Name: using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells for drug discovery
Uploaded: 2018-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery at JoVE.com

この作品は、国立衛生研究所 (DK55743、DK087377、DK102716、S.A.D に HG006398) によって支えられました。彼らの貢献に対して博士 Behshad Pournasr、博士ジェームズ ・ ヘズロップ ・と蘭静に感謝したいと思います。

1. 人間の文化誘導多能性幹細胞
<ol><li>
組換えひと E カドヘリン Fc 融合タンパク質 (E-cad-Fc) または他の行列の hPSC 文化に適したコーティング6<ol>
<li>ダルベッコ Phosphate-Buffered 食塩カルシウムとマグネシウム (DPBS (+)) が含まれていると 15 μ g/mL に E-cad-Fc を希釈します。</li>
		<li>5 ml の希釈 E-cad-Fc の 100 mm サスペンション ティッシュの培養皿をコートし、少なくとも 1 h. 削除基板の 37 ° C で孵化させなさい媒体 (例えば、今後 M 媒体と呼ばれる mTeSR1) の 5 mL と交換7。 注:このプロトコルで使われる培養培地は、次の公開プロトコル7を用意しています。ただし、いくつかの他のメディアの準備が記載されている、または利用できる商業的に、プロシージャ可能性があります互換性のあります。</li>
		<li>液体窒素による凍結 Ips のバイアルを取得します。小さな氷の結晶が残っているまで、37 ° C で解凍します。優しく M 培地 4 mL を含む滅菌 15 mL の円錐管に細胞をピペットします。</li>
		<li>5 分は上澄みを除去し、やさしく再中断 5 ml の培、Rho 関連、コイルド コイル含む蛋白質キナーゼ (ロック) の選択的阻害剤の Y-27632 の 10 μ m の細胞のために、300 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>1.1.2 のステップから M 媒体を取り外し、100 mm サスペンションの電子 cad Fc コーティング ティッシュの培養皿にステップ 1.1.4 からセルの 5 mL。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
人間 Ips の文化を維持します。
	<ol>
<li>Ips に達すれば周り 80% の confluency 培養培地を削除し、カルシウムで 1 回洗浄し、マグネシウム無料 DPBS (-)。DPBS (-) を吸引し、プレートをカバーし、室温で最大 3 分間インキュベート 0.02 %edta 溶液の十分な量を追加します。 注:80% の合流でプレートは約 2 × 107セルを含める必要があります。セルにはびこるにない細胞が未分化の形態を保持できるようにすることが重要です。細胞の多能性幹細胞のマーカー トラ-1-60 または同等の8との汚損によって決定できます。</li>
		<li>セルを解放し始める、0.02 %edta 溶液を削除、セルを解放する M 培地 10 mL で皿の洪水します。軽くピペッティングして Ips の分遣隊を支援します。 注:デタッチするセルの平均培養時間はおよそ 3 分、これは iPSC 行ごとに、経験的に決定する必要があります。セルの周りを含む小さなクラスターとして発表されるべきクラスターあたり 5-10 Ips。</li>
		<li>新鮮な E-cad-Fc コート 100 ミリメートル懸濁液培養皿 M 培地 5 mL を含むあたり浮遊細胞の 1/10 に転送します。37 ° C 下で 4 %o で文化を孵化させなさい25% CO2と日々 変化する媒体。 注:Ips は、多能性を促進するために酸素の生理学的な条件の下で日常的に培養、Ips は周囲の酸素を使用するもと成長します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 96 ウェル プレートでの肝細胞のような細胞に人間 Ips の分化
注:このセクションでは、スクリーニングと互換性のある形式で Ips の分化について説明します。このアプローチを使用すると、それは区別し、20 日間で肝細胞様細胞を形成する人間の Ips を誘導することが可能です。これはほとんどの試金のために適していますが、文化の長さは、細胞の成熟度を改善するために拡張できます。
<ol><li>
減らされた成長因子基底膜マトリックス 96-well ティッシュの培養皿をコーティング
	<ol>
<li>マトリックスを 2 mg/mL の氷冷滅菌 DMEM/F12 組織培養培地で希釈することによって在庫を準備します。250 μ 因数に行列を分割し、必要になるまで-80 ° C で保存します。DMEM/F12 30 分取得のため氷の上の 10 mL 250 μ 因数 2 mg/mL マトリックス株式と雪解けを冷やす氷の上。</li>
		<li>冷たい DMEM/F12 の 10 mL と優しく 0.05 mg/mL の最終的な集中にあらかじめ冷やしたピペットを使用して混合することによってマトリックスを組み合わせます。</li>
		<li>96 ウェル培養プレートの各ウェルに 100 μ L 希薄マトリックスを転送します。37 ° C で孵化させなさい、4% O25% CO2少なくとも 1 h. の行列を破棄し、ウェルあたり 50 μ L の M 中に置き換えます。37 ° c、4% O25% CO2必要になるまで格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞分化の
	<ol>
<li>セル アプローチ 80% 合流まで 100 mm プレートに Ips の文化.プレートに約 2 x 10 の7セルが含まれていることを確認します。セル フローサイトまたは検定によって細胞の数を決定します。 注:顕微鏡での経験と、Ips 細胞の品質を判断できます。ただし、セルの 98% 近くは、TRA 1 60 エピトープ FACS や免疫染色法によって測定したときのような多能性マーカーを表現しなければなりません。細胞は積極的にわかれたまま、生えていないことが重要です。</li>
		<li>各 100 mm プレートから Ips を収穫するには、培養培地を吸引、DPBS (-) の 5 mL ですすいでください。細胞剥離液 (例えばaccutase) の 3 mL でリンスを置き換えるし、37 ° C、4% O25% CO2で約 2 分間インキュベートします。 注:顕微鏡による細胞の剥離を従うことが重要です。Accutase にダイジェストしすぎないでください。目標は最低限の治療で小さなクラスターとしてセルを解放するためです。</li>
		<li>セルをデタッチし始めると、すぐに M 中の 7 mL を追加して収穫します。周りの小さなクラスターに細胞のコロニーを分離するに数回のピペット 3 6 細胞 (図 1 a)。</li>
		<li>5 分、上清を除去し、再細胞ペレットを 5 mL M 培地にサスペンド 15 mL 滅菌遠心管 300 × g で遠心分離し、Ips を収集します。</li>
		<li>懸濁細胞分注 50 μ l を各ウェルに 96 ウェル マトリックス コーティング プレートの上にセルを均等に配る。各 96 ウェル プレートを設定するには、約 80% の confluency 分化をセットアップする約 5 x 10 の6セルが含まれているセルと Ips の 1 つの 100 mm の板を使用します。マルチ チャンネル ピペットを使用して、このプロセスをスピードアップします。37 ° C、4% O25% CO2で一晩培養します。 注:再現可能な分化を確保するため各ウェルに同じ数のセルを堆積ことが重要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞の分化を誘導します。
	<ol>
<li>細胞が個々 の表面の少なくとも 70% をよくカバーして顕微鏡による 96 ウェルのプレートを確認します。カバレッジが 70% 未満の場合新鮮な媒体、媒体に置き換えるし、37 ° C、4% O25% CO2で追加 24 時間孵化させなさい。 注:よく分化を誘導することがなくめっき後 48 時間以上のための細胞を培養分化の効率が低下します。分化も発生する周囲の酸素を使用して効率かもしれないが影響を受ける.
</li>
		<li>分化の日 2 日 1、置き換える培 RPMI 2 %b27 (インスリン) なしで 20 ng/mL FGF2、10 ng/mL、BMP4 100 ng/mL アクチビン A。100 μ L/ウェル中を追加し、37 ° C、アンビエント O25% CO2の 2 日間毎日中型の変更でインキュベートします。 注:96 ウェルのプレートの大きな数を扱う補助ピペットまたはロボットの使用が必要です。96 ch と 12 ch ピペットは毎日培地交換に最適です。</li>
		<li>分化の日 5 日 3、置換と RPMI 培 (インスリン) なし 2 %b27 と 100 ng/mL アクチビン a. 文化細胞周囲 O25% CO2と 3 日間の毎日の中型の変更で、37 ° C で補った。</li>
		<li>30 s、し削除、置換の 100 μ L 0.02 %edta 溶液とよく分化新鮮な培地、各治療を交換する前に 5 日目に新鮮な培養液中で。 注:内胚葉への分化が効率的な場合、分化細胞の単層がプレートから剥離しやすいです。0.02 %edta 溶液で簡単な治療は、細胞の剥離を軽減できます。この治療法は、肝細胞への分化には影響しません。</li>
		<li>10 日間 6 間の差別化、培 RPMI/2% (インスリン) B27 20 ng/mL BMP4 10 ng/mL FGF2 と補われ、37 ° C、4% O25% CO2毎日中型の変更と 5 日間のインキュベートを交換してください。この段階では、肝前駆細胞に分化する細胞を誘導します。</li>
