自然科学基礎の中国広東 (2015A030313500)、地方キー国際協同組合研究プラットフォームと主要な科学研究プロジェクトの広東高等教育 (2015KGJHZ015)、科学によって資金が供給されたこの作品、広東省タバコの独占管理 (201403, 201705)、科学技術学部学生 (201711078001) のためのナショナル ・ イノベーション ・ トレーニング プロジェクト (2016B020201001)、中国の広東省の計画の技術計画。商号またはこの文書での商用製品の言及は固有の情報を提供する目的は、勧告または米国農務省によって承認とは限りません。米国農務省は、機会均等のプロバイダーと雇用者です。

1. SSR マーカーの PCR の製品の準備
<ol><li>テンプレート DNA を含む PCR の反作用のすべての化学薬品および試薬の準備 (30 ng/μ L)、2 × PCR マスター ミックス (2 × PCR バッファー、各 dNTP、MgCl2、Taq DNA ポリメラーゼと染料の 0.1 U/μ L の 3 mM の 0.4 mM を含む)、それぞれの 10 μ M 前方およびプライマーを逆引き、、蒸留水または脱イオン水 (dH2O)。 注: 本研究で使用される SSR マーカーだった PT51333 (プライマー シーケンスを転送: 5 '- GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' と逆プライマー シーケンス: 5'- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') と PT50903 (プライマー シーケンスを転送: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' と逆プライマー シーケンス: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3') タバコと CX 43 (プライマー シーケンスを転送: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' と逆プライマー シーケンス: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') と CX 157 (プライマー シーケンスを転送: 5 '-TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 'と逆プライマー シーケンス: 5'- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') 開花白菜の。</li>
	<li>テンプレート DNA、dH2O. 2.6 μ L、それぞれ前方のプライマーおよび逆プライマーの 0.2 μ L 2 × PCR マスター ミックスの 5 μ L の 2 μ L の追加によって増幅 PCR ミックスの 10 μ L を準備します。</li>
	<li>94 ° C、5 分の最初のステップとたちの PCR 増幅反応を実行、以下の 45 の 38 サイクル 45 変性 94 ° c s s プライマーのアニーリングのための 55 の ° c との拡張のための 72 ° c 1 分、72 ° で 10 分間の最終拡張ステップC;後で使用のための 4 ° C で PCR の製品を保管してください。</li>
</ol>2. 溶液の調製のポリアクリルアミドのゲルの鋳造
<ol><li>基本トリスと dH2O で 27.5 g ホウ酸の 54 g 溶解、0.5 M の EDTA (pH 8.0) 20 mL を追加して 1, 000 mL dH2o. の最終的なボリュームにソリューションを調整する 5 × TBE バッファーの 1 L を準備します。 注: TBE バッファーは、ヶ月室温で保存することができます。</li>
	<li>DH2O 2 L の最終巻に 200 mL の 5 × TBE バッファーを追加することで 0.5 × TBE バッファーの 2 L を準備し、常温で保存します。</li>
	<li>29 g 分子生物学グレード アクリルアミドと分子生物学グレード N、N 1 g を溶解することにより 6% 非変性ポリアクリルアミド ゲル溶液の準備 '-0.5 × TBE バッファー 500 mL の最終巻に methylenebisacrylamide。アルミ箔と後で使用のための 4 ° C でのストア ソリューション ボトルをカバーします。 注意: アクリルアミドは強力な神経毒を考慮され、注意して処理する必要があります。粉末とそれを含む処理ソリューションの重量を量るとき常に手袋を着用します。</li>
	<li>DH2O 10 mL の最終巻に AP の 2 g を溶解することにより 20% アンモニウムの過硫酸 (APS) 溶液を準備します。ヶ月の-20 ° C で保存できます。 注: 利便性のため 20 %aps 溶液 10 mL、1.5 mL や 2 mL 遠沈管-20 ° C で保存用検体解凍、使用前によく混ぜます。</li>
	<li>3 μ L の 95% エタノール, 酢酸の 0.5% の 0.997 mL でバインド シランを溶解することにより希釈バインド シラン溶液を調製します。週間の 4 ° C で保存できます。 注意: バインド シランは有毒である、ソリューションを取り扱うときに手袋を着用する、部屋の換気をしてください。</li>
</ol>3. 電気泳動ポリアクリルアミド ゲルの調製
<ol><li>ガラス板と dH2方面の空気と完全な洗浄によって続かれる水道水で洗剤とスペーサーの洗浄セット乾燥プレート物干しラック プレートでそれらを設定します。</li>
	<li>長方形のガラス板で 5 分乾燥の内側の面にバインド シラン溶液 1 mL を分散させます。 注: バインドしらん溶液がプレートの表面に均一に広がらない、ゲルが戸建染色中になり、不満足な染色効果が発生します。</li>
	<li>綿棒で切欠きを有するガラス板の内側の面に撃退するシランの 1 mL を分散、過剰を撃退するシラン ティッシュ ペーパーでふき取るし、エアーで 5 分間乾燥させます。 注: 反発シラン処理剤では、ガラス板の表面を均一に塗らない場合、それ部分的ストリッピングによってゲルを損傷があります。</li>
	<li>上では、スペーサーで切欠き平板のガラス板を組み立てる、クランプを鋳造とアセンブリの両方の側面をクランプします。</li>
	<li>1.5 mm 幅 33 センチ × 高さ 10 センチ ・ スペーサー厚さのプレート セットのビーカーに 6% の非変化のポリアクリルアミドゲル ソリューションの適切な量 (40 mL) を注ぎ、テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 20 μ L と 200 µLfresh 20% 追加 AP、軽く混ぜます。 注: ゲル溶液の適量 (40 mL) は、スペーサー (30 cm × 8.5 cm × 0.15 センチメートル) の厚さで 2 枚の板の内容積から計算しました。ゲル重合 TEMED と AP の量、TEMED と参照17に基づく AP にゲル溶液の標準的な比率はあります。上記で説明したゲル溶液は 4 ° C で保存されています。ゲル溶液は室温、TEMED の 20 μ L、100 μ L の AP を使用する必要があります 20% に格納されているかどうか。優しくソリューション内の空気の泡を避けるためにガラス棒でゲル溶液の混合物をかき混ぜなさい。</li>
	<li>すぐに溶液を注ぐと慎重に切欠き平板の縁に沿って組み立てられたガラス板に上にほとんどスペースを埋める、櫛を挿入します。櫛上ゲル溶液の少量を追加します。 注: は、ガラス板をゲルの漏れを防ぐために水平に保ちます。必要に応じては、バブルのフックで任意の気泡を削除します。</li>
	<li>室温で 30 分に設定するゲルを許可します。 注意: 重合のための時間は、ゲル溶液と環境の温度を使って変更できます。</li>
	<li>ゲルが完全に重合、鋳造クランプを削除し上部バッファー貯水池へ向いている切欠き平板の電気泳動のタンク ユニットのプレート セットの位置し、タンク ユニットにセットするプレートを取り付けるに鉗子を使用します。</li>
	<li>上部の各 0.5 × TBE バッファーと下側の部屋の 1 L を注ぎなさい。櫛を取り外して、ピペットやスポイトを使用してバッファーのすべての井戸を洗い流してください。 注意: 必ずゲル サンドイッチ プレートの下部には、任意の気泡なしバッファーでずぶ濡れ。</li>
</ol>4. 実行ゲルします。
<ol><li>ポリアクリルアミド ゲルのウェルに PCR の製品の約 1 μ L をロードします。PCR の製品のサンプルと一緒にゲルの両側に DNA のサイズの梯子をロードします。上部バッファー区域に安全カバーを固定します。</li>
	<li>赤は赤と黒を黒に、色分けされた一致する電源にリード線を接続します。染料 〜 70 分の普通の定義された位置に到達するまで、110 V の定電圧でゲルを実行します。 注: PCR の製品のサイズに応じて電圧と実行時間を調整できます。</li>
</ol>5. 銀の汚損のポリアクリルアミド ゲルの SSR マーカーを検出するため
<ol><li>電気泳動後、大きなビーカー経由でバルブに参院からバッファーを抜きます。デタッチ側クランプし、装置からプレートを削除、慎重にへらで、片側切欠きを有するガラス板を分離、ゲルのまま他のガラス プレートに取り付けがバインド シラン コーティングことを確認します。</li>
	<li>DH2O の 900 mL の NaOH の 10 g を溶解してアグノ3 dH2O. 準備 1 L 新鮮な開発ソリューションの 1 l の 1.5 g を溶解することにより新鮮な含浸液の 1 L を作る、37% ホルムアルデヒドの 1 mL を追加、し、dH2o. を使用して 1 L の最終的なボリュームに調整 注: は、手袋を着用し、上記の化学薬品と注意してソリューションを処理します。暗闇の中、ソリューションおよびソリューションで対応する手順を保持する必要はありません。</li>
