この研究は、国立神経疾患研究所と脳卒中、国立衛生研究所（VVD）からと神経疾患や脳卒中、国立ARRAを通じて衛生研究所（VVD）とR21の国立研究所からR21 NS064403の補助金によって助成金R01NS062842によってサポートされていました生体イメージングとバイオのEB006301国立研究所、健康（VVD）の国立研究所。

それらの調製方法は、分子デバイスの組立よりも時間がかかるため、分子機械ベースの検出のためのセクションは、最初に準備する必要があります。構造はパラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋組織ブロックから切り出した5量6μm厚のセクションでうまく動作します。このようなProbeOnプラスに帯電しprecleanedスライド（フィッシャーサイエンティフィック）または同様の同様のセクションを保持するスライドのブランドを、使用してください。我々はまず、デキサメタゾンで処理したアポトーシスラット胸腺13,14としてDNアーゼI -とDNase II型改の両方を含むDNA損傷のよく知られたパターン、とティッシュを使用してからをお勧めします。 1。セクションの準備<ol><li> 15分間、キシレンでスライドラックや〜からろうを除去するのセクションを配置、さらに5分間新鮮なキシレン槽に移す。 </li><li>段階的エタノール濃度を通過することによって再水和する：96％エタノール2x5min、80％エタノール - 5分、水 - 2X5分。 </li><li> Proteinasとダイジェストセクション電子K.は、セクションごとの50μg/mL溶液の100μLを使用してください。加湿チャンバー内の室温（23℃）でインキュベートする1​​5&#39;。時間は組織の種類に応じて調整が必要な場合があります。硬組織は、もはや消化が必要になる場合があります。 15〜25分の時間が通常使用されています。不十分な消化が弱い信号になることがあります。信号の消失とセクションの混乱の一方の結果でOverdigestion。 </li><li> 2 × 10分間蒸留水ですすいでください。 </li><li> preblocking 2％のBSAのセクションあたり100μLを適用します。室温で15分間（23℃）インキュベートする。この時間の間に分子機械を組み立てる。 </li></ol> 2。分子機械組立すべての試薬は、平均的な大きさの組織切片（10x10mm）で単一の検出のために十分である25μL合計体積に対して拡大または縮小されます。必要に応じてボリュームをスケールアップすることができます。 <ol><li>このためには小さなプラスチック製のチューブで組み合わせる。 </li></ol><table border="1"><tbody> &lt;TR&gt; <td><ol><li>蒸留水; </li><li> 15％のポリエチレングリコール- 8000; </li><li> 、66 mMのトリス塩酸、pH7.5の、5 ​​mMのMgCl 2、0.1mMのジチオエリトリトール、1mMのATP、（すなわち、通常のT4 DNAリガーゼバッファー）の解</li><li>オリゴヌクレオチド1の70ピコモル、 </li><li> 215ピコモル（1.76〜7.1μg）をVACC TOPO </li><li> 10単位のT4 DNAリガーゼ（500 U / mL）を</li></ol></td></tr></tbody></table><ol start="2"><li>ピペッティングにより穏やかに混合。分子は、このソリューションでは、ほぼ瞬時に自己組み立て構築し、室温（23℃）ですぐに使用できます。温度を37増やす° CのブロックラベルのT4 DNAリガーゼベースのコンポーネント。 </li></ol> 3。デュアルラベルの5&#39;OHと5&#39;PO4 DNA切断に組織切片での分子機械を使用する<ol><li> preblockingソリューションを吸引し、オリゴヌクレオチド1の70ピコモル、53を含む完全な反応混合物の25μlのを適用する - 215ピコモル（1.76〜7.1μg）をVACC66 mMのトリス塩酸、pH 7.5、5mMのMgCl 2を 、0.1mMのジチオエリトリトール、1mMのATP、および15％ポリエチレングリコール- 8000のソリューションでTOPOと10ユニットT4 DNAリガーゼ（500 U / mL）を。単一のFITCラベル、オリゴヌクレオチド2を運ぶ同じシーケンスのオリゴヌクレオチドは、DNA切断の単一のタイプの検出のために代わりに使用することができます。このような場合、標識反応からリガーゼを省略します。また、このような状況で50mMトリス- HCL、pH7.4の、の溶液を15％PEG - 8000を、T4 DNAリガーゼ緩衝液の代わりに使用できます。 </li><li>プラスチック製のカバー付き加湿チャンバー中、室温（23℃）で1時間インキュベートする。光から保護する。 16に温度の低下° Cがリガーゼベースの信号を減​​少させる、37の温度上昇は、° Cは完全にリガーゼベースの信号を除去する。リガーゼの部分的な阻害は、時々、反応ミックスにはトポイソメラーゼの準備で導入された汚染物質が原因の可能性が発生します。