüz, doku ikamet DC nüfus analiz etmek, kan DCs eksik olarak elde edilen bu yana DCs karmaşıklığı dokularda yansıtmak için gerekli olduğu. Burada phenotypical ve fonksiyonel analiz sağlayan histerektomi örnekler kullanarak insan kadın üreme yolu (FRT) DCs yalıtmak için bir iletişim kuralı mevcut. Tek bir hücre hücre süspansiyon, pozitif manyetik boncuk seçime göre takip karışık üretmek için doku sindirim protokol oluşur. Bizim doku sindirim Protokolü phenotypical ve fonksiyonel analizde DC'lerin gecede kuluçka veya hücre etkinleştirme olmadan kararlı duruma sağlayan yüzey işaretleyicileri, ayırmak değil. Bu iletişim kuralı yalıtım diğer bağışıklık hücre tiplerinin veya diğer dokularda DC'lerin izolasyon için adapte edilebilir.

Şekil 1A' gösterildiği gibi aşağıdaki doku sindirim, epitel sayfaları ve bezleri serbest bırakılması görülebilir; Enzimatik sindirim başarıyla tamamlandığını belirten pozitif bir denetimdir. DCs doku gram başına kurtarıldı ve toplam hücrelerin sayısını da şekil 1B ve şekil 1 c, sırasıyla gösterilir. Bağışıklık hücreleri stromal hücre yoğunluğu Santrifüjü<sup ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies at JoVE.com

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

İnsan dişi üreme yolu dendritik hücreler yalıtım Phenotypical ve fonksiyonel çalışmaları için

Biz burada yalıtmak ve phenotypical ve fonksiyonel özellikleri değerlendirilmesi için insan kadın üreme sistemi içinde farklı anatomik bölmeleri dendritik hücrelerden arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer bağışıklık hücreleri veya diğer Mukozal doku dendritik hücrelerden yalıtmak için adapte edilebilir.

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

isolation-dendritic-cells-from-human-female-reproductive-tract-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K Görüntüleme.  Geisel School of Medicine at Dartmouth. Biz burada yalıtmak ve phenotypical ve fonksiyonel özellikleri değerlendirilmesi için insan kadın üreme sistemi içinde farklı anatomik bölmeleri dendritik hücrelerden arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer bağışıklık hücreleri veya diğer Mukozal doku dendritik hücrelerden yalıtmak için adapte edilebilir.

Video: Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their antigen presentation and T cell activation capacities. Since most vaccinations of experimental tumor models require millions of DC, they are widely isolated from the bone marrow or spleen. However, these DC significantly differ from blood and tumor DC in their responses to immune complexes (IC), and presumably to other Syk-coupled lectin receptors. Importantly, given the sensitivity of DC to danger-associated molecules, the presence of endotoxins or antibodies that crosslink activation receptors in one of the isolating steps could result in the priming of DC and thus affect the parameters, or at least the dosage, required to activate them. Therefore, here we describe a detailed protocol for isolating MoDC from blood and tumors while avoiding their premature activation. In addition, a protocol is provided for MoDC activation with tumor IC, and their subsequent analyses.

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Monocyte-derived DC (MoDC) can sense minor amounts of danger-associated molecules and are therefore easily primed. We provide a detailed protocol for the isolation of MoDC from blood and tumors and their activation with immune complexes while highlighting key precautions that should be considered in order to avoid their premature activation.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Kanser Araştırmaları

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Biyoloji

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Fare Barsak ayrı dendritik hücreler ve makrofajlar İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.