이 연구는 체코 과학 재단 (GACR, 그랜트 17-12816S)에 의해 지원 되었다.

저자는 공개 상관이 있다.

이 논문에서는, 그것은 대사 중간체, 화학식 DNA의 세대에서 발생 하는 bioactivated 것 화학 물질의 효능 연구를 광범위 하 게 액세스할 수 있는 방법론 adducts 시연입니다. 이것은 중요 한 문제, 환경 화학 물질의 힘 이나 공유 DNA를 생성 하는 대사 산물을 그들의 효소 활성의 약물의 평가 adducts 때문에 암과 치료의 개발에 중요 한 필드입니다. 종양 개발의 원인으로 간주 하는 발암 물질에 의해 DNA의 수?...

환경 화학 물질 (약물) xenobiotics의 물질 대사는 두 단계1에서 발생합니다. 단계 I 및 II 더 친수성 원래 소수 (하지 수용 성) 화합물을 렌더링 하는 것을 목표로 (수용 성), 따라서 소변, 배설물 또는 땀을 통해 쉽게 excretable 그들을 만들기. 단계 (기능화) 반응을 포함 산화, 감소, 및 hydroxylation peroxidases (P450s, CYPs), 시 토 크롬 P450s와 같은 효소에 의해 촉매 (즉,., cyclooxygenase, 콕스), aldo keto reductases (AKRs), 및 microsomal 플 라빈 함유 monooxygenases (FMOs)입니다. 또한 감소 반응, reductases 즉, microsomal NADPH: 시 토 크롬 P450 환 원 효소 (POR) 및 cytosolic NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), 세 산화 효소 (XO), 그리고 알데하이드 산화 효소 (AO)1 의 다양 한에 의해 중재를 포함 하는 단계 . 두 번째 단계 (활용), 단계에 연결 된 기능 그룹에서에서 켤레 극성을 더욱 높이기 위해 작은 극 지 분자를 데 사용 됩니다. 단계 II는 sulfotransferases (SULTs), N, O-acetyltransferases (Nat), methyltransferases catechol-O-methyltransferase (COMT), 티 S-등의 반응에 참여 하는 것으로 간주 하는 효소의 예 transferases (GSTs), 그리고 uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGTs)1. 그러나 단계에서 효소의 분류 I 또는 II는,, 하지 경직 된, 그리고 일부 효소 틀림 없이 어느 범주에 그룹화 할 수 있습니다.
P450 효소 (EC 1.14.14.1) 헤 많은 화학, 그들의 변환3,4catalyzing의 생물학적에 참여, 다양 한 유기 체에 있는 단백질을 포함 하는. P450 효소 촉매 반응 어디 dioxygen의 1 개의 원자에 도입 xenobiotics, 분자 산소의 두 번째 아톰은 2 개의 전자 [방정식 (1 필요로 하는 반응에 의해 양식 물 감소 하는 동안 많은 기판의 hydroxylation )]3,4:
RH + O2 + NADPH + H+ → 노 + H2O + NADP+ (1)
P450 효소 포유류 세포 (microsomal P450 시스템)의 바인딩과 그물 막에 더 NADPH: 시 토 크롬 P450 환 원 효소 (POR) 및 시 토 크롬 b5 를 포함 하는 multienzyme monooxygenase 시스템의 구성원 인 NADH: 시 토 크롬 b5 reductase 효소의 기질 되 나. 일반적으로 허용된 이론 hypothesizes P450에 필요한 2 개의 전자의 기증자 NADPH/POR 시스템입니다. 그럼에도 불구 하 고, 시 토 크롬 b5 수 또한 역할 전자의 기증자 P450, 즉의 반응 주기의 두 번째 감소 동안 P450 감소 전자의 기증자로 어디 NADH: 시 토 크롬 b5 와 함께 작동 reductase2,,34.
포유류 활용 다양 한 P450 효소 (예를 들어, 가족 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26, 및 27의 효소) 스테로이드, 같은 귀중 한 내 인 성 화합물의 합성에 놓을 자연 제품2,3 에 대 한 그들을 사용 하 여 . 다른 CYP 포유류 효소, 인간의 CYP1A2, 2C 9, 2C 19 등 2D 6, 및 3A4, 마약으로 사용 되는 외 인 화학 물질 대사. 5 , 6 가장 중요 한 효소 약물의 대사를 catalyzing 3A subfamily, 특히 CYP3A4 CYPs는. 프로-발암 물질 등 프로-유독 xenobiotics의 변환 인간의 CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 및 3A42,5에 의해 중재 됩니다. 이러한 CYPs의 대부분 (CYP1A1 1B1 제외) 간에 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, CYPs는 여러 extrahepatic 장기에도 표현 됩니다. 이러한 P450s 주로 큰 의미의 있을 때 이러한 장기7에서 반응 중간체에 그들은 화학 물질 (약물)의 bioactivation 대사에 참여. 다양 한 P450s는 이것이 반드시 경우 비록 그들의 기질, 여러 화합물에 의해 유도 됩니다.
많은 P450 효소 화학 (마약) 독성에 역할을 재생합니다. 그들은 뿐만 아니라 자신의 해독 대사 산물에는 xenobiotics를 변환할 수 있지만 또한 수정 하는 또한 다른 생물 학적 속성을 일반적으로 그들의 독성을 일으키는 내 생 고분자 반응 종에 그들을 활성화 합니다. DNA, 지질, 및 단백질 반응 electrophiles 및 활성화 된 화학 물질에서 생성 된 래 디 칼에 의해 그들의 수정에 대 한 목표 수 있습니다. DNA의 경우 몇 가지 중요 한 유전자 응답 및 그들의 메커니즘 해결2,3,,45이미 알려져 있습니다.
DNA에 변화 세포 성장 제어, 감소 될 수 있습니다 그리고이 현상이 발암 과정의 개발을 선도 하는 주된 요인이 될 간주 됩니다. 화학식 DNA의 세대 adducts 화학 물질과 발암의 개시 단계에서 가장 중요 한 단계 중 하나는8,9,,1011처리 판단 데 발암 성 힘. 시연 되었다 DNA의 형성 관계 adducts 및 tumorigenesis 발생, 반면 DNA 양을 감소 adducts 자성8,,910, 에 대 한 책임은 11 , 12 , 13 , 14. 발암 물질/의약품 파생의 형성 DNA adducts의 DNA, 개별 기초에 따라 달라 집니다 그리고 DNA에이 기지의 시퀀스에 의해 영향을 받습니다. 수리의 DNA adducts는 그들의 위치 (베낀 또는 비 복사할 DNA 가닥) 및 수정 된 뉴클레오티드 시퀀스8,,1112,15의 종류에 16.