そのため、より長いインキュベーション（2-4時間）が必要になることがあります場合は特に秒リガーゼ標識休憩のignificant番号が存在する。リガーゼとTOPOの信号の両方がこの段階で観察することができますが、多くの例でリガーゼ信号はVACC TOPOと二重標識オリゴヌクレオチドを​​含まない反応混合物の再アプリケーションによってさらに強化されるが、ヘアピン状のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド3）を含むことができる（35 mg / mLの）とT4 DNAリガーゼ（250 U / mL）を。向上させるために信号は、ステップ5に進みます強化なしで反応を見るために、ステップ3に進みます。 </li><li>穏やかに室温で水を含むコプリンジャーに垂直にスライドを浸してカバースリップを取り除きます。余分な水分を吸引除去する。 </li><li> VACC TOPOとオリゴヌクレオチド1なしの反応ミックス25μLを適用するが、オリゴヌクレオチド3を含むことによりリガーゼ信号を強化：66 mMのトリス塩酸、pH7.5の、5 ​​mMのMgCl 2、0.1mMのジチオエリトリトール、1mMのATP、および15％ポリエチレングリコール- 8000、5ユニットT4 DNAリガーゼは、35 mg / mLのオリゴヌクレオチド3（平滑末端ヘアピン）。ラベリングソリューションCAの合計量nが大きいセクションに対応するためにスケールアップする。プラスチック製のカバー付き加湿チャンバー中、室温（23℃）で18時間（一晩）インキュベートする。 </li><li>穏やかに室温で水を含むコプリンジャーに垂直にスライドを浸してカバースリップを取り除きます。その後、蒸留水でセクション3 × 10分間洗浄する。 </li><li>炭酸水素ナトリウム緩衝液ですすいでください。アルカリ溶液は、pH感受性であり、有意にpHを7以下に下がっているFITCの蛍光を、高めるすすいでください。 </li><li> antifading溶液（DAPIとVectashield）、カバースリップを持つセクションをカバーし、蛍光顕微鏡を用いて信号を解析する。 5&#39;OHを持つ二重鎖DNA切断は緑、5&#39;PO 4ブレイクを蛍光を発する-赤（図2）は蛍光を発する。 </li></ol> 4。代表的な結果<img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" /> 図1半人工分子機械は、2つのタイプのを検出in situで DNA損傷。 VACC TOPOがダブルヘアピン32 - merのために結合すると蛍光マシンは、自身により組み立てます。認識配列の3&#39;末端にカットトポイソメラーゼ製経由でマシンには2つの検出器ユニットに分割すること自体が動作を開始します。 FITC標識ユニットが連続的に分離し、ローダミン標識ユニットに戻ってreligatesサイクリックプロセスでこの結果。検出可能なDNAのブレークが検出されるまでこれが持続します。このような代替アクセプタ（5&#39;OH平滑末端のDNAのブレークが）組織切片内に存在する場合、FITC部分はそれにライゲートされます。残りのローダミンの部分は、T4 DNAリガーゼの助けを借りて、5&#39;PO 4 DNA平滑末端の改行にアタッチされます。その結果、DNA切断の両方のタイプを同時に検出されます。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" /> 図2。分子機械デュアルラベルDNA切断の2つのタイプデキサメタゾン処理した胸腺の組織セクションに表示されます。 DNアーゼI -とDNase II型の平滑末端DNAの切断は、アポトーシスを起こした胸腺皮質領域で検出されています。緑色の細胞質蛍光（5&#39;OH DNA切断）がアポトーシスを起こした胸腺細胞の核物質を消化皮質マクロファージをマーク。この信号は、VACC TOPOによって生産され、5&#39;OH二本鎖切断11,12を含むDNAとphagolysosomesに局在している。赤色蛍光（5&#39;PO 4休憩）ラベルマクロファージによる貪食しないアポトーシスを起こした胸腺細胞の核を。胸腺細胞の大規模な数字は同時に、5&#39;PO 4二本鎖切断の発生を伴うアポトーシスを起こすリガーゼベースの標識によって可視化した。これらの改行はリング状のパターンを形成し、核の周囲に配置されています。すべての細胞の核はDAPI（青色蛍光）との対比により可視化。

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	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

このビデオでは、我々は、デュアルラベリングDNA損傷のセンサーを組み立て、使用する方法を示します。センサーは、生体分子のエンジン、人工的なコンポーネントにリンクされているウイルスでエンコードされたタンパク質VACCのTOPOによって駆動分子機械です。提示の開発は、非毒性の分子スケールデバイス12,15の設計に生物学的構造、アーキテクチャとセルの実際の部品とコンポ?...