	<li>慎重に十分な dH2O 電気泳動バッファーを削除し、プラスチック トレイの上に直面しているゲルでプレートを置き、含浸液の 1 L のゲルが水没するとゲル、ガラス プレートをすすいでください。シェーカーにトレイを置きます。</li>
	<li>3 〜 4 分の 60 r/分でトレイを軽く振る。 注: 場合によっては、ゲルの厚み、硝酸銀含浸液の濃度によると、揺れ時間調整できます。</li>
	<li>含浸ソリューションからプレートを移動し、別のトレイにそれを置きます。プレートと 3-5 秒ごとに 2 回十分な dH2O を使用してゲルの表面からオフの残留含浸ソリューションをすすいでください。</li>
	<li>ゲルの別のトレイの上に上向きでプレートを置き、開発ソリューションの 1 L でプレートが水没し、50 r/分 〜 3 分 DNA のフラグメントのモニターでトレイを軽く振る、DNA の信号の最も高い比率の断片と開発を停止 背景のノイズが観察される (このステップは 〜 3 分かかります)。</li>
	<li>プレートと十分な dH2O のゲルを 2 回、リンス、ティッシュ ペーパーでゲル板を乾燥します。</li>
	<li>適切なスキャナーを使用してゲルをスキャンします。300 dpi の解像度では、DNA のフラグメントを明確に可視化を提供します。ゲルは、カメラを使用して撮影することができますも。</li>
	<li>SSR マーカーのバンディング パターンは、イメージで DNA のフラグメントに基づいて獲得できます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jiang, G. L., Anderson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+and+marker-assisted+breeding+in+plants.">Molecular markers and marker-assisted breeding in plants.</a> Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).</li><li>Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphism+revealed+by+simple+sequence+repeats.">Polymorphism revealed by simple sequence repeats.</a> Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).</li><li>Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. 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C., Pareek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+way+to+detect+small+polymorphic+bands+in+plants.">Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants.</a> Genome Data. 5, 218-222 (2015).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple+and+effective+silver+staining+protocol+for+detection+of+DNA+fragments.">Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments.</a> Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).</li><li>Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost,+high-throughput+polyacrylamide+gel+electrophoresis+system+for+genotyping+with+microsatellite+DNA+markers.">A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers.</a> Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).</li><li>Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microsatellite+markers+in+eastern+white+pine.">Characterization of microsatellite markers in eastern white pine.</a> Genome. 39, 1102-1108 (1996).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

含浸後ゲルの洗浄は重要なステップです。不十分な洗浄時間と水の量がプレートと、ゲルの表面に含浸液の不完全な除去を引き起こす、暗い背景に 。適切な現像時間は別の重要なステップは、過剰開発 DNA のフラグメントの低コントラストの画像で暗いブラウン バック グラウンドで結果することができます。さらに、受精のステップは DNA のフラグメントの染色効率を大きく影響します。含...

Pcr マーカーの開発植物遺伝学、繁殖1の科学革命をもたらしました。単純なシーケンス繰り返し (SSR) マーカーは最も一般的に使用される、最も多目的な DNA マーカーの一つです。彼らのゲノム広いカバレッジ、豊かさ、ゲノムの特異性と再現性は、ヘテロ接合体の遺伝子型2の検出のための優性遺伝に加えて SSR マーカーのメリットの一部です。いくつかの研究は、遺伝的多様性を調査、家系を追跡、遺伝的連鎖地図の構築、経済的に重要な形質の3,の4遺伝子をマップする SSR マーカーを使用しています。
アガロース、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、エチジウム ブロマイドで染色後銀製の汚損または UV 光の下での可視化、SSR マーカーの PCR の製品は通常区切られます。ポリアクリルアミドゲルの DNA のフラグメントの銀製の汚損はその他染色方法5,6より敏感と SSR マーカー7などの DNA 断片を検出するため広く使用されています。
多くの生物学研究所技術のようなポリアクリルアミドゲルの銀製の汚損は着実にその最初されて報告 1979年8のフラグメントの可視化技術として改善します。手法は当初バッサムらによって DNA のフラグメントの検出のために変更されました。6 1991 年 1994 年サングイネッティと同僚9改良と。メソッドは、最後数十年6,7,9,10、11,12,13,の14にさらに最適化されています,15しますただし、これらの更新されたバージョンのプロトコルのほとんどまだこれらのプロトコルの7のアプリケーションを制限するなど技術の需要が高いと長い処理時間固定用マウント6、いくつかの欠点がある。 11。DNA フラグメントの検出の高効率と低コストを組み合わせた最適なプロトコルは、生物学の研究を汚す銀のルーチン用が急務します。
さらに、電気泳動法は、変性と非変性ポリアクリルアミドゲルに分けることが、銀染色法を用いる SSR マーカーの検出のため両方使用できます。効果と解決策は大きく違いはありません、しかし、非変性ポリアクリルアミドゲル処理しやすい少ない時間16。
以前の研究15, に基づいて現在の研究の目的は、最適化された銀の汚損のプロトコルの非変化のポリアクリルアミドゲルの SSR マーカーの検出を迅速、簡単かつ低コストの詳細を記述するためです。

<table><tbody><tr><td>PCR master mix (Green Taq Mix)</td><td>Vazyme Biotech Co. Ltd, China</td><td>#P131-03</td><td></td></tr><tr><td>50-2000 bp DNA Ladder</td><td>Bio-Rad, USA</td><td>#170-8200</td><td></td></tr><tr><td>DL500 DNA marker</td><td>Takara Bio Inc., Japan</td><td>#3590A</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#79-06-1</td><td></td></tr><tr><td>N,N&#039;-methylene-bis-acrylamide</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#110-26-9</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&#039;,N&#039;-Tetramethylethylenediamine</td><td>Sangon Biotech Shanghai, China</td><td>#110-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Bind-silane</td><td>Solarbio Beijing, China</td><td>#B8150</td><td></td></tr><tr><td>AgNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China</td><td>#7761-88-8</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td><td>#50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td><td>#497-19-8</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>HNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td><td>#7697-37-2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China</td><td>#10102-17-7</td><td></td></tr><tr><td>Eriochrome black T(EBT)</td><td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td><td>#1787-61-7</td><td></td></tr><tr><td>Plastic tray</td><td>Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TS-1 Shaker</td><td>Qilinbeter JiangSu, China</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>BenQ M800 Scanner</td><td>BenQ, China</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DYY-6C Power supply</td><td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>High throughout vertical gel systems, JY-SCZF</td><td>Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

a fast silver staining protocol enabling simple and efficient detection of ssr markers using a non-denaturing polyacrylamide gel

簡単なシーケンスを繰り返します (SSR) は、植物や動物の遺伝学的研究と分子育種プログラムで使用する最も効果的なマーカーの 1 つです。銀染色、電気泳動法における SSR マーカーの検出のため広く使用されている方法です。ただし、銀製の汚損のプロトコルを従来は技術的にデマンドが高い、時間がかかるです。他の多くの生物学研究所のようなプロトコルを汚す銀の技術を着実に検出効率を改善するために最適化されています。ここでは、簡略化された銀染色法大幅試薬コストを削減し、検出の解像度と画像の透明度を高めることを報告します。新しいメソッドは非変化のポリアクリルアミドゲルの処理のわずか 7 分と 3 つの試薬 (銀硝酸、水酸化ナトリウム、ホルムアルデヒド) (含浸および開発) 2 つの主要な手順が必要です。以前に報告されたプロトコルと比較して、この新しい方法はより速く、簡単ですし、SSR 検出のため少ない化学試薬を使用します。したがって、このシンプル、低コストで効果的な銀の汚損のプロトコルは遺伝のマップおよび SSR マーカー データの迅速な生成によるマーカー育種法を役立ちます。

PCR 産物は、開花白菜とタバコで対応する SSR プライマーのペアを使用して作り出されました。後電気泳動ポリアクリルアミドのゲルは、SSR マーカー (図 1) のバンド パターンを明確に検出のプロトコルを汚す上銀を使用して染色された.
異なる銀の汚損のプロトコルの検出効率を比較するためタバコ?...

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A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

ここで、シンプルかつ低コストのシルバーのみ 3 つの試薬および処理の 7 分を必要とし、遺伝子解析で高品質な SSR データの高速生成に適したプロトコルを汚すを報告します。

高速銀染色プロトコルを有効にする簡単なと非変化のポリアクリルアミドゲルを用いた SSR マーカーの効率的な検出

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

a-fast-silver-staining-protocol-enabling-simple-efficient-detection

Research

JoVE Journal

Genetics

10.7K ビュー.  Guangzhou University. ここで、シンプルかつ低コストのシルバーのみ 3 つの試薬および処理の 7 分を必要とし、遺伝子解析で高品質な SSR データの高速生成に適したプロトコルを汚すを報告します。

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An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

生化学

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the formation of a colored precipitate. It works by soaking the acrylamide or agarose DNA gel in a solution of 1x (equivalent to 2.0 &#181;M) SYBR Green I (SG I) and 0.20 mM nitro blue tetrazolium that produces a purple precipitate of formazan when exposed to sunlight or specifically blue light. Also, DNA recovery tests were performed using an ampicillin resistant plasmid in an agarose gel stained with our method. A larger number of colonies was obtained with our method than with traditional staining using SG I with ultraviolet illumination. The described method is fast, specific, and non-toxic for DNA detection, allowing visualization of biomolecules to the "naked eye" without a transilluminator, and is inexpensive and appropriate for field use. For these reasons, our new DNA staining method has potential benefits to both research and industry.

This method allows selective staining and quantification of DNA in gels by soaking the gel in a SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium solution and then exposing it to sunlight or a blue light source. This produces a visible precipitate and requires almost no equipment, making it ideal for field use.

DNA 染色青い光曝露による塩の沈殿物に基づく法

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

ゲルでタンパク質を染色

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

生物学

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

免疫・感染学

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The classic silver stains have certain drawbacks, such as high background staining, poor protein recovery, low reproducibility, a narrow linear dynamic range for quantification, and limited compatibility with mass spectrometry (MS). Now, with the use of a fluorogenic Ag+ probe, TPE-4TA, we developed a fluorescent silver staining method for the total protein visualization in polyacrylamide gels. This new stain avoids the troublesome silver reduction step in traditional silver stains. Moreover, the fluorescent silver stain demonstrates good reproducibility, sensitivity, and linear quantification in protein detection, making it a useful and practical protein gel stain.

Here, we describe a detailed protocol outlining a new fluorescent staining technique for total protein detection in polyacrylamide gels. The protocol utilizes a silver ion-specific fluorescence turn-on probe, which detects Ag+-protein complexes, and eliminates certain limitations of traditional chromogenic silver stains.

蛍光タンパク質のポリアクリルアミドゲルの銀製の汚損

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, respectively. As many gel-imaging techniques use nonspecific stains or expensive fluorophore probes, sensitive, discriminating, and economical gel-imaging methodologies are highly desirable. RNA Mango core sequences are small (19&#8211;22 nt) sequence motifs that, when closed by an arbitrary RNA stem, can be simply and inexpensively appended to an RNA of interest. These Mango tags bind with high affinity and specificity to a thiazole-orange fluorophore ligand called TO1-Biotin, which becomes thousands of times more fluorescent upon binding. Here we show that Mango I, II, III, and IV can be used to specifically image RNA in gels with high sensitivity. As little as 62.5 fmol of RNA in native gels and 125 fmol of RNA in denaturing gels can be detected by soaking gels in an imaging buffer containing potassium and 20 nM TO1-Biotin for 30 min. We demonstrate the specificity of the Mango-tagged system by imaging a Mango-tagged 6S bacterial RNA in the context of a complex mixture of total bacterial RNA.

Here we present a sensitive, rapid, and discriminating post-gel staining method to image RNAs tagged with RNA Mango aptamers I, II, III, or IV, using either native or denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) gels. After running standard PAGE gels, Mango-tagged RNA can be easily stained with TO1-Biotin and then analyzed using commonly available fluorescence readers.

ポスト染色法によるポリアクリルアミドゲル中のマンゴータグRNAの蛍光可視化

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role in a variety of basic biological structures and processes. As polymers, GAGs exist as a polydisperse mixture containing polysaccharide chains that can range from 4000 Da to well over 40,000 Da. Within these chains exists domains of sulfation, conferring a pattern of negative charge that facilitates interaction with positively charged residues of cognate protein ligands. Sulfated domains of GAGs must be of sufficient length to allow for these electrostatic interactions. To understand the function of GAGs in biological tissues, the investigator must be able to isolate, purify, and measure the size of GAGs. This report describes a practical and versatile polyacrylamide gel electrophoresis-based technique that can be leveraged to resolve relatively small differences in size between GAGs isolated from a variety of biological tissue types.

This report describes techniques to isolate and purify sulfated glycosaminoglycans (GAGs) from biological samples and a polyacrylamide gel electrophoresis approach to approximate their size. GAGs contribute to tissue structure and influence signaling processes via electrostatic interaction with proteins. GAG polymer length contributes to their binding affinity for cognate ligands.

ポリアクリルアミドゲル電気泳動と銀染色によるグリコサミノグリカンの検出

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

Source: Sultana, S. et al. <a href="https://www.jove.com/v/62628">Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor</a>. J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

タンパク質分析のためのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動:分子量に基づいてタンパク質を分離し、可視化する技術

Source: Sultana, S. et al. Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor. J. Vis. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

生物学的手法

電気泳動技術

Fluorescent Silver Staining: A Technique to Visualize Total Protein in Polyacrylamide Gels

After electrophoresis, submerge the gel in a 100-milliliter solution containing ethanol and acetic acid on an orbital shaker, and incubate twice for 30 minutes each, at room temperature while shaking at 50 RPM. Next, wash the gel three times with ultrapure water in a clean container, with each wash lasting 10 minutes.
First, dissolve 0.01 grams of silver nitrate in 10 milliliters of ultrapure water to prepare a stock solution with a concentration of 0.1%. Add 100 microliters of this stock solution into 100 milliliters of ultrapure water to make the silver nitrate working solution. In a fume hood, submerge the gel in 100 milliliters of the silver nitrate working solution in a sealed glass chamber.
Use aluminum foil to protect the gel from light during impregnation, and incubate for 1 hour while shaking at 50 RPM on an orbital shaker. After this, wash the gel twice with ultrapure water in a clean container, with each wash using approximately 100 milliliters of water and lasting 60 seconds.
It is important to use ultrapure water to clean the gel after the silver impregnation step to minimize background staining.
First, add 50 milliliters of ultrapure water to 3 milligrams of TPE-4TA dye. Sonicate the solution for 3 minutes, and add 5 microliters of 1 molar sodium hydroxide solution in between each sonication session, to help dissolve the dye, usually up to three times. Then, check the fluorescence of the solution under a 365-nanometer UV lamp to ensure that the dye is fully dissolved. Only weak or non-emissive solutions indicate full dissolution.
To prepare the fluorogenic developing solution, add 10 milliliters of the TPE-4TA stock solution to 90 milliliters of ultrapure water. Use a pH meter to check the pH of the solution. Tune the solution to a pH between 7 and 9, using diluted sodium hydroxide solution or acetic acid, if the pH is out of range.
Next, transfer the gel to a clean and sealable container with 100 milliliters of the fluorogenic developing solution, and ensure that the gel is completely immersed. Seal the container, and cover it to protect it from light. Shake the container overnight on an orbital shaker at 50 RPM and at room temperature.
Transfer the gel to a clean container, and de-stain it in 100 milliliters of 10% ethanol for 30 minutes. Then, rinse the gel in ultrapure water for 5 minutes. The gel can be visualized on a benchtop trans-illuminator, or imaged on a gel documentation machine at the 365-nanometer channel or the 302-nanometer channel.