이 문서에서는, 우리 DNA를 수정 하는 대사 산물으로 활성화 될 그들의 힘을 조사 하기 위해 화학 물질 (마약)의 효소 촉매 변환 활용 절차 설명 (생성 하는 DNA adducts). 화학식 DNA 바인딩, 테스트 화합물 일반적으로 해야 개별 약물에 따라 산화 또는 감소 반응에 의해 활성화. 시험 된 화학 물질의 산화 또는 감소 활성화 P450 의존 효소 시스템 microsomal subcellular 분수에 의해 중재 또는 reductases 감소 하 여 microsomes (POR, NADH: 시 토 크롬 b5 에서 모두 환 원 효소, P450 효소)와 셀룰러 cytosolic subcellular 분수 (NQO1, XO, AO, 과산화 효소). 반응 metabolites 그 후 DNA를 바인딩할 adducts DNA를 형성. 산화와 감소 반응 이러한 반응 종에 여러 약물을 활성화 하는 것이 중요 하기 때문에, 산화/환 원 효소 시스템을 채용 하는 실험적인 절차 설명 합니다. 또한, 적절 한 방법을 감지 하 고 측정 이러한 DNA adducts 자세히 설명 되어 있습니다.
테스트 화학 효소 시스템에 의해 활성화 여부를 확인 하기 위해 두 개의 독립적인 절차 DNA에 바인딩되어 권장: 32P postlabeling 기술과 활용 표시 된 방사성 화합물 (예., 3H 또는 14 C). 첫 번째 파일럿, 32P postlabeling 분석 결과 검사 것이 좋습니다. 정확 하 게 평가 하는 솔루션에서 DNA 콘텐츠의 결정 두 가지 방법 모두 붙여야 합니다.
32P postlabeling 기술을 활용 하 여 비 방사성 화학 물질 (발암 물질/의약품) 3´-phosphodeoxynucleosides, 5´-방사성 인 (32P)와 추가 인 산화에 의해 수정 하는 DNA의 효소 가수분해 오 위치, 그리고 화학 deoxynucleotide의 분리 adducts 정상 (수정된) deoxynucleotides에서 크로마토그래피17 (그림 1)에 의해. DNA는 화합물에 의해 수정 endonuclease, micrococcal nuclease 및 비장 포스로 알려진 exonuclease의 혼합물에 의해 분해 됩니다. (수정 되지 않은) 두 정상을 포함 하 고 deoxyribonucleoside 3´-monophosphates 양식 5´- 에 pH 9.5에서 캐리어 (비 방사성) ATP 및 T4 polynucleotide 키 존재 [γ-32P] ATP와 반응 수정 hydrolyzed DNA의 혼합물 32P 표시 된 3´, 5´ bisphosphates ("표준" 절차 그림1에서). 사용 된 알칼리 pH에서 위치 3´ deoxyribonucleoside 3´ monophosphates dephosphorylate를 T4 polynucleotide 키의 효소 활동을 최소화 가능 하다. 분리 및 32의 해상도에서 adducts P 라는 화학 물질에 의해 수정 되지 않은 레이블된 deoxynucleotides multidirectional 음이온 교환 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) polyethyleneimine (페이) 셀 루 로스 (그림 2에 의해 수행 됩니다 ). (D1 및 D2 방향)에서 첫 번째 및 두 번째 차입 단계에서 [32P] 인산 염으로 레이블이 지정 된 정상 (수정된) deoxynucleotides는 eluted의 짧은 조각에 전해질의 물 솔루션을 사용 하 여 TLC 페이 셀 룰 로스 판의 시작에서 컬럼에 종이 전시 (발암 물질/약물-adducts) 소수 성 속성 바인딩된 화학 물질을 포함 하는 deoxynucleotides 또한 해결 해야 페이 셀 룰 로스 판의 시작에 유지 하는 반면 TLC 판 상단에 적용 와 d 3와 d 4 방향 (그림 2)에서 여러 다른 용 매 시스템. 국산화 adducts 화면 향상 autoradiography;를 사용 하 여 수행 분리 adducts x 선 필름에 어두운 인식할 수 있는 반점으로 검색 됩니다. 관광 명소의 지역 접시에서 excised 있으며 액체 섬광 또는 계산 Cerenkov 방사능을 측정 하는 데 사용. 이미징 방법 지도 및 DNA 계량에 적응 된 스토리지 인 adducts chromatograms 감지에 의해 32P postlabeling 분석 결과 지금 또한 사용 됩니다. 18 는 즉시 영상 기계 같은 검색 이용 자주 하 고 DNA의 정량화 adducts. 스크린의 기술 향상 autoradiography19보다 32P를 탐지 하기 위한 보다 10 배 더 높은 감도를 제공 합니다.
양의 DNA adducts의 상대 값 adduct 라벨 (RAL), 방정식 (2)를 사용 하 여 다음과 같이 계산으로 결정 됩니다.
노출 당 비용입니다. 에 deoxynucleotides adduct RAL =---(2) 32P-ATP의 특정 활동 (cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides
총 [adducted 고 정상 (수정된) deoxynucleotides]의 수 속도 RALs의 값은 adducted deoxynucleotides의 수의 비율 deoxynucleotides20,21. 그러나,이 계산을 기반으로 동등한 adducts의 효율성 라벨 및 일반 deoxynucleotides22. 그러나 다양 한 DNA adducts 32P postlabeling 기술의 고전 ("표준") 절차는 적절 한 (부피 또는 부피 비 adducts),, 그것의 감도 만족 스러운 감지 하에서 낮은 금액 DNA adducts. 이 절차를 사용 하 여 DNA (0.3 fmol adduct / µ g DNA)에 107 수정 되지 않은 deoxynucleotides에 adduct의 양을 감지입니다.
수정이 클래식 32P postlabeling 절차의 다양 한 기법의 감도 상승 이용 되어 있다. 10-100 배 더 높은 감도의 결정의 최대 32여 adducts P 라벨 달성 되었습니다 [γ-32P] ATP (강화 절차)의 제한 레벨을 사용 하 여. 23 , 24 32P postlabeling 방법의 감도 증가 소화 DNA 포함의 부 화를 활용 하 여 제공 하는 추가 절차 adducts nuclease P1 ( 푸른 곰 팡이 citrinum)에서21 (그림 1)와 함께. 이 효소는 바인딩된 화학 (adducted 뉴클레오티드)와 deoxynucleotides는 기본적으로 하지는 기질이이 효소의 수정 되지 않은 deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, dephosphorylate을 좋아한다. 따라서, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (즉, deoxyribonucleosides)에서 γ-32P [32P] 인산 하 여 T4 polynucleotide 키 니 아 제에 의해 phosphorylated 하지은] ATP. 그러나, 일부 화학 물질은 뉴클레오티드의 (adducted deoxynucleotides), deoxyguanosine,이 효소에 의해 수 bedephosphorylated의 c 8에서와 같은 arylamine adducts 대체. 대조적으로, 대부분 다른 adducts (adducts예를 들어, deoxyguanosine의 N2 에서 대체) nuclease p 1에 의해 dephosphorylated 하지. 32P postlabeling이 수정 게이 방법 상당히 더 민감한, 이상 3 개의 크기 순서에 의해 그것의 감도 증가. 또한,이 버전의 32P postlabeling 메서드를 제공 합니다 어디에 더 높은 양의 DNA (5-10 µ g) 및 캐리어 무료 초과 [γ- 32P] ATP는 이용 될 수 있다.
