Name: formation of covalent dna adducts by enzymatically activated carcinogens and drugs in vitro and their determination by 32p-postlabeling
Uploaded: 2018-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
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本研究は、チェコ科学財団 (GACR、グラント 17 12816S) によって支えられました。

著者は、何を開示します。

この論文では付加体の共有結合 DNA の生成で生じる代謝の中間体に bioactivated をする化学物質の効能を研究する広くアクセス可能な方法論を示した。これは重要な問題です、付加体の環境化学物質の効力または共有結合 DNA を生成する代謝産物への酵素的活性化の薬の評価ために、がんとその治療法の開発に重要なフィールドは。腫瘍の開発の原因と考えられる発ガン性物質による DNA の変更?...

(環境化学物質や薬物) は化学物質の代謝は 2 つのフェーズ1で発生します。フェーズ I と II はもともと疎水性 (水溶性) 化合物をより親水性にレンダリングする目的 (水溶性)、汗や尿、糞便を介して容易に excretable のため。フェーズ I (化) 反応は、酸化、還元、およびペルオキシダーゼ (p450、アセチルトランスフェラーゼ)、シトクロム p450 などの酵素によって触媒される水酸化反応 (すなわち、シクロオキシゲナーゼ、コックス)、アルド-ケト還元酵素 (AKRs)、および肝ミクロゾーム。フラビン含有モノオキシゲナーゼ (FMOs)。様々 な還元すなわち、ミクロソーム NADPH: チトクローム P450 還元酵素 (POR) と細胞内 NAD (P) h: キノン酸化還元酵素 (NQO1)、キサンチン酸化酵素 (XO)、アルデヒド酸化酵素 (AO)1による還元反応の内容はまた相.2 番目のフェーズ (活用) 段階に付けられた官能基は極性をさらに高める小さい極性分子の共役にされます。フェーズ II は、硫酸転移酵素 (結果)、 N、O- コリンアセチルトランスフェラーゼ (Nat)、メチル基転移酵素カテコール -O-メチルトランスフェラーゼ (COMT) グルタチオンS- などの反応で参加と酵素の例トランスフェラーゼ (観光科学研究)、ウリジン二リン酸不明瞭 (UGTs)1。段階で酵素の分類 I または II は、しかし、堅くないし、いくつかの酵素は、どちらのカテゴリに恐らく間違いなくグループ化できます。
P450 酵素 (EC 1.14.14.1)、ヘム蛋白質の変換3,4を触媒多くの化学物質の生体内変換に参加する様々 な生物の存在を含んでいます。P450 酵素触媒反応を 1 つの酸素原子を分子薬物動態、導入する中の酸素 2 原子が 2 つの電子 [式 (1 を必要とする反応によってフォーム水に還元される場所の多くの基質のヒドロキシル化)]3,4:
RH + O2 + NADPH + H+ → 盧 + H2O + NADP+ (1)
P450 酵素 (ミクロゾーム P450 系) 哺乳類細胞の小胞体膜に局在 NADPH: チトクローム P450 還元酵素 (POR) とチトクロムb5がさらに含まれている酵素のモノオキシゲナーゼ系のメンバーであります。、NADH: チトクロームb5還元酵素と呼ばれる酵素の基板。一般に認められた理論の仮説、P450 に必要な 2 つの電子のドナーは、NADPH/POR システム。それにもかかわらず、チトクロームb5可能性がありますとしても電子のドナー チトクローム P450 のすなわち 2 還元の反応サイクルの P450 を削減電子のドナーとして NADH: チトクロームb5と共に機能する場所還元酵素の2,の3,4。
哺乳類利用各種 P450 酵素 (例えば家族 5、8、11、17、19、21、24、26、および 27 の酵素) ステロイド類などの貴重な内因性化合物の合成のため天然物2,3の異化作用のために使用し、.他の CYP の哺乳類酵素などヒト CYP1A2、2 9、2 19 2 6 と 3A4、代謝薬として使用される外因性の化学物質。5,6薬の代謝を触媒する最も重要な酵素は、特に CYP3A4 3A 亜科の広いです。プロ発ガン性物質などプロ-毒性、薬物動態の変換は、ヒト CYP1A1、1 a 2、1B1、2A6、2E1、3A42,5によって仲介されます。これらのアセチルトランスフェラーゼのほとんどは (CYP1A1 1B1 除く) 肝臓に存在です。それにもかかわらず、広いはいくつかの肝外臓器にも表されます。このような p450 意義は大きい、主にあるかもしれないときこれら臓器7の反応中間体を化学物質 (薬物) の生理活性代謝に彼らを参加します。各種 p450 は、これは必ずしもそうではありませんが、基板は、いくつかの化合物によって引き起こされます。
多くの P450 酵素は、毒性化学物質 (薬物) の役割を果たします。彼らは彼らの解毒代謝だけでなく、物質に変換することができますがもさらに通常彼らの毒性を引き起こす別の生物学的特性を示す内在性の高分子を変更反応性の種にそれらを有効に。DNA、脂質、タンパク質は、反応性の求電子剤と活性化学物質から生成されたラジカル調節の目標かもしれない。DNA の場合いくつかの重要な遺伝子応答とそのメカニズムを解決されている2,3,4,5。
DNA の変化は細胞成長の制御の減少につながるし、この現象が支配的な要因の発がんプロセスの開発につながると見なされます。共有結合 DNA の生成付加体の化学物質の発ガン性の初期段階で最も重要な手順の 1 つを処理する8,9,10,11発がん性を持つと判断します。それを示した付加体の DNA の形成との関係、腫瘍の発生、付加体の DNA の量の減少に対し、化学予防8,9,10,11,12,13,14. 発癌物質/薬物由来の形成 DNA 付加体の DNA の塩基に依存して DNA のこれらの塩基の配列によって影響されます。付加体の DNA の修理の場所 (上転写または非転写される DNA 鎖) と修正されたヌクレオチド シーケンス8,11,12,15の型に依存しています。 16。
この資料で述べる変更 DNA 代謝産物にアクティブにする彼らの力を調査するため化学物質 (薬物) の酵素触媒変換を利用した (生成する DNA 付加体)。DNA 結合テスト混合物をする必要があります通常個々 の薬物に応じて、酸化、または還元反応によってアクティブになります。テスト対象化学物質の酸化や還元活性化ミクロソームの細胞分画に存在する P450 依存性酵素システムを介したまたは還元還元ミクロソーム (POR、NADH: チトクロームb5の両方に存在還元酵素、P450 酵素)、細胞質細胞内分 (NQO1、XO、アオ、ペルオキシダーゼ)。反応性代謝物その後バインド DNA 付加体の DNA を形成します。酸化及び還元反応はこれらの反応種にいくつかの薬をアクティブにすることが重要なので酸化/還元酵素システムを用いた実験の手順を示します。さらに、検出し、これらの DNA を定量化できる適切なメソッドが付加体で詳しく説明します。