<ol><li>キシレン</li><li> 80および96％エタノール。 </li><li>蒸留水でウシ血清アルブミン（BSA）の2％溶液。 </li><li>オリゴヌクレオチド1：ダブルヘアピン、デュアルフルオレセイン、テトラメチルローダミンで標識した。 </li></ol> 5&#39; - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT GCG TT - 3&#39;AT R、F - FITC - DT; R -テトラメチルローダミン- dTが。このようなBODIPY TR、ローダミンまたはTAMRAなど、他の赤色シフト蛍光体はRとしてテトラメチルローダミンの代わりに使用することができます。 あるいは、オリゴヌクレオチド2を使用することができます - フルオレセインで標識された二重ヘアピンのシングルを（DNA切断のシングルタイプ（DNase処理II型のみ）を検出するための単一フルオロフォアを運ぶプローブはかなり安価で、いつでもシングル便利です。 DNA区切りの種類が分類されることになります：5&#39; - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T - 3&#39;; F - FITC - dTを</p&gt; <ol start="5"><li>オリゴヌクレオチド3。 T4 DNAリガーゼを用いたin situライゲーションの信号での強化のための平滑末端ローダミン標識ヘアピン：5&#39; - GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC - 3&#39;; R -テトラメチルローダミン- dTを</li><li>ワクシニアDNAトポイソメラーゼL（VACC TOPO） - 3000 U /μL（ビビッドテクノロジーズ）。初期の実験では、反応混合物の各25μLあたりVACC TOPO 215ピコモル（7.1μg）を使用。しかし、トポイソメラーゼの濃度が大幅に感度を失うことなく減少させることができます。我々は、後で同じような結果とセクションごとにVACC TOPO（セクションごとに反応ミックス25μLの1.76μg）の4倍より少ない量を使用していました。 880 ngの（反応ミックス25μLで）への酵素の量を減らす弱い信号をもたらしたとVACC TOPOの8.8 ngのは、検出可能なシグナルを産生しなかった。 </li><li> T4 DNAリガーゼ5 U /μL（ロシュ）。この高濃度のリガーゼの準備は、我々の実験条件における最適な信号を提供します。 </l私&gt; <li> T4 DNAリガーゼ用10 ×反応バッファー：660 mMのトリス- HCl、50 mMのMgCl 2、10mMのジチオエリトリトール、10mMのATP、pHが7.5（20℃）（ロシュ）。反応緩衝液中のATPは、容易に凍結を融解の反復的なサイクルで破棄されます。アリコートで小さい15から20μLの部分とストア内のバッファ - 20℃で一度だけ使用してください。 </li><li> 30％（w / v）の蒸留水でのPEG - 8000の溶液（シグマ）。 15％は反応ミックス中のPEG - 8000を強くボリュームの排除によって、その成分の有効濃度を増加させる、検出を刺激する。 </li><li>プロテイナーゼK（Roche社）を蒸留水に20 mg / mlのストック溶液。で保管して - 20℃の反応では株式から調製した、PBSで50mg/mLのソリューションを使用してください。再使用しないでください。 </li><li> DAPIとVectashield（ベクターラボラトリーズ）。 </li><li>炭酸水素ナトリウム緩衝液：50メートルM NaHCO 3を 、15メートルのNaCl、pHは8.2。 </li><li> 22x22mmまたは22x40mmガラスまたはプラスチック製のカバースリップ。プラスチック製カバースリップは、彼らのように、反応中に好ましいセクションから削除するには、簡単に再。 </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