풍부 하 게 하는 또 다른 방법은 adducts, 굽타25설명 된는 물리를 활용 하 여 부피가 큰 deoxynucleotide의 속성 adducts는 n으로 추출 될 수 있다-단계 전송 에이전트 tetrabutylammonium 존재 butanol [32P] 인산 라벨, 수정 되지 않은 deoxynucleotides는이 유기 용 매 추출 저조한 반면 이전 염화 (미정) (그림 1). 그러나, 적은 소수 adducts, 구성 된 deoxynucleotides의 예 비 향기로운 부피가 moieties 또는 작은 알 킬 잔류물, 수정에 대 한 추출 되지 않습니다 효과적으로 n-butanol. 따라서, 그들은 32P postlabeling 방법의이 수정에 의해 분석 하면 기본적으로 감지 되지 않습니다.
모두 32P postlabeling 증가 감도 DNA의 정량화 adducts 엄청난 (최대 3 개의 크기 순서)의 이전에 언급 한 버전, 109,10 정상 당 adduct 하나를 검색할 수 있게 되 고 뉴클레오티드 (0.3-3 박 / µ g의 DNA). 이러한 두 가지 방법 covalently DNA를 바인딩할 그들의 효율성에 대 한 화학 물질을 테스트 하기 위한 권장 하 고, 따라서, 그들은 세부 사항에서이 작품에 설명 되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Roth</td><td>0032.8</td><td></td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol</td><td>Roth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Penta</td><td>70390-11000</td><td></td></tr><tr><td>Calf thymus DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4522</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>NADP&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5755</td><td></td></tr><tr><td>NADPH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7505</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose 6-phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647001</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose 6-phosphate dehydrogenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6378</td><td></td></tr><tr><td>Supersomes</td><td>Corning Gentest</td><td>456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202</td><td></td></tr><tr><td>Human liver microsomes</td><td>Corning Gentest</td><td>452172</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77662</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxypyrimidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H56800</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437549</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179272</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease from &lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II</td><td>Calbiochem</td><td>524711</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease P1 from &lt;em&gt;Penicillium citrinum&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8630</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163791</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Tetrabutylammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86870</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437603</td><td></td></tr><tr><td>T4-polynucleotide kinase</td><td>USB Corp</td><td>70031Y</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]ATP</td><td>Hartman Analytic GmbH</td><td>FP-201</td><td></td></tr><tr><td>PEI-impregnated cellulose TLC plates</td><td>Macherey-Nagel</td><td>801053</td><td></td></tr><tr><td>Packard Instant Imager A202400</td><td>Packard</td><td>G120337</td><td></td></tr><tr><td>Ellipticine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>285730</td><td></td></tr><tr><td>3-Nitrobenzanthrone</td><td>prepared (synthesized) as shown in ref. 40</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

