自家源を用いたヒト肝スフェロイドの作製は、毒性学、がん、創薬など様々な研究分野に貢献することができます。この技術の主な利点は、BDPC由来のヒト肝細胞を使用してヒト肝スフェロイドを設計し、初代ヒト肝細胞またはPHHの不足を回避することです。自家ヒトスフェロイドは、特に急性肝不全患者において、再生医療および治療に拡張することができる。
手順を実演するのは、私の研究室のプロジェクトリーダーであるアン・キャサリン・ショット博士です。500ミリリットルの肝芽細胞KnockOut血清置換ジメチルスルホキシドまたはKSR DMSO培地と肝細胞成熟培地を調製することから始めます。培地をストックから分注し、培地交換ごとに1ミリリットルあたり10または20ナノグラムの最終濃度で新鮮な肝細胞成長因子またはHGFとオンコスタチンMまたはOCMを追加します。
5番目の血液由来多能性幹細胞またはBD-PSC細胞をバイオラミニンコーティングされた4ウェルプレートに10回3回移し、プレートを摂氏37度、5%二酸化炭素のインキュベーター内で5日間インキュベートします。内胚葉分化をサポートするために、細胞をKSR DMSO肝芽球培地で5日間培養し、48時間ごとに培地を交換します。5日目に、肝細胞成熟培地を追加し、摂氏37度と5%二酸化炭素のインキュベーターでさらに7〜10日間細胞を培養し、48時間ごとに培地を交換するようにします。
計数チャンバーおよび遠心分離機BD脱分化細胞懸濁液を室温で10分間300Gで計数する。上清を除去した後、脱分化したBD細胞をKSR DMSO培地に1ミリリットルあたり6細胞中10個の濃度で2回再懸濁する。シングルセル懸濁液を確保した後、セルを40マイクロメートルのセルストレーナーに通して、追加の破片を取り除きます。
再度、計数チャンバーを用いて細胞を計数し、ウェル当たりに必要な量を分注するのに十分な量の各細胞播種密度を調製する。100万細胞のトップシードから4, 000セルの低いシード密度までの勾配を準備します。次に、100マイクロリットルのKSR DMSO培地を96ウェル低アタッチメントプレートに分注し、100マイクロリットルの細胞播種希釈液を加えます。
低アタッチメントプレートを5日間インキュベートします。スフェロイドが十分にコンパクトになったら、播種後3日目または4日目に培地の50%を変更します。5日目に、培地を肝細胞成熟培地に変更し、その中の細胞をさらに7〜10日間培養し、48時間ごとに培地を交換します。
前述の分化法を用いて細胞を4、8、15、24日間培養した後、培地を取り出す。PBS中の4%パラホルムアルデヒドを含む予め温めた固定液で細胞を10分間インキュベートします。次に、固定液を廃棄し、細胞をPBSでそれぞれ5分間2回洗浄します。
直ちに0.1%Triton X-100溶液を加え、PBSを2回洗浄する前に細胞を5分間透過処理します。PBSと5%ウシ血清アルブミンまたはBSAからなるブロッキング溶液を加えてから、細胞をロッカープレートに室温で1時間置きます。一次抗体を希釈バッファー1%BSA PBSで希釈し、ウェルあたり50マイクロリットルの抗体希釈液を加えます。
室温で1時間インキュベートした後に抗体溶液を捨て、PBSを用いてそれぞれ5分間の洗浄を3回行った。希釈バッファーで希釈した50マイクロリットルの二次抗体を各ウェルに加え、細胞を室温で30分間インキュベートします。細胞をPBSでそれぞれ5分間3回洗浄した後、顕微鏡分析のためにDAPIを含む封入剤でカバーガラスをマウントします。
スフェロイドに触れずに培養培地を慎重に廃棄し、新たに調製したPBSを0.1%Triton X-100溶液に加え、5分間インキュベートして細胞を透過処理します。スフェロイドを培地で2回洗浄し、培地をゆっくりとピペッティングします。次に、スフェロイドを50マイクロリットルの一次抗体で1時間インキュベートします。
完了したら、余分な抗体溶液を慎重に除去し、培地を3回洗浄します。ヤギ抗マウスIgG Cy3、ヤギ抗マウスIgG 488、ウサギ抗ニワトリIgGテキサスレッドなどの対応する二次抗体を1%BSAを含むPBSで調製し、二酸化炭素インキュベーターで20分間インキュベートする前に、ウェルあたり50マイクロリットルの抗体希釈液を追加します。再度、インキュベーター内で30分間インキュベートする前に培地で3回洗浄する。
使用の10分前に蛍光光源のスイッチを入れてください。コンピュータの電源を入れ、イメージングソフトウェアを開きます。ツールバーの4倍ボタンをクリックして正しいスケールバーを選択することにより、4倍の倍率対物レンズを使用します。
次に、96ウェルプレートをステージセンタープレートに置きます。LED光源をオンにし、明視野フィルターを使用し、XY軸ステージ調整ノブを使用してプレートを目的のウェルに配置します。カメラの光路に変更し、イメージングソフトウェアのライブボタンをクリックして、画面上の画像を視覚化します。
XY軸ノブを使用して回転楕円体が中央に配置され、粗いフォーカスノブまたは細かいフォーカスノブを使用してフォーカスされていることを確認します。次に、ツールバーで明視野観察方法を選択し、露出設定を自動にして、カメラのコントロールパネルのスナップショットボタンをクリックして写真を撮ります。次に、目的のフォルダーに適切な名前を使用して、画像をvsiファイルとして保存します。
周囲光遮蔽板を配置してLEDライトを消灯し、B励起のフィルターを交換します。次に、488観測方法を選択します。シャッターを開き、スナップショットボタンをクリックして写真を撮り、シャッターを閉じてファイルをvsiとして保存します。
G励起のフィルターを使用してこのプロセスを繰り返し、目的の各ウェルに対してプロセスを繰り返します。肝分化過程における形態変化は、BD-PSCが3段階を経て肝細胞に分化することを示した。第一段階は内胚葉細胞への分化を表した。
第2の肝前駆細胞への分化は典型的な多角形の形態を呈する。そして第三に、肝細胞への成熟。免疫蛍光分析は、L4〜L8日目の肝分化プロセスの初期段階の細胞におけるアルファフェトプロテインまたはAPFおよびトランスサイレチンまたはTTRなどの内胚葉ヒト肝前駆細胞マーカーの強い発現を示した。
しかし、それらの発現はL15日目に減少した。アルブミンまたはALBと肝細胞核因子4つのαまたはHNF4アルファの発現は、L4で最初に現れ、分化時間L4からL15を通じて増加し、成熟時間L15からL24の間に強く安定した発現に達しました。細胞の自発的凝集は、スフェロイド形成を開始した肝細胞誘導または成熟培地を含む低接着プレートにおいて観察された。
ステロイドスフェロイドと可変細胞数との間に一貫した相関が観察された。L14で形成・分化し、抗体で生染色したスフェロイドは、BD-PSC由来のスフェロイドの肝機能活性の可能性を明らかにした。再プログラミングのための単核細胞の調製は、この手順における最も重要なステップである。
ヒト肝スフェロイドの生成は、in vivoと同様の微小解剖学的構造を備えた3Dの臓器のin vitro簡易版のオルガノイドを作成するための最初のステップです。研究室で作成されたオルガノイドは、器官形成、疾患発生、および栄養素の研究に使用されます。