天然由来のバイオ分子のマシンはすべての生きている細胞では機能とデザインを1-6の様々な表示。まだ方向運動、すなわち分子モーターの対応デバイス上で、そしてそのスケールダウンした機械部品（ホイール、アクスル、ペンダント等）7-9人工分子機械の中心の開発。これは、慣性と運動量の保存など、これらのデバイスに不可欠な物理特性は、ナノワールドの環境で10に使用できないにもかかわらず、マクロマシンを模したもの。機械的なmacromachinesスキームに従い、生体分子の進化に開発した機構を使用しない代替デザインは、、ナノワールドの特定の条件を活用することができます。に加えて、ナノ設計の目的のために実際の生体分子を適応させるナノテクノロジー製品がもたらす可能性のある潜在的な危険を減らすことができます。ここでは、そのようなバイオ対応構造のアセンブリとアプリケーションを示すように人工的な成分で、天然に存在する分子機械を組み合わせたEMI -人工分子デバイス。ビューの酵素学の観点から、私たちの構造は、デザイナーの蛍光酵素基質複合体の特定の有用な機能を実行するために一緒に入れています。それは1つの12が含まれているとして、このアセンブリは、定義により分子機械です。まだ、エンジニアリング部との統合-蛍光二重ヘアピン- DNA損傷12を標識する新しいタスクにそれを再指示する。 私たちの構造は32量体DNAと酵素ワクトポイソメラーゼI（VACC TOPO）から組み立てます。マシンは、2つの蛍光標識検出器ユニット（図1）を製造するために、独自の材料を使用しています。ユニットの一つ（緑色蛍光）が運ぶ共有結合その3&#39;末端と別のユニット（赤色蛍光）に接続されているVACC TOPOは、ターミナル3&#39;OH無料ヘアピンです。ユニットは短命で、すぐにその後recleavesオリジナルの構造に戻し、組み立て直す。DNAの非存在下で周期的に継続的に独立したとreligateこれら二つのユニットを壊します。 DNA損傷による組織切片では、トポイソメラーゼを運ぶ検出器ユニットは、選択的に蛍光ラベルを付けます、5&#39;OHと平滑末端DNAの切断（DNase処理II型改）11,12に接続します。オリゴヌクレオチド開裂の後に形成された第二、酵素のないヘアピンT4 DNAリガーゼは、ソリューション13,14内に存在する場合、5&#39;PO 4平滑末端ブレーク（DNアーゼI -型改）11,12、にライゲートされます。 T4 DNAリガーゼは、組織切片または5&#39;PO 4平滑末端切断したDNAを含む溶液に添加されると、リガーゼは、準安定酵素- DNA複合体を形成し、5&#39;PO 4 DNAの末端と反応する。平滑末端ヘアピンは、このように5&#39;PO 4平滑末端DNAの切断をラベリング、DNAにリガーゼと共有結合リンクのヘアピンをリリースするこれらの複合体と相互に作用します。 この開発は、番目に新しい実用的なアプローチを例示している電子の分子機械の設計とは、固定された細胞や組織におけるアポトーシスとDNA損傷の検出に有用なセンサーを提供します。

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

我々は、トポイソメラーゼのタンパク質を搭載した分子スケールデバイスのアセンブリとアプリケーションを示しています。構造は、その両端に二つの異なる蛍光色素を付加することにより組織切片におけるDNA切断の2つの主要なタイプを標識する生体分子センサーです。

DNA損傷の検出のための半人工分子機械とその使用のin vitroでの組立に

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

in-vitro-assembly-semi-artificial-molecular-machine-its-use-for

Research

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Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

11.5K ビュー.  Baylor College of Medicine. 我々は、トポイソメラーゼのタンパク質を搭載した分子スケールデバイスのアセンブリとアプリケーションを示しています。構造は、その両端に二つの異なる蛍光色素を付加することにより組織切片におけるDNA切断の2つの主要なタイプを標識する生体分子センサーです。

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

核酸、タンパク質と低分子のReagentless検出用電気化学DNAバイオセンサーの作製

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

生物工学

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) has been demonstrated to increase MSC osteogenic differentiation in vitro and promote bone healing in clinical settings. Here we describe the construction of an EStim cell culture chamber and its use in treating rat bone-marrow-derived MSC to enhance osteogenic differentiation. We found that treating MSCs with EStim for 7 days results in a significant increase in the osteogenic differentiation, and importantly, this pro-osteogenic effect persists long after (7 days) EStim is discontinued. This approach of pretreating MSCs with EStim to enhance osteogenic differentiation could be used to optimize bone tissue engineering treatment outcomes and, thus, help them to achieve their full therapeutic potential. In addition to this application, this EStim cell culture chamber and protocol can also be used to investigate other EStim-sensitive cell behaviors, such as migration, proliferation, apoptosis, and scaffold attachment.

Here we present a protocol for the construction of a cell culture chamber designed to expose cells to various types of electrical stimulation, and its use in treating mesenchymal stem cells to enhance osteogenic differentiation.

建設と質間葉系幹細胞の骨分化を強化するため電気刺激室の使用

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.