酵素システムによってテスト化学がアクティブかどうかを決定する 2 つの独立した手順は DNA 行きをお勧めします: 32p-ポストラベル法と利用した放射性標識化合物 (e.g、 3H または14。C)。最初はパイロット、 32p-ポストラベル試験をスクリーニングをお勧めします。ソリューションでは、正確に評価される、DNA 量の定量は、両方の方法を付ける必要があります。
32p-ポストラベル法による非放射性化学物質 (発がん性物質・医薬品) 3´-phosphodeoxynucleosides、5´-放射性リン (32P) と追加のリン酸化修飾核酸の酵素加水分解を利用してください。ああ位置、および化学 deoxynucleotide の分離通常の (非修飾) 弱まりからによる付加クロマトグラフィー17 (図 1)。ミクロコッカスヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼとして知られている混合物で化合物の化学修飾 DNA を加水分解します。(未変更の状態) 両方の法線を含む、変更デオキシリボヌクレオシド 3´ monophosphates [γ-32P] フォーム 5´ pH 9.5 でキャリア (非放射性) ATP と T4 ポリヌクレオチド キナーゼの存在下で ATP と反応し、加水分解 DNA の混合物32P ラベル 3´、5´ bisphosphates (図 1の「標準」プロシージャ)。使用されるアルカリ pH は T4 ポリヌクレオチドの位置 3´ でデオキシリボヌクレオシド 3´ monophosphates dephosphorylate キナーゼの酵素活性を最小限に抑えることが可能です。分離と32の解像度から付加体 P ラベルの化学薬品によって変更されていないラベルの弱まりはポリエチレンイミン (PEI) セルロース (図 2 多陰イオン交換薄層クロマトグラフィー (TLC) によって遂行).最初と 2 番目の溶出の手順 (D1 および D2 方向) で、短い部分に電解質の水溶液を用いた TLC PEI セルロース板の最初からラベル付き通常 (非修飾) 弱まりとして [32P] リン酸を溶出します。ガスクロマト グラフ用紙 (発がん性物質/薬物-アダクト) 疎水性特性を示すバインドされた化学物質を含む弱まりはさらに解決すべき PEI セルロース プレートのスタートで維持されるに対し、TLC プレート上に適用されます。D3 と D4 の方向 (図 2) でいくつか異なる溶媒システム。付加体の局在強化画面オートラジオグラフィー; を使用して実行されます付加体の分離された x 線フィルムの認識可能な黒ずみとして検出されます。スポットのエリアはプレートから摘出した、液体シンチレーションまたはカウント チェレンコフによって放射能を定量化する使用されます。クロマト グラム検出された付加体のイメージング法のマップし、DNA の定量化に適応されているストレージりん32p-ポストラベル試験が今も使用されます。18インスタント イメージャ マシンは頻繁にそのような検出のため、付加体の DNA の定量化。このメソッドでは、画面の技術強化オートラジオグラフィー19よりも32P を検出するための 10 倍以上の感度を提供します。
量の DNA 付加体の付加物の相対値分類 (RAL) の方程式 (2) を使用して次のように計算、定め。
インプレッション。弱まりを付加します。 RAL =---(2) 32P ATP の特定活動 (cpm で/pmol) x pmol 弱まり
RALs の値が内転の弱まりのカウント レートの比 [内転と通常 (非修飾) 弱まり] の合計カウント率弱まり20,21。ただし、この計算は平等に基づいて付加体の効率のラベリングと通常弱まり22。32p-ポストラベル法の古典的な (「標準」) プロシージャは適切様々 な DNA 付加体 (および/または非かさばるかさばる付加) しかし、その感度は満足のいく付加体の dna の少量を検出しますします。この手順を使用して、DNA (0.3 fmol 付加/μ g DNA) の 10 の7そのまま弱まりで抱合体の生成量は検出します。
この古典的な32p-ポストラベルのプロシージャの変更の様々 な技術の感度を高めるため利用されています。32で付加体の定量の 10-100 倍高感度まで P ラベルは [γ-32P] ATP (強化のプロシージャ) の制限レベルを使用して達成されています。23,24 32p-ポストラベル法の感度の増加を利用して DNA を含む消化の潜伏を提供するそれ以上のプロシージャ付加ヌクレアーゼ P1 (活性) から21 (図 1)。この酵素は、バインドされた化学物質 (内転のヌクレオチド) と弱まり、本質的にないこの酵素の基板に対し未修正デオキシリボヌクレオシド 3´-monophosphates、dephosphorylate を好みます。したがって、脱燐酸化されたデオキシリボヌクレオシド 3´ monophosphates (すなわちdeoxyribonucleosides) がない γ-32P から [32P] リン酸塩による T4 ポリヌクレオチド キナーゼによるリン酸化] ATP。しかし、いくつかの化学物質が、ヌクレオチドのバインド (内転弱まり)、デオキシグアノシン、この酵素によってすることができます bedephosphorylated の C8 で置換アリールが付加体のよう。対照的に、他のほとんどは付加体 (例えば、付加体のデオキシグアノシンのN2を代入) ヌクレアーゼ P1 でない脱燐酸化します。32p-ポストラベルのこの変更によりこのメソッドのかなり敏感、以上 3 つの一桁によってその感度を増加します。32p-ポストラベルのこのバージョンがメソッドを提供しますが、さらに DNA (5-10 μ g)、キャリア フリーの過剰量 [γ- 32P] ATP を利用することができます。
豊かにする別の方法、付加体、グプタ25によって記述されている、物理化学的性質を利用してかさばる deoxynucleotide のプロパティが付加体、 nに何を抽出することがでく-相転送エージェント テトラブチル アンモニウム存在下でブタノール[32P] リン酸ラベリング、未変更の弱まりがこの有機溶媒によって抽出される悪いに対し前に塩化 (未定) (図 1)。しかし、少ない疎水性付加で構成される残基、非芳香族扱いにくい部分や小さなアルキルと変更された弱まりの例効果的に抽出されませんn-ブタノール。したがって、彼らは32p-ポストラベル法のこの変更によって分析されるとき本質的に検出されません。
109,10通常当たり、前述の両方のバージョン32p-ポストラベル増加感度と DNA の定量化は非常に (3 桁) 最大付加体、1 つを検出できること付加物ヌクレオチド (0.3 - 3 amol/μ g DNA)。自明で DNA を効率性の化学薬品をテストのこれらの 2 つの方法が推奨され、したがって、彼らは詳細にこの作品のとおり。