		<li>15 日 11 の間の分化、20 ng/ml の HGF (インスリン) B27 添加培養液中 RPMI/2% と交換してください。37 ° C、4% O25% CO2毎日中型の変更で 5 日間で孵化させなさい。</li>
		<li>20 日 16 間の差別化、肝細胞細胞培地 (HCM) 20 ng/ml オンコスタチン M (OSM) の補足と培養液を交換してください。アンビエント O25% CO2と 5 日間の毎日の中型の変更で、37 ° C でセルを孵化させなさい。 注:個々 のウェル間の差別化の再現性は、アルブミン、afp 通信、または APOB elisa 法による媒体に分泌の相対的なレベルを測定することによって効率的に決定できます (3.2 を参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 小さな分子のスクリーニング
注:APOB の家族性高コレステロール血症 Ips 由来の肝細胞のような細胞の中でのレベルを下げて使用することができます化合物を特定するための手順を次に示します。モデルとコレステロール低下薬の同定での使い方の説明が記載されているでは以前5,9詳細。現在の例では、サウスカロライナ化合物コレクション (SC3) ライブラリから 1,000 化合物をスクリーニングしました。各化合物は、2 μ g/mL の濃度でテストされました。
<ol><li>
IPSC - 小分子と派生の肝の治療
	<ol>
<li>2 %dmso、-20 ° C で店で 20 μ g/mL の濃度で化合物と株式を働いているのプレートを生成するマスターの化合物ライブラリーを希釈します。</li>
		<li>テストするそれぞれの化合物を許可する iPSC 由来の肝細胞の十分な 96 ウェルのプレートを準備します。 注:上映される化合物の数は、必要とされる 96 ウェル プレートの数によって決定されます。一般に、単一も備える必要があります任意のコントロールのサンプルの各化合物は、プラス追加井戸。プレートの外側の井戸は一般的解釈を破損することができますエッジ効果の可能性を減らすために回避されます。ヒットは、複製を使用する必要とせず z スコア法を使用して識別できます。複製が含まれている場合は、t 検定を使用する適しています。</li>
		<li>分化 (日 20、参照 2.3.7) の完了、時に新鮮な HCM の 100 μ L 培養液に置き換えるオンコスタチン M の 20 ng/mL を添加しました。37 ° C で孵化させなさい、4% O25% CO2 24 時間正確には新鮮なの 96 ウェル プレート、-20 ° C でストアに培養培地を取得します。薬の付加の前に媒体の APOB のレベルを計算するのにには、このサンプルを使用します。</li>
		<li>20 ng/ml オンコスタチン M の各ウェルに補われる新鮮な HCM の 90 μ L を追加します。ピペッティングにより混合後在庫から各化合物の 10 μ L を追加します。アンビエント O25% CO2まさに 24 時間の培養液を収集し、-20 ° C で保存、処理された試料の最終濃度に一致し、37 ° C で孵化させなさい井戸を制御する 0.2 %dmso を追加します。このサンプルを使用して、化合物投与後 APOB のレベルを調べます。</li>
		<li>オプション - 免疫染色、細胞生存率、または標準的なアプローチを使用しての mRNA のレベルの解析の残りのセルを処理ことができます。 注:この画面は、APOB レベルの急速な効果があった薬を識別するために設計されました。ただし、病モデル、下流の試金、または薬物作用のメカニズムは、によっては複数日のサンプルの治療に有益ながあります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elisa 法による APOB レベルを決定します。
	<ol>
<li>両方前と後の薬物治療のサンプルから次の製造元のプロトコル人間 APOB ELISA の開発キットを使ってアポリポ蛋白 B (APOB) 濃度を決定します。</li>
		<li>
次の解決策を準備します。
		<ol>
<li>洗浄バッファー、0.05% から成る PBS、pH 7.4 でトゥイーン 20。使用するまで 4 ° C で保存します。</li>
			<li>インキュベーション バッファーは、0.05% Tween 20 と 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) の PBS、pH 7.4 で構成されます。使用するまで 4 ° C で保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pbs は、pH 7.4 2 μ g/mL に希釈して APOB (mAB 20/17) 抗体を準備します。ウェルあたり希釈の 100 μ L を追加し、4 ° C で一晩インキュベートします。</li>
		<li>抗体をアッセイ プレートから外し、各 200 μ L の PBS、pH 7.4 で 2 回も洗います。</li>
		<li>200 μ L/ウェル 0.05% の追加トゥイーン 20、PBS、pH 7.4 で 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) し、常温で 1 h の動揺のプラットホームの間加温します。</li>
		<li>Pbs は、pH 7.4 APOB の下記の濃度 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa を使用して 8 ポイント標準曲線を準備: 300 ng/mL、200 ng/mL、175 ng/mL、150 ng/mL、125 ng/mL、100 ng/mL、75 ng/mL、50 ng/mL。</li>
		<li>Pbs は、pH 7.4 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa を用いたテスト サンプル 1:4 希釈します。</li>
		<li>インキュベーション バッファーによるブロックの 1 時間後バッファーを破棄し、0.05% の 200 μ L を 5 回アッセイ プレートを洗う PBS、pH 7.4 でトゥイーン 20。</li>
		<li>完全に残留洗浄バッファーを削除し、希釈したサンプルと APOB 基準の 90 μ L をアッセイ プレートに転送します。1 h のシェーカーで室温で孵化させなさい。</li>
		<li>サンプルを破棄し、200 μ 0.05% で洗って pbs は、ウェルあたり pH 7.4 トゥイーン 20。合計 5 回洗浄を繰り返します。Pbs は、pH 7.4 0.05% Tween 20 と 0.1 %bsa に mAB LDL 11 ビオチン希薄縮尺のウェルあたり 100 μ L を追加します。1 h の動揺のプラットホームの室温で孵化させなさい。</li>
		<li>試薬を破棄し、5 回も洗浄バッファー当たり 200 μ L で洗います。ストレプトアビジン-HRP 抗体のウェルあたり 100 μ L を追加 (1:1, 000 インキュベーション バッファーを使用して希釈)、1 h の動揺のプラットホームの室温でインキュベートし。</li>
		<li>試薬を破棄し、200 μ 0.05% で洗って pbs は、ウェルあたり pH 7.4 トゥイーン 20。合計 5 回洗浄を繰り返します。完全にアッセイ プレートから残留洗浄液を削除し Tetramethylbenzidin (TMB) 基板の解決のウェルあたり 100 μ L を追加し、8 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>TMB 基板を削除せず直接停止ソリューション (1N HCl) ウェルあたり 100 μ L を追加します。</li>
		<li>450 で吸光度を決定する nm プレート リーダーを使用しています。</li>
		<li>4 パラメータ ・ ロジスティック回帰法を使用して、各サンプル10APOB の濃度の定義に使用、標準曲線を確立できます。</li>
		<li>事前に薬を調べる: APOB を下げる可能性のある化合物を識別するために各サンプルの APOB の後薬剤比率レベル中。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered?.">How were new medicines discovered?.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sources+for+in+vitro+human+liver+cell+culture+models.">Cell sources for in vitro human liver cell culture models.</a> Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).</li><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy.">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drug+Screen+using+Human+iPSC-Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveals+Cardiac+Glycosides+as+a+Potential+Treatment+for+Hypercholesterolemia.">A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).</li><li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin-coated+plates+maintain+pluripotent+ES+cells+without+colony+formation.">E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation.</a> PLoS One. 1, e15 (2006).</li><li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).</li><li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>Cayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JD+induced+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes+faithfully+recapitulate+the+pathophysiology+of+familial+hypercholesterolemia.">JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia.</a> Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).</li><li>DeSilva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+bioanalytical+method+validation+of+ligand-binding+assays+to+support+pharmacokinetic+assessments+of+macromolecules.">Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules.</a> Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).</li><li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin.">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li><li>Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+pluripotent+stem+cells+using+completely+defined+conditions+on+a+recombinant+E-cadherin+substratum.">Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum.</a> BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+exhibiting+markers+recapitulating+liver+development+in+vivo.">Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo.</a> Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).</li><li>Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Cell-Surface+N-Glycoproteome+of+Human+Hepatocytes+Reveals+Markers+for+Selecting+a+Homogeneous+Population+of+iPSC-Derived+Hepatocytes.">Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes.</a> Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustration+of+SSMD,+z+score,+SSMD*,+z*+score,+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens.">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).</li><li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-Derived+Neural+Progenitors+Are+an+Effective+Drug+Discovery+Model+for+Neurological+mtDNA+Disorders.">Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).</li><li>Lu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+progenitor+cells+of+biliary+origin+with+liver+repopulation+capacity.">Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity.</a> Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).</li><li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation.">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).</li><li>Mallanna, S. K., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+hepatocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+hepatic+cells.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells.</a> Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).</li><li>Si-Tayeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+generation+of+human+hepatocyte-like+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).</li><li>Pashos, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Population+Cohorts+of+hiPSCs+and+Derived+Hepatocyte-like+Cells+Reveal+Functional+Genetic+Variation+at+Blood+Lipid-Associated+Loci.">Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).</li><li>Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+liver+cells+for+drug+testing+and+disease+modeling.">Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling.</a> Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).</li><li>Choi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+drug+screening+and+gene+correction+for+treating+liver+disease+using+patient-specific+stem+cells.">Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells.</a> Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).</li><li>Tafaleng, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+model+personalized+variations+in+liver+disease+resulting+from+alpha1-antitrypsin+deficiency.">Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency.</a> Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).</li><li>Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+reveals+that+HSP90beta+promotes+the+conversion+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endoderm+to+a+hepatic+fate+and+regulates+HNF4A+turnover.">A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover.</a> Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ターゲット ・ ベース創薬、小さい分子を識別する、特定の蛋白質の活動に影響を与える多くの既存のスクリーニングの努力の焦点となっています。このアプローチは、多数の医薬品、画面反転表現型, 古典的な薬理学に基づいてを提供して臨床的に効果がある1されているファーストクラスの化合物を識別するに成功されています。表現型創薬への不利な点はそれが適切な?...

