このメトジェネティクスは、アセンブリの微細な材料と細胞を使用して、ヒト多能性幹細胞の3D肝圏を大量に含んでいます。この技術の主な進歩は、壊死性の中心の形成および表現型の喪失を制限し、3D肝臓球のサイズを制御することができるということです。私と一緒に手順を実証することは、私たちの研究室の博士号を持つユ・ワンです。
100ミリリットルの殺菌蒸留水に2グラムの低温アガロースを溶解してアガロース型を提示する準備をします。慎重にアガロースを完全に溶解するために間隔振盪で電子レンジで混合物を加熱します。溶かしたアガロースの520マイクロリットルを256のウェルフォーマット型の型に加え、固化させます。
次に、各アガロースマイクロプレートを12ウェルプレートの単一のウェルに移します。各ウェルにカルシウムとマグネシウムを含むDPBSの1.5ミリリットルを追加し、気泡を取り除くために上下にピペット。細胞懸濁液を調製するために、ヒト多能性幹細胞、またはHPSCの未分化培養物から培地を吸引することから始める。
室温DPBS、カルシウム、またはマグネシウムを5ミリリットル加えて細胞を洗い流し、バッファーを取り除きます。細胞に5ミリリットルの細胞解離試薬を加え、摂氏37度で6~8分間インキュベートします。顕微鏡下で細胞剥離を観察し、必要に応じて1〜2分間インキュベーションを延長します。
細胞解離試薬を除去し、新鮮なMTの5ミリリットルを添加することによって反応を停止し、10マイクロモルロック阻害剤、Y27632を添加した1つの培地を提供する。ピペットは、細胞の解化のために数回上下します。血球計とストリーパンブルー染色で生存細胞を数え、必要な細胞の総数を計算します。
所望の数の細胞を無菌15または50ミリリットル遠心分離管に移し、遠心分離機を200回Gで5分間ペレット化する。上清を捨て、MTの細胞を再中断すると、1ミリリットル当たり210万細胞の最終濃度に対して10ミクロモルロック阻害剤を用いて1つの培地に作用する。次に、アガロースマイクロウェルあたり190マイクロリットルの調製細胞懸濁液を添加し、アガロースマイクロプレートを5%の二酸化炭素で2時間インキュベートして細胞を保存します。
インキュベーションの後、新鮮で暖かいTサーブ1培地をロックインヒビターで1ミリリットルずつ各ウェルに加えます。プレートをインキュベーターに戻し、24時間そこに残します。翌日、形成の球を調べる。
ポリ2ヒドロキサーチルメタクリレートまたはポリヘマコーティングウェルを100ミリリットルの95%エタノールに溶解し、55°Cのホットプレートで一晩攪拌して、コーティングされたウェルを調製します。翌日、24ウェルプレートの各ウェルに溶液250マイクロリットルを加え、60°Cのオーブンで一晩プレートを乾燥させます。慎重にMTを除去し、前に播種した細胞から1培地を除去し、新鮮な内胚分化培地の1ミリリットルに置き換えることによって、肝細胞分化を開始します。
ヒト胚性幹細胞の場合、24時間ごとに3日間培地をリフレッシュする。自発的な細胞分化を避けるために、播種後24時間で肝細胞分化を開始することが重要です。決定的な内胚葉誘導の後、培地を肝芽細胞分化培地に5日間切り替える。
2日ごとに培地を交換し、肝芽細胞仕様の最終日に最後の変更を行います。準備されたポリヘマコーティングされた井戸に肝球を移すために、肝細胞成熟培地で細胞を洗浄し、1ミリリットルHGFあたり10ナノグラムと1ミリリットルOSMあたり20ナノグラムを添加した培地の1ミリリットルを加える。溶液を数回上下にピペットして、アガロースマイクロプレートから肝球を持ち上げ、よくコーティングされたポリヘマに移します。
アガロースマイクロプレートを1ミリリットルの添加肝細胞成熟培地で洗浄し、ポリヘマによくコーティングした培地に移します。P-100ピペットを用いて、ウェルに約1ミリリットルの培地が残るまで肝球を除去せずに余分な培地を慎重に吸引する。12 日間、48 時間ごとにメディアを更新します。
胚性幹細胞を用いて作業する場合は、成熟培地を除去し、維持培地で細胞を洗浄し、次に1ミリリットルの補充維持培地を添加することにより、20日目に培地を肝細胞維持培地に切り替える。この後、48 時間ごとにメディアを更新します。このスフェリック構造の深刻なストレスや歪みを避けるために、即時変更は慎重に行う必要があります。
間葉系マーカーにおける肝細胞の染色は、この技術を用いて形成された肝球が間葉細胞の核を取り囲む肝細胞様細胞で構成されていることを明らかにする。肝細胞で典型的に発現する他のタンパク質も、球の外層に見られる。30日間の肝球培養におけるシトクロムP450酵素またはCYPの機能解析は、3D球がヒトの原発肝細胞と比較してCYP活性の立派なレベルを示すことを示した。
さらに、肝圏がアルブミンやアルファフェトタンパク質などの肝臓タンパク質を分泌することを実証できる。このプロトコルで覚えておくべきことは、ポリヘマコーティングされたプレートに移すときに、3D肝球を含む溶液を上下に穏やかにピペットすることです。これは、彼らに損傷を与えることを避けるのに役立ちます。
一度習得すると、この方法論は、deceaseモデリングと薬物スクリーニングで複数のアプリケーションで1年間インビトロで機能し続ける3D肝球の生成を可能にします。将来を見据えて、この技術は複雑なアーキテクチャを持つ更なる内皮組織と間葉組織を開発するためのプラットフォームとして採用される可能性がある。