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Roth</td><td>0032.8</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol</td><td>Roth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Penta</td><td>70390-11000</td><td></td></tr><tr><td>Calf thymus DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4522</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>NADP&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5755</td><td></td></tr><tr><td>NADPH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7505</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose 6-phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647001</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose 6-phosphate dehydrogenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6378</td><td></td></tr><tr><td>Supersomes</td><td>Corning Gentest</td><td>456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202</td><td></td></tr><tr><td>Human liver microsomes</td><td>Corning Gentest</td><td>452172</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77662</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxypyrimidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H56800</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437549</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179272</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease from &lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II</td><td>Calbiochem</td><td>524711</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease P1 from &lt;em&gt;Penicillium citrinum&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8630</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163791</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Tetrabutylammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86870</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437603</td><td></td></tr><tr><td>T4-polynucleotide kinase</td><td>USB Corp</td><td>70031Y</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]ATP</td><td>Hartman Analytic GmbH</td><td>FP-201</td><td></td></tr><tr><td>PEI-impregnated cellulose TLC plates</td><td>Macherey-Nagel</td><td>801053</td><td></td></tr><tr><td>Packard Instant Imager A202400</td><td>Packard</td><td>G120337</td><td></td></tr><tr><td>Ellipticine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>285730</td><td></td></tr><tr><td>3-Nitrobenzanthrone</td><td>prepared (synthesized) as shown in ref. 40</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