まれな疾患を対象とする使用ことができます薬を識別する成功はスクリーニングに使用することができるアッセイの開発に依存しています。仮説またはターゲット ベースの画面 (逆薬理学) は有用だが、疾患の分子基盤の解明を必要とします。表現型画面 (古典的な薬理学) 生化学的経路の詳細な理解の必要性を避けるが、疾患の病態生理を正確にミラー化モデルの開発に頼る。ターゲット ・ ベースのアプローチのための熱意にもかかわらずは、FDA のファーストクラスで医薬品の分析は、表現型の画面がはるかに成功した1をされている明らかにします。このメソッドの全体的な目標は、高スループット スクリーニングのためのプラットフォームを確立する代謝性肝疾患の治療のための小さい分子を識別するために使用することができますです。肝, 肝癌細胞と肝前駆細胞2を含むいくつかの生体外モデルを記載されています。しかし、これらのモデルのほとんどは、制限があります、文化肝代謝不足の病態を要約することができます正確に新しいモデルの必要性があります。最近では、ひと多能性幹細胞遺伝子編集と組み合わせるモデルもアクセス患者することがなく文化のまれな病気のたぐいまれな機会を提供している直接3。患者特有の Ips の使用は、まれな肝疾患の治療のための小分子を発見するツールは概念的には合理的なアプローチ4の可能性を示す報告は少ないがあります。ただし、iPSC 由来の肝細胞を正常に肝代謝5欠陥の治療のための用途に使用することができます薬を識別するために使用するプラットフォームを開設します。
このプロトコルは 96-well 版の肝細胞様細胞にヒトの Ips を区別し、低分子化合物のライブラリを選別するに使用するプロセスを説明します。代謝性肝疾患の例としてエンドポイントによる高コレステロール血症についても説明します。このアプローチは、役割と伝染性肝疾患、代謝性肝疾患、薬物の毒性、その他の肝疾患のコンテキストで小さな分子の応用に関する研究に役立つはずです。