formation of covalent dna adducts by enzymatically activated carcinogens and drugs in vitro and their determination by 32p-postlabeling

화학식 DNA adducts 화학 물질에 의해 형성 또는 발암 성 힘으로 약물 발암 과정의 개시 단계에서 가장 중요 한 요인의 하나로 판단 됩니다. 이 공유 바인딩 tumorigenesis의 원인으로 간주 됩니다, 이제 화학 발암의 중앙 교리로 평가 됩니다. 여기, 방법을 채용 시 토 크롬 P450 하 여 촉매 반응을 설명 하 고 화학 제품 또는 이러한 DNA를 형성 하는 대사 산물을 그들의 정품 인증에 대 한 약물의 효능을 조사 하기 위해 추가적인 생물학적 효소 adducts. 절차는 생물학적 효소 (microsomal와 cytosolic 샘플 한다 P450 또는 다른 생물학적 효소, 즉, peroxidases, NADPH: 시 토 크롬 P450 보유 세포 분수의 격리를 설명 하 되 게 됩니다. oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase, 또는 세 산화 효소). 방법 설명 또한, 이러한 효소 뿐만 아니라 DNA의 분리에 대 한 분석된 화학 물질의 대사 활성화를 위해 사용할 수 있는. 또한, 적절 한 방법을 감지 하 고 측정 화학/약물 파생 된 DNA adducts, 즉, 32P postlabeling 기술의 다른 수정 및 방사성 분류의 고용, 화학 분석 자세히 표시.

그들의 공유의 결과로 중간체를 대사에 화학 물질 (발암 물질/약)의 효능을 조사 하 효소 촉매 활성화 (즉, P450, 과산화 효소, reductase)의 활용에 대 한 여기에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 DNA에 바인딩 (세대의 DNA adducts), 우리 (대 한 검토 보고,29,,3031), 항 암 에이전트 ellipticine의 약리 작용의 (i)?...

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Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

형성 화학식 DNA Adducts 효소 활성화 된 발암 물질 및 생체 외에서 마약 및 32P postlabeling에 의해 그들의 결정에 의해

환경 약품 및 중간체 공유 DNA를 생성 하는 bioactivated adducts 효소 수 약물의 효능을 평가 암과 치료의 개발에 중요 한 필드입니다. 메서드는 양식에 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 기술 뿐만 아니라 DNA adducts 복합 활성화에 대 한 설명 합니다.

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

13.8K 조회수.  Charles University. 환경 약품 및 중간체 공유 DNA를 생성 하는 bioactivated adducts 효소 수 약물의 효능을 평가 암과 치료의 개발에 중요 한 필드입니다. 메서드는 양식에 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 기술 뿐만 아니라 DNA adducts 복합 활성화에 대 한 설명 합니다.

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Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

화학 생물학에서의 자유 부수 : 화학 행동의 Biomarker 개발에

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

연구

화학

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

유전학

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted mechanism of metabolic activation involves formation of &#945;-hydroxynitrosamines that spontaneously decompose to DNA alkylating agents. Accumulation of DNA damage and the resulting mutations can ultimately lead to cancer. New evidence indicates that &#945;-hydroxynitrosamines can be further oxidized to nitrosamides processively by cytochrome P450s. Because nitrosamides are generally more stable than &#945;-hydroxynitrosamines and can also alkylate DNA, nitrosamides may play a role in carcinogenesis. In this report, we describe a general protocol for evaluating nitrosamide production from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines. This protocol utilizes a general approach to the synthesis of the relevant nitrosamides and an in vitro cytochrome P450 metabolism assay using liquid chromatography-nanospray ionization-high resolution tandem mass spectrometry for detection. This method detected N&#8242;-nitrosonorcotinine as a minor metabolite of N&#8242;-nitrosonornicotine in the example study. The method has high sensitivity and selectively due to accurate mass detection. Application of this method to a wide variety of nitrosamine-cytochrome P450 systems will help determine the generality of this transformation. Because cytochrome P450s are polymorphic and vary in activity, a better understanding of nitrosamide formation could aid in individual cancer risk assessment.

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

&#945;-hydroxylation of carcinogenic nitrosamines by cytochrome P450s is the accepted metabolic pathway that produces DNA-damaging intermediates, which cause mutations. However, new data indicates further oxidation to nitrosamides can occur. We describe a general method for detecting nitrosamides produced from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines.

체 외에 대사 시 토 크롬 P450s에 의해 니트로의 Nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

암 연구학

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer therapies, such as radio- and chemotherapy, introduce enormous amount of additional DNA damage, leading to cell cycle arrest and apoptosis to limit cancer progression. Quantitative assessment of DNA damage during experimental cancer therapy is a key step to justify the effectiveness of a genotoxic agent. In this study, we focus on a single cell electrophoresis assay, also known as the comet assay, which can quantify single and double-strand DNA breaks in vitro. The comet assay is a DNA damage quantification method that is efficient and easy to perform, and has low time/budget demands and high reproducibility. Here, we highlight the utility of the comet assay for a preclinical study by evaluating the genotoxic effect of olaparib/temozolomide combination therapy to U251 glioma cells.

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

The comet assay is an efficient method to detect DNA damage including single and double-stranded DNA breaks. We describe alkaline and neutral comet assays to measure DNA damage in cancer cells to evaluate the therapeutic effect of chemotherapy.

DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

생체공학

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in mammalian cell lines. Rather than globally assaying removal of xenobiotic-induced or spontaneous chromosomal DPC removal, this assay examines the repair of a homogeneous, chemically defined lesion specifically introduced at one site within a plasmid DNA substrate. Importantly, this approach avoids the use of radioactive materials and is not dependent on expensive or highly-specialized technology. Instead, it relies on standard recombinant DNA procedures and widely available real-time, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrumentation. Given the inherent flexibility of the strategy utilized, the size of the crosslinked protein, as well as the nature of the chemical linkage and the precise DNA sequence context of the attachment site can be varied to address the respective contributions of these parameters to the overall efficiency of DPC repair. Using this method, plasmids containing a site-specific DPC were transfected into cells and low molecular weight DNA recovered at various times post-transfection. Recovered DNA is then subjected to strand-specific primer extension (SSPE) using a primer complementary to the damaged strand of the plasmid. Since the DPC lesion blocks Taq DNA polymerase, the ratio of repaired to un-repaired DNA can be quantitatively assessed using qPCR. Cycle threshold (CT) values are used to calculate percent repair at various time points in the respective cell lines. This SSPE-qPCR method can also be used to quantitatively assess the repair kinetics of any DNA adduct that blocks Taq polymerase.

The goal of this protocol is to quantify the repair of defined DNA-protein crosslinks on plasmid DNA. Lesioned plasmids are transfected into recipient mammalian cell lines and low-molecular weight harvested at multiple time points post-transfection. DNA repair kinetics are quantified using strand-specific primer extension followed by qPCR.

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Ubiquitylated, SUMOylated 및 ADP-Ribosylated DNA-Protein Crosslinks 측정

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

저자 스포트라이트: DNA 단백질 교차결합의 정량적 검출 및 번역 후 변형(Post-Translational Modifications)  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

생화학

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are electrophilic, generate reactive electrophiles upon biotransformation, or induce oxidative stress. Among the oxidized nucleobases, the most studied one is 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) or 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), a biomarker of oxidatively induced base damage in DNA. Aldehydes and epoxyaldehydes resulting from the lipid peroxidation process are electrophilic molecules able to form mutagenic exocyclic DNA adducts, such as the etheno adducts 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-&#949;dGuo) and 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-&#949;dAdo), which have been suggested as potential biomarkers in the pathophysiology of inflammation. Selective and sensitive methods for their quantification in DNA are necessary for the development of preventive strategies to slow down cell mutation rates and chronic disease development (e.g., cancer, neurodegenerative diseases). Among the sensitive methods available for their detection (high performance liquid chromatography coupled to electrochemical or tandem mass spectrometry detectors, comet assay, immunoassays, 32P-postlabeling), the most selective are those based on high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). Selectivity is an essential advantage when analyzing complex biological samples and HPLC-ESI-MS/MS evolved as the gold standard for quantification of modified nucleosides in biological matrices, such as DNA, urine, plasma and saliva. The use of isotopically labeled internal standards adds the advantage of corrections for molecule losses during the DNA hydrolysis and analyte enrichment steps, as well as for differences of the analyte ionization between samples. It also aids in the identification of the correct chromatographic peak when more than one peak is present.
We present here validated sensitive, accurate and precise HPLC-ESI-MS/MS methods that were successfully applied for the quantification of 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo and 1,N2-dGuo in lung, liver and kidney DNA of A/J mice for the assessment of the effects of ambient PM2.5 exposure.

We describe here methods for sensitive and accurate quantification of the lesions 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,N6-etheno-2&#39;-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) and 1,N2-etheno-2&#39;-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in DNA. The methods were applied to the assessment of the effects of ambient fine particulate matter (PM2.5) in tissues (lung, liver and kidney) of exposed A/J mice.

형성 화학식 DNA Adducts 효소 활성화 된 발암 물질 및 생체 외에서 마약 및 ³²P postlabeling에 의해 그들의 결정에 의해

요약

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DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

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질량 분 광 법에 의해 3 개의 DNA 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가