これは、蛍光化銀プローブを利用して従来の銀染色を蛍光銀染色に変換する新規のゲル染色法です。この方法は、アルデヒドを含まない簡単で簡単なプロトコルを使用しながら、従来の硝酸銀染色およびSYPROルビー染色と比較して性能が向上した。この手順を実証することは、私の研究室の研究アシスタントであるアレックス・ウォンです。
この手順を開始するには、蒸留水、LDSバッファー、およびサンプル還元剤を含む溶液でタンパク質サンプルを希釈します。MES バッファーを充填したミニゲルタンクをセットして、4-12%Bis-Tris プロテインゲルを使用して SDS-PAGE を実行します。調製したタンパク質サンプルでウェルをロードし、30分間200ボルトの一定電圧でゲルを実行します。
電気泳動後、エタノールと酢酸を含む100ミリリットル溶液にゲルを軌道シェーカーに沈め、50rpmで振りながら室温でそれぞれ30分間2回インキュベートする。次に、洗浄を10分間続けて、清潔な容器に超純水でゲルを3回洗います。まず、0.01グラムの硝酸銀を10ミリリットルの超純水に溶解し、100マイクロリットルのストック溶液を100マイクロリットルの超純水に加えて硝酸銀を働く溶液に調製します。
ヒュームフードに、密閉ガラス室に硝酸銀の働く溶液の100ミリリットルでゲルを沈めます。アルミホイルを使用して含浸中にゲルを光から保護し、軌道シェーカーで50rpmで振りながら1時間インキュベートします。その後、ゲルを超純水で2回洗浄し、洗浄水を約100ミリリットルで洗浄し、60秒間持続します。
銀含浸工程後のゲルを洗浄するためには、背景染色を最小限に抑えるために、超純水を使用することが重要です。まず、TPE-4TA染料の3ミリグラムに超純水の50ミリリットルを追加します。3分間溶液を超音波処理し、各超音波処理セッションの間に1モル水酸化ナトリウム溶液の5マイクロリットルを追加して、染料を溶解させ、通常は3回まで。
次に、365ナノメートルのUVランプの下で溶液の蛍光をチェックして、色素が完全に溶解していることを確認します。完全溶解を示しているのは、弱い溶液または非発光溶液のみです。蛍光発生溶液を調製するには、TPE-4TAストック溶液の10ミリリットルを90ミリリットルの超純水に加えます。
pHメーターを使用して、溶液のpHをチェックします。溶液を7~9の間のpHに調整し、pHが範囲外の場合は水酸化ナトリウム溶液または酢酸を希釈して使用します。次に、100ミリリットルの蛍光発生溶液を含む清潔で密封可能な容器にゲルを移し、ゲルが完全に浸漬されていることを確認します。
容器を密封し、それを覆って光から守ります。50 rpmで軌道シェーカーで一晩、室温で容器を振ります。ゲルを清潔な容器に移し、100ミリリットルのエタノールで30分間脱塩します。
その後、ゲルを超純水で5分間リンスします。このゲルは、ベンチトップのトランイルミニューエータで視覚化したり、365ナノメートルチャンネルまたは302ナノメートルチャンネルのゲルドキュメンテーションマシンで画像化することができます。本研究では、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質を染色するために、新しい蛍光性銀染色法が用いられている。
蛍光性銀染色で染色されたタンパク質バンドは、365ナノメートルのUVランプの下で強烈な緑色を示す。全14個のタンパク質バンドがはっきりと見え、SYPROルビー色素によって染色された赤色のバンドとよく相関しています。この蛍光銀染色法は、高分解能を有しているように見える。
一部のタンパク質バンドでは、蛍光性銀染色の感度も、蛍光性SYPROルビー染色の感度よりもわずかに優れています。特にこの染色の性能は、10~40キロダルトンのタンパク質バンドに対して改善され、この新しい方法が低分子量のタンパク質の検出に特に有用であることを示している。見られるように、このデータは、蛍光銀染色が比較的広い範囲のタンパク質定量に関して、14タンパク質すべてに良好かつ均一な直線性を与えることも示唆している。
硝酸銀染色は高いレベルのバックグラウンドシグナルと歪んだピークを与えましたが、蛍光銀染色は、14タンパク質すべてにわたってSYPRO Ruby染色に匹敵する良好なコントラストと均一な強度分布を持つバンドを検出しました。洗浄工程は、銀含浸またはフッ素発生を妨げる残留固定溶液を制限するため重要です。硝酸銀を使用する場合は、皮膚の接触を避けてください。
すぐにこぼれをきれいにしてください。防護服や手袋を着用し、化学廃棄物として処分する。