<table><tbody><tr><td>100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>96-wells tissue culture plate&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Albumin</td><td>Dako</td><td>A 0001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human FOXA2(6C12)</td><td>Novus Biological</td><td>H00003170-M12</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human HNF4 alpha</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-6556</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Oct-3/4 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human SOX17</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF1924</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Activin A Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9563</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, minus insulin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>0050129SA</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, serum free&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4 Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9533</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent StemPro&amp;nbsp; Accutase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>7572</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+(calcium, magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS-(no calcium, no magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>ELISA human APOB ELISA development kit</td><td>Mabtech</td><td>3715-1H-20</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0023</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit)&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Growth Factor&amp;nbsp; (HGF)</td><td>Invitrogen</td><td>PHC0321</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Invitrogen</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>PHC5015</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1413301</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, HEPES&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc)</td><td>Primorigen Biosciences</td><td>S2071</td><td></td></tr><tr><td>TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>34022</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 FITC conjugated</td><td>Millipore</td><td>FCMAB115F</td><td></td></tr><tr><td>Versene (EDTA) 0.02%&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-711E</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ROCK inhibitor</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells for drug discovery

ひと誘導多能性幹細胞 (Ips) を分化肝細胞様細胞 (HLCs) 能力は、先天性肝代謝を研究する新たな機会を提供します。ただし、肝疾患を治療するためにされる可能性がありますすることができます小さな分子の同定をサポートするプラットフォームを提供するためにプロシージャは何千もの化合物をスクリーニングと互換性のある文化形式を必要です。ここでは、完全に定義された培養条件、96-well ティッシュの培養皿の肝細胞様細胞に人間 Ips の再現性のある差別化をできるを使用してプロトコルについて述べる.家族性高コレステロール血症患者から生成された iPSC 由来肝細胞由来アポリポ蛋白 B (APOB) を下げるため画面化合物の機能のためにプラットフォームを使用する例もあります。創と互換性のあるプラットフォームの可用性は、肝臓に影響を与える病気の治療薬を識別するために研究者をようにします。

