このプロトコルは、存在を検出し、多くの生物学的プロセスにとってますます認識される重要性の分子であるグリコサミノグリカンの長さを測定するために使用できる簡単な技術を記述する。この技術は、ほとんどのライフサイエンス研究所に容易に適応可能である。同等のグリコミック技術は、多くの場合、グリコ化学研究所でしか見つからならない装置や専門知識を必要とします。
この技術は、人体の内皮および上皮表面に並ぶ多糖コートであるグリコカリックスの研究に興味がある研究者にとって特に有用である可能性がある。まず、空のカセットをPAGEタンクに入れます。15ミリリットルチューブに10%の過硫酸アンモニウムで調製したての60マイクロリットルとゲル溶液を分解する10ミリリットルを混合して、溶解ゲルをキャストします。
その後、10マイクロリットルのTEMEDを加えます。チューブを2~3回やさしく反転します。ピペットを使用して、活性化ポリアクリルアミドゲル溶液の10ミリリットルをカセットに素早く加えます。
2ミリリットルの脱イオン濾過水で重ね、30分間重合するゲルを分解させます。溶解ゲルが完全に重合した後、重ね合わされた水を捨てます。積層ゲル溶液の3ミリリットルを、15ミリリットルのチューブに作りたての10%過硫酸アンモニウムの90マイクロリットルと混合して、積み重ねゲルをキャストします。
その後、TEMEDの3マイクロリットルを追加し、チューブを2〜3回穏やかに反転します。ピペットを使用して、カセットがつばに充填されるまで、固化した解決ゲルの上に積み重ねゲル溶液を素早く加えます。空のポリアクリルアミドゲルカセットに含まれる櫛を完全に挿入し、積層ゲルを30分間重合させます。
ゲルを重合したら、カセットの底面からテープストリップを取り出し、カセットをPAGEタンクアセンブリに戻します。上部および下部のチャンバーに、それぞれのバッファー溶液を充填します。乾燥したグリコサミノグリカンサンプルを最小必要量の脱イオン濾過水に溶解し、サンプルローディングバッファーと1対1の比率で混合します。
サンプルとHSオリゴ糖のはしごをゲルに入れます。ゲルを100ボルトで5分間前走し、200ボルトで200ボルトで200ボルトで200ボルトで、分解ゲル溶液のアクリルアミド率に応じて実行します。実行が完了したら、カセットを分解し、除去されたろ過水で満たされた大きなきれいな容器にゲルを慎重に抽出します。
その後、水を捨て、5分間アルシアブルー染色液でゲルを染色します。アルシアブルーの汚れを捨て、アルシアブルー染色液の大部分が取り除かれるまで、脱イオン濾過水で2〜3回素早く洗浄します。新鮮な清潔な容器にゲルを硝酸銀染色液で30分間染色します。
その後、脱イオン濾過水でそれぞれ30分間2〜3回洗浄し、銀染色液を完全に除去します。水を捨て、開発ソリューションを追加します。バンドの外観についてはゲルをよく観察してください。
汚れの品質とサンプルの質量に応じて、開発は数秒から数分かかる場合があります。目的のバンドが見えなければすぐに現れるので、現像液をすぐに捨て、STOP溶液でゲルを短時間洗います。単離および精製グリコサミノグリカンを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による密度依存分解後にアルシアンブルーおよび銀染色法を用いて可視化した。
この図に見られるように、異なるポリマー長のヘパラン硫酸オリゴ糖は、このPAGEベースのアプローチを用いて容易に検出可能であった。この方法の検出限界は、0.5マイクログラムと低く、生物学的サンプルから単離および精製されたグリコサミノグリカンの検出において非常に敏感であることを示している。この方法を用いて可視化した4種類の異なるヘパリン硫酸オリゴ糖のうち、未分離ヘパリンは最も容易に検出できなかった。
分離ヘパリンの多分散性のために、このサンプルからの個々のバンドの密度は、精製ヘパリンオリゴ糖の等質量によって生成されるバンドよりも低い。液体生物学的試料からのグリコサミノグリカン精製の効率を、もともと比較的低濃度のグリコサミノグリカンを含んでいたマウスから採取した気管支肺胞洗浄サンプルを用いて評価した。さらに、この技術の成功は、肺ホモジネート全体から分離されたヘパリン硫酸塩を使用して実証され、十分な量の分離ヘパリン硫酸塩を生み出し、最小の断片は質量で約10の二糖類を含む。
作りたての試薬を使用し、このプロトコルで使用されるすべての試薬をフィルタリングすることは非常に重要です。この技術を成功させるためには、最高の純度と品質の試薬を使用することが重要です。