formation of covalent dna adducts by enzymatically activated carcinogens and drugs in vitro and their determination by 32p-postlabeling

共有結合 DNA 付加体の化学物質によって形成される発がん性の薬は発がんプロセスの初期段階で最も重要な要因の一つと判断されたか。癌の原因を考えると、この結合は、今化学発がんのセントラル ドグマとして評価されます。ここでは、チトクローム P450 によって触媒反応を用いた方法を説明し、付加体の化学物質や代謝産物がこれらの DNA を形成するの活性化のための薬の効力を調査するその他の微生物による分解酵素。体内酵素シトクロム P450 に他体内の酵素、すなわちペルオキシダーゼ、NADPH: チトクローム P450 (ミクロゾーム及びサンプルを有する細胞画分の分離を記述する手順を紹介してNAD (P) h: キノン酸化還元酵素、またはキサンチン酸化酵素酸化還元酵素)。メソッドの説明また、分析化学物質の代謝活性化のための DNA の隔離のためのそれらと同様、これらの酵素によって使用できます。さらに、検出および化学/医薬品由来 DNA の定量化できる適切な方法は、すなわち、 32p-ポストラベル法のさまざまな変更を内転、放射性ラベルの雇用の化学物質を分析、詳細に表示されます。

中間体の共有結合の結果に代謝される化学物質 (発ガン性物質/薬) の効力を調査する (すなわちP450、ペルオキシダーゼ、還元酵素) の活性化酵素触媒の利用のためにはここで説明したプロトコルを使用してください。DNA に結合 (世代の DNA 付加物)、(i) (ため検討を見る、29,30,31)、抗悪性腫瘍剤...

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Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

共有結合 DNA 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in Vitro薬物と32p-ポストラベルで決意

環境化学物質、酵素中間体の共有結合 DNA の生成に bioactivated が付加体に薬剤の効力を評価するがんとその治療法の開発に重要な分野です。DNA 付加体、その検出と定量の技術だけでなく、フォームに化合物の活性化のための方法を説明します。

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

13.8K ビュー.  Charles University. 環境化学物質、酵素中間体の共有結合 DNA の生成に bioactivated が付加体に薬剤の効力を評価するがんとその治療法の開発に重要な分野です。DNA 付加体、その検出と定量の技術だけでなく、フォームに化合物の活性化のための方法を説明します。

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Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

ケミカルバイオロジーのフリーラジカル：化学的挙動からバイオマーカー探索·開発へ

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

化学

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

レーザーローカライズソラレン付加物の単一分子解析

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

遺伝学

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted mechanism of metabolic activation involves formation of &#945;-hydroxynitrosamines that spontaneously decompose to DNA alkylating agents. Accumulation of DNA damage and the resulting mutations can ultimately lead to cancer. New evidence indicates that &#945;-hydroxynitrosamines can be further oxidized to nitrosamides processively by cytochrome P450s. Because nitrosamides are generally more stable than &#945;-hydroxynitrosamines and can also alkylate DNA, nitrosamides may play a role in carcinogenesis. In this report, we describe a general protocol for evaluating nitrosamide production from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines. This protocol utilizes a general approach to the synthesis of the relevant nitrosamides and an in vitro cytochrome P450 metabolism assay using liquid chromatography-nanospray ionization-high resolution tandem mass spectrometry for detection. This method detected N&#8242;-nitrosonorcotinine as a minor metabolite of N&#8242;-nitrosonornicotine in the example study. The method has high sensitivity and selectively due to accurate mass detection. Application of this method to a wide variety of nitrosamine-cytochrome P450 systems will help determine the generality of this transformation. Because cytochrome P450s are polymorphic and vary in activity, a better understanding of nitrosamide formation could aid in individual cancer risk assessment.

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

&#945;-hydroxylation of carcinogenic nitrosamines by cytochrome P450s is the accepted metabolic pathway that produces DNA-damaging intermediates, which cause mutations. However, new data indicates further oxidation to nitrosamides can occur. We describe a general method for detecting nitrosamides produced from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines.

チトクローム p450 によるニトロソアミンのIn Vitro代謝 Nitrosamide 形成を検出するための一般的な方法

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

がん研究

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer therapies, such as radio- and chemotherapy, introduce enormous amount of additional DNA damage, leading to cell cycle arrest and apoptosis to limit cancer progression. Quantitative assessment of DNA damage during experimental cancer therapy is a key step to justify the effectiveness of a genotoxic agent. In this study, we focus on a single cell electrophoresis assay, also known as the comet assay, which can quantify single and double-strand DNA breaks in vitro. The comet assay is a DNA damage quantification method that is efficient and easy to perform, and has low time/budget demands and high reproducibility. Here, we highlight the utility of the comet assay for a preclinical study by evaluating the genotoxic effect of olaparib/temozolomide combination therapy to U251 glioma cells.

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

The comet assay is an efficient method to detect DNA damage including single and double-stranded DNA breaks. We describe alkaline and neutral comet assays to measure DNA damage in cancer cells to evaluate the therapeutic effect of chemotherapy.

コメットアッセイを用いた DNA 損傷の in Vitro評価

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

DNA損傷の検出のための半人工分子機械とその使用のin vitroでの組立に

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

生物工学

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

ユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化DNA-タンパク質架橋の測定

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

著者スポットライト:DNAタンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

生化学

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

共有結合 DNA 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in Vitro薬物と³²p-ポストラベルで決意

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