肝細胞の生成-細胞のような:図 1では、人間の Ips 細胞肝細胞様細胞への分化過程に発生する変更のタイム フレームについて説明します。E-Cad-Fc に Ips の文化提供します約 2 mm OCT4 多能性マーカーを表す直径植民地 (図 1 aB)。E-カドヘリンのマトリックス上に成長した細胞の?...

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して

ここで提示されたプロトコルでは、肝疾患の治療のための小さい分子を識別するためのプラットフォームについて説明します。ステップバイ ステップの説明は、96 ウェル プレートで肝細胞特性を持つ細胞に Ips を区別するために、潜在的な治療上の活動と小分子のスクリーニング、セルを使用する方法の詳細が表示されます。

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

using-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-hepatocyte-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K ビュー.  Medical University of South Carolina. ここで提示されたプロトコルでは、肝疾患の治療のための小さい分子を識別するためのプラットフォームについて説明します。ステップバイ ステップの説明は、96 ウェル プレートで肝細胞特性を持つ細胞に Ips を区別するために、潜在的な治療上の活動と小分子のスクリーニング、セルを使用する方法の詳細が表示されます。

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Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

発生生物学

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). Current differentiation procedures generate human hepatocyte-like cells (HLCs) displaying a mixture of fetal and adult traits. To improve cell phenotype, we have fully defined our differentiation procedure and the cell niche, resulting in the generation of cell populations which display improved gene expression and&#160;function. While these studies mark progress, the ability to generate large quantities of multi well plates for screening has been limited by labour intensive procedures and batch to batch variation. To tackle this issue, we have developed a semi-automated platform to differentiate pluripotent stem cells into HLCs. Stem cell seeding and differentiation were performed using liquid handling and automatic pipetting systems in&#160;96-well plate format. Following the differentiation, cell phenotype was analyzed using automated microscopy and a multi well luminometer.

This protocol describes a semi-automated approach to produce hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells in a 96 well plate format. This process is rapid and cost-effective, allowing the production of quality assured batches of hepatocyte-like cells for basic and applied human research.

多能性幹細胞からの細胞のような肝細胞の半自動化生産

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

生物学

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

iPSC由来3Dヒト肝臓オルガノイド作製のための統合プロトコール

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

生物工学

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

ヒト胚性幹細胞からの肝細胞様細胞誘導の効率的な方法

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

免疫・感染学

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

定義された分化系を用いた多能性幹細胞からの肝前駆体仕様

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

ミトコンドリアALCAMソーティングによるヒトiPS細胞由来肝細胞の精製

Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely diseased organs due to their unlimited proliferation and pluripotent properties. However, differentiating human ES/iPS cells into 100% pure target cell types is challenging due to their high sensitivity to the environment. Tumorigenesis after transplantation is caused by contaminated, proliferating, and undifferentiated cells, making high-purification technology essential for the safe realization of regenerative medicine. To mitigate the risk of tumorigenesis, a high-purification technology has been developed for human iPS cell-derived hepatocytes. The method employs FACS (fluorescence-activated cell sorting) using a combination of high mitochondrial content and the cell-surface marker ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) without genetic modification. 97% &plusmn; 0.38% (n = 5) of the purified hepatocytes using this method exhibited albumin protein expression. This article aims to provide detailed procedures for this method, as applied to the most current two-dimensional differentiation method for human iPS cells into hepatocytes.

著者スポットライト:再生医療のためのヒト人工多能性幹細胞からの肝細胞精製の進歩

Hepatocytes derived from pluripotent stem cells can be purified through cell sorting, using a combination of mitochondrial and activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM, also known as CD166) staining.

ヒト人工多能性幹細胞由来肝細胞の精製のための細胞選別における生ミトコンドリア染色の応用

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely ...