私たちの役に立つ議論やコメント王研究室のメンバーに感謝します。この作品は h. w. に、国家自然科学基金、中国の (NSFC、グラント号 31570001) と自然科学財団の広東省と広州市 (第 2016A030313401 と 201707010024 を付与) でサポートされて

1. プライマー デザイン戦略、DNA の増幅
<ol><li>DNA のフラグメントの分子クローニングのためのプライマーを設計します。プライマー 20 bp の遺伝子特定のバインドのシーケンスと 20 に 25 bp 5' 終り突出部分シーケンスが隣接する dna の相補的な重複シーケンス (たとえばテーブル 1を参照) を構成します。 注: 各 DNA のそれに続くアセンブリ フラグメント、異なった蛋白質発現カセットのリンケージと隣接する重複したシーケンスの認識に依存するすべての最終的な発現ベクターとの統合。</li>
	<li>その対応するプライマー標準 PCR 反応によって半独立したタンパク質式カセットの建設のため必要かつ高プロモーター、蛍光レポーター、ターゲット遺伝子、および終端記号を含む DNA 断片を増幅します。忠実性ポリメラーゼ。 注: DNA 増幅用本研究で使用するテンプレートは、以前の研究15,22,23から派生されます。焼鈍温度と PCR の反作用の延長時間は、プライマーや遺伝子依存です。</li>
</ol>2. DNA フラグメント アセンブリおよびタンパク質発現カセットの建設
<ol><li>DNA 電気泳動による第 1 ラウンドの PCR の製品の品質を確認し、分光光度計による定量化します。1% アガロースゲル電気泳動によって DNA の劣化や汚染が発生しているかどうかを確認します。PCR の製品の OD260/OD280 は、1.6 と 1.8 の間する必要があります。</li>
	<li>さまざまな DNA 断片をミックス (0.05 - フラグメントごとに 0.1 pmol) 5 μ L の最終的なボリュームに新しい PCR チューブに。 注: ミックス DNA 分子設計同じタンパク質発現カセットを一緒に 1 つの PCR チューブに。それはリンクが必要な dna の数を増やすために DNA アセンブリの効率を減らすので一緒に、別の式のカセットからの Dna を混合を避けてください。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	<li>5 x ISO 在庫バッファーの準備: 500 mM トリス-HCl、pH 7.5;50 mM MgCl2;1 mM deoxynucleotide (dNTP);50 mM ジチオトレイトール;25% ポリエチレング リコール (PEG) 8000;5 mM ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NAD)。</li>
	<li>1 mL から 400 μ L 5 マスターの混合物 x 2 x ISO 在庫バッファー、T5 エキソヌクレアーゼ、忠実度の高い DNA ポリメラーゼの 62.5 単位、Taq のポリメラーゼの 5,000 台の 7.5 単位を作る (材料の表を参照)、および滅菌二重蒸留水 H2o. 注: これは以前研究24,25,26; から適応します。これらのボリュームを最適化する必要があります。</li>
	<li>管し、-20 ° C でストアあたりマスター混合物 x 2 の 100 μ L 分注 注意: 頻繁に凍結と 2 x マスター混合物の融解を引き起こす DNA 組立効率が低い。</li>
	<li>5 μ L の DNA 混合物に 2 x マスター混合物の 15 μ L を追加し、で 50 ° C, 60 分間インキュベートします。</li>
</ol>3. 共同植物の複数のキメラの蛍光融合タンパク質発現用ベクターの構築
<ol><li>製品を使用して 2 番目のラウンド PCR による全体の半独立したタンパク質発現カセットを増幅 (0.5 - 1.0 μ L) テンプレートと最も外側のプライマー (例えば、 1 FP35S、1-RNOS 式の最初のラウンドの等温アセンブリ反応からカセット 1)。<ol>
<li>50 μ L 反応量の高再現性ポリメラーゼの使用 1 単位 30 サイクルが続く (94 ° C、30 s、55 ° C、30 s、および 2 分の 68 の ° C)、68 ° C、5 分で最後の拡張が続く。</li>
	</ol>
</li>
	<li>最終的なタンパク質発現バックボーン ベクトル pUC18 と pCAMBIA1300、それぞれ、一過性発現と形質転換のため 4 台Smaを追加することによって設計されているリニア化最終 10 μ L 反応巻に私と 1 - のインキュベーター25 ° C で 2 時間20 分の 65 ° c の孵化によって制限酵素を不活性化します。</li>
	<li>5 μ L の反応量にタンパク質発現カセットと線形補間の最終的なベクトルの等モルの DNA 分子をミックスします。15 μ L 2 x マスター バッファーと 60 分 50 ° C で培養で混合することによって、第 2 ラウンドの DNA の再結合を実行します。</li>
	<li>第 2 ラウンド等温再結合反応の最終製品を使用して有能なエシェリヒア属大腸菌を変換する標準的な手順27によるとセルを (例えばDH5α)。コロニー PCR で DNA シーケンスによって肯定的なコロニーを再確認してください。ミニ プラスミド抽出キットを使ってエシェリヒア属大腸菌から肯定的なプラスミドを抽出し、-80 ° C で保存 注意: 長期保存用プラスミドは TE バッファーに溶解または二重蒸留 H2O は大腸菌で保管するよりも安定しています。</li>
</ol>4. Biolistic 砲撃を介した植物の複数のキメラ蛍光融合タンパク質の一過性の共発現
<ol><li>タバコ by-2 懸濁液細胞およびシロイヌナズナの幼植物を砲撃を準備します。<ol>
<li>シェーカーに 25 ° C で週 2 回継代培養培地、培 (MS) の中で培養細胞は、130 rpm に設定します。40 mbar に真空圧を設定することによって収集 30 mL 3 d 培養細胞の 70 mm オートクレーブ フィルター紙経由で真空ポンプの部分にフィルターを適用します。</li>
		<li>セルの次の手順の中に完全に乾くことを防ぐためにシャーレに濾紙を配置する前ので 2 セル液体文化媒体の数滴を追加する. (次の手順)。</li>
		<li>それをろ紙で 2 セルを新しいペトリ皿 (85 mm × 15 mm) に転送します。</li>
		<li>表面滅菌シロイヌナズナ(コル-0) 種子ボルテックス混合物 0.05% を含む 70% (v/v) エタノールとトゥイーン 20 10 分。</li>
		<li>スピン ・ ダウン 2 の最大速度でベンチ トップ遠心分離機を使用して種 s、上澄みを除去し、無菌フードに新しい滅菌フィルター紙の上に種を 30 s. ピペットの 100% エタノールで種子を一度洗浄します。種子を空気乾燥し、½ MS 寒天プレートの上に並べます。</li>
		<li>次の設定での植物育成装置にそれらを転送する前に 48 時間の 4 ° C でプレートを格納: 16 h 120-150 μ m m-2の-1輝度で 22 ° C.の 8 h 暗いの光
</li>
		<li>砲撃の効率を向上させる新しい ½ MS 中皿の中央に直径の 30 mm の円に 7 日間の古いサンプル植物を転送します。 注意: は、転送すると新しい ½ MS プレートの上に置いて植物を重ならないようにします。</li>
		<li>植物や水分を保持し、次の手順の中に出て植物を乾燥を防止するために、組織の表面に ½ MS 液体培地を数滴を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プラスミッド DNA が付いている金の微粒子をコートします。<ol>
<li>渦金マイクロ ・ キャリア ソリューション、徹底的に 3 分新しい 1.5 mL チューブ準備です。</li>
		<li>管と渦に以下のソリューションを順次追加: 25 μ L (1.5 mg) 金粒子、渦 10 s;25.46 mg/L スペルミジン、渦 10 s の 10 μ L5 μ L 1µg/μ L プラスミド DNA の渦 3 分;25 μ L 277.5 mg/L CaCl2ソリューションの渦 1 分。 注意: この手順中にボルテックスをしてください。</li>
		<li>ペレットを乱すことがなく 5 s と慎重に上澄みをピペットの最大速度でベンチ トップ遠心分離機を使用してゴールド microcarriers スピンダウンします。エタノール 200 μ L で洗浄し、5-10, スピンの 5 s と削除、エタノールの最大速度でダウン渦によるペレットを再中断します。</li>
		<li>再無水エタノールと 3 つの macrocarriers の真ん中に分注 6 μ 粒子サスペンションの 18 μ L で金粒子を中断します。空気乾燥させてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パーティクルガンによる植物に DNA を転送します。<ol>
<li>次に粒子配信システムを設定: 9 cm 粒子飛行距離 1 cm 間隔、28 ミリメートル Hg 真空 1100 psi。</li>
		<li>3 つの異なるポジションで 3 回寒天培地プレート上のセル/植物を砲撃、砲撃後すぐに暗いセル/植物を保ちます。 注意: は、高圧ガス及び高速粒子システムとの関連付けのため粒子配信システムを動作しているとき、安全眼鏡を着用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>植物育成装置で暗闇の中で蛍光信号の観測の前に 6 〜 72 時間衝撃セル/植物を保ちます。24 h 暗いおよび 22 ° C に植物育成装置を設定します。 注意: 式効率と蛍光信号強度がプロモーター ・遺伝子・植物/組織に依存します。</li>
</ol>5. 共同アグロバクテリウムによる複数のキメラ蛍光蛋白質を表現する安定した形質転換シロイヌナズナの生成-変換を介した。
<ol><li>雪解けの氷にアグロバクテリウム有能なセル (PMP90) と 30 分待ってから、2 μ L バイナリ ベクトル (100-200 ng) 有能なセルに上 (準備) を追加します。混合物を 10 分間氷の上に座る。</li>
	<li>中古冷蔵 0.1 cm エレクトロポレーション キュベットに混合物を転送します。キュベットをエレクトロポレーション システムに挿入し、次の設定でエレクトロポレーションを実行: 1.6 kV、600 ω、25 μ F。</li>
	<li>直後に、エレクトロポレーション キュヴェットに SOC 液体培地 1 mL を追加、新しい 1.5 mL チューブに細胞をピペット, 200 rpm で 120 分間の水平軌道シェーカーで 28 ° C で。</li>
	<li>2,348 の x g で 5 分間室温で細胞を遠心、上清の大半を破棄、優しく再中断ピペット チップとペレットの細胞、Hygromycin B、50 mg/L を含む LB プレート上に広がったおよび 2 〜 3 日の 28 ° C の孵化させなさい。</li>
	<li>シロイヌナズナCol 0、アグロバクテリウム、前述のように花のすくい28法による複数のタンパク質発現カセットを組み込んだベクター pCAMBIA1300 が含まれている植物を変換します。安定した遺伝子組換え植物を生成します。</li>
	<li>0.05% を含む 70% (v/v) エタノールとそれらを混合することによって形質転換シロイヌナズナ種子の表面を殺菌するトゥイーン 20。2 の最大速度でベンチ トップ遠心分離機を使用して種を 10 分スピン渦 s が、上澄みを除去し、100% のエタノール 30 の回で種子を洗浄 s。</li>
	<li>無菌フード滅菌フィルター紙の上に種子をピペットします。その後、自然乾燥し、½ MS 寒天 Hygromycin B を含む肯定的な後代をスクリーニングするためにそれらを広げます。</li>
	<li>2 日間の 4 ° C で版を孵化させなさい。7 日間、植物育成装置と文化に転送します。</li>
	<li>蛍光顕微鏡下で蛍光シグナルをチェックして 7 日間の古い生存幼植物を選択し、さらにホモ植物のスクリーニングのための土に植物を移します。</li>
</ol>6. 医薬品治療
<ol><li>医薬品治療について、細胞または植物と孵化する前に、適切な作業濃度に MS 液体培地に各薬剤を希釈します。<ol>
<li>ワートマンニン治療: DMSO ワートマンニン粉末を溶解して 1 mM ワートマンニンの貯蔵液を準備し、-20 ° C で在庫を保管16.5 μ M wortmammin を含む MS 液体培地に植物細胞や幼植物を移すし、イメージングの前に 30-45 分間インキュベートします。</li>
		<li>ブレフェルジン A (bfa): DMSO で BFA 粉末を溶解して 1 mM BFA の貯蔵液を準備し、-20 ° C で在庫を保管植物細胞や幼植物を 10 μ g/mL BFA のイメージングの前に 30-45 分を含む液体の MS 培地に移します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 共焦点顕微鏡とタンパク質の共局在解析
<ol><li>幼植物または従来のガラス スライド上に懸濁細胞を転送し、標準的な共焦点レーザ走査型顕微鏡によるイメージングのための上部のカバー スライドをそっと。次の設定を使用: 63 X 水目的 (N.A 1.4)、0 の背景、700 利得、0.168 mm ピクセル サイズ、および光電子増倍管検出器。485 で GFP 付けられた蛋白質をエキサイト nm 525 で蛍光を検出し、nm。514 でエキサイト RFP タグ付きタンパク質の nm 575 で検出と nm。</li>
	<li>プラグインを上記8として、ピアソン スピアマン相関 (PSC) の共局在をイメージ J ソフトウェア (https://imagej.nih.gov/ij/) を用いた蛍光信号の共局在比を計算します。ピアソンの相関係数、スピアマンの順位相関係数は、結果 (図 4) に表示されます。生産の r 値は-1 から 1 になります。0 は説明 +1 と-1 表示の 2 つの信号の完全正・負の相関、それぞれに対し 2 つの信号の相関を検出します。</li>
</ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+protein+sorting+to+vacuoles+in+plant+cells:+evidence+for+two+pathways.">Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways.</a> J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).</li><li>Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-adapted+green+fluorescent+protein+is+a+versatile+vital+reporter+for+gene+expression,+protein+localization+and+mitosis+in+the+filamentous+fungus,+Aspergillus+nidulans.">Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans.</a> Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).</li><li>Bruening, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+gene+silencing+regularized.">Plant gene silencing regularized.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).</li><li>Wassenegger, M., Pelissier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+RNA-mediated+gene+silencing+in+higher+plants.">A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants.</a> Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).</li><li>Dehio, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+plant+genetic+loci+involved+in+a+posttranscriptional+mechanism+for+meiotically+reversible+transgene+silencing.">Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).</li><li>Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+for+all:+A+novel+robust+system+for+co-expression+of+multiple+chimeric+fluorescent+fusion+proteins+in+plants.">Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants.</a> Front Plant Sci. 8, 1071 (2017).</li><li>Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+genes+and+cis-regulatory+regions+improves+qualitative+and+quantitative+traits+in+crops.">Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops.</a> Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).</li><li>Zhu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+&amp;#34;purple+endosperm+rice''+by+engineering+anthocyanin+biosynthesis+in+the+endosperm+with+a+high-efficiency+transgene+stacking+system.">Development of &amp;#34;purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system.</a> Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).</li><li>Tang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+formation,+evolution,+and+functionalization+of+new+cytoplasmic+male+sterility+genes+in+the+plant+mitochondrial+genomes.">Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes.</a> Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).</li></ol>

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ここでしっかり共同植物におけるキメラ蛍光融合蛋白質を表現する手法を説明してきました。一過性発現と形質転換の両方に使用できる、現在蛍光タンパク質ベース バイオ イメージング、分子および生化学的なアプリケーションおよびテクノロジー9,10,13 との互換性.さらに、タンパク質の共発現にいくつかの個々 の発現...

キメラ蛍光融合タンパク質は、細胞内動態と細胞内局在を勉強し、さらに生理機能や作業のメカニズム1,2,を理解する役に立つツールとみなされています。3,4. 共同エクスプレスよく知られているオルガネラ レポーター蛋白質蛋白質の良い時空間理論的根拠、配布、およびセル4内システム内の機能を説明するために問題の特に有益です。,5,6,7,8。
キメラの蛍光融合蛋白質は、それぞれ長所と制限9,10,11を持っている植物を介して一過性発現と安定な形質転換で表現できます。タンパク質の一過性発現が含まれています biolistic の衝突-、ポリエチレング リコール (PEG) 便利なアプローチ-、またはプロトプ ラストとアグロバクテリウムのエレクトロポレーションによる DNA 一過性発現-葉浸潤を介したそのまま植物の細胞、図 1 a、B12,13,14,15,16に示すように。ただし、単一植物細胞における複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現にはいくつかの独立した発現プラスミドの混合物が必要です。したがって、植物の共発現用の複数のプラスミドを用いたの欠点は、同時に単一のプラスミドと比較した場合の同じセルに入るいくつかのプラスミドの劇的に減らされたチャンスのため下位の共発現レベルとセル17,18に転送されているプラスミドのそれぞれのタイプの手に負えないほどランダムな量によって引き起こされる蛋白質発現レベルの変動。さらに、タンパク質の共発現9,10,11の単一アグロバクテリウムにいくつかの独立した発現プラスミドを導入する技術的に困難です。したがって、アグロバクテリウム-図 1 bに示すように、葉たばこの含浸による一過性発現を介したタンパク質は、一度に 1 つのプラスミドを表現できるのみ。対照的に、蛍光融合蛋白質を表現する遺伝子組換え植物の世代は、バイナリ変換ベクトルを運ぶアグロバクテリウムによって行われます通常。ただし、遺伝子導入および植物ゲノムへの挿入を仲介するバイナリのベクトルだけ単一蛍光融合タンパク質 (図 1 b)9,10,12を表現することが可能です。いくつかのキメラ蛍光タンパク質を同時に表現する遺伝子組換え植物を生成すると、複数回の遺伝的交差と共発現する遺伝子の数に応じて年ヶ月から取ることができるスクリーニングが必要です。
共同工場で複数のタンパク質発現の単一発現ベクターは、以前のいくつかによって報告されている雇用研究19,20,21です。ただし、複数回の酵素の消化力と DNA 分子とバックボーンのベクトルの DNA の ligation が通常必要タンパク質の共発現または過剰発現の最終的なプラスミッドの生成です。ここでは、共同植物における複数のキメラ蛍光蛋白質を表現するための新しい堅牢な方法を開発しました。両方の一過性発現のための植物で複数タンパク質の共発現と昔ながらの方法で安定した変換を実現する非常に効率的かつ便利な方法です。共発現用複数の機能的に独立してタンパク質発現カセットを含み、従来法の欠点を克服することにより 1 つのベクトルを採用しています。また、どの DNA DNA 消化と結紮の余分な手順なしに最適化された簡単なワンステップ反応により操作とアセンブリを実現します。 汎用性の高いシステムです。動作原理を図 2に示します。さらに、キメラの蛍光融合蛋白質に基づいている現在の細胞、分子および生化学的なアプローチと完全に互換性が。

<table><tbody><tr><td>KOD-FX Polymerase</td><td>TOYOBO</td><td>KFX-101</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>NEB</td><td>R0141L/S/V</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>BBI</td><td>A600194-0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BBI</td><td>A601336-0500</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>#N0447V</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>BBI</td><td>C4H10O2S2</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>BBI</td><td>A100159-0500</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>BBI</td><td>A600641-0001</td><td></td></tr><tr><td>T5 exonuclease</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>NEB</td><td>B9022S</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture(MS)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>BBI</td><td>A500737-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BBI</td><td>A600560-0500</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BBI</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>BBI</td><td>A614270-0001</td><td></td></tr><tr><td>Gold microcarrier particles</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td>1.0 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BBI</td><td>CD0050-500</td><td></td></tr><tr><td>Macrocarriers</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>Rupture disk</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2329</td><td></td></tr><tr><td>Stopping screen</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BBI</td><td>A610476-0001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BBI</td><td>A610440-0500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BBI</td><td>A600219-0001</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Genview</td><td>AH169-1G</td><td></td></tr><tr><td>Wortmannin</td><td>Sigma</td><td>F9128</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>SML0975-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td><td>BBI</td><td>A600163-0500</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Panasonic</td><td>MLR-352H-PC</td><td></td></tr><tr><td>PSD-1000/He particle delivery system</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5427000097</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 7 DUO (780&amp;amp;7Live)</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>EPS-300 Power Supply</td><td>Tanon</td><td>EPS 300</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Mshot</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>Agrose</td><td>BBI</td><td>A600234</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>BBI</td><td>A100339</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene Diamine Tetraacetie Acid</td><td>BBI</td><td>B300599</td><td></td></tr></tbody></table>

co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in an efficient way in plants

蛋白質の時空間的細胞内 localization(s) については、細胞の生理機能を理解する重要です。蛍光タンパク質と蛍光融合タンパク質の生成は、乱暴に直接タンパク質の局在と細胞のダイナミクスを可視化する効果的なツールとして使用されています。それは興味の蛋白質と共発現後よく知られている細胞小器官のマーカーとの比較に便利です。それにもかかわらず、植物タンパク質の共発現の古典的手法は、通常、複数の独立した発現プラスミドを含む、したがって低共発現効率、発現レベルの変動、高時間などの欠点があります。遺伝学的交差およびスクリーニングの支出。本研究では堅牢で新しい植物の複数のキメラ蛍光タンパク質の共発現法について述べる。それは、複数の半独立した表現するカセットから成る単一発現ベクターを用いた従来の方法の限界を克服します。各蛋白質発現カセット、独自の機能性蛋白質の表現の要素を含み、したがってそれ柔軟に調整できる多様な表現の需要を満たすために。また、それは簡単なアセンブリを実行して追加消化と結紮手順なし最適化されたワンステップ反応を用いた発現プラスミドの DNA の操作の断片します。さらに、現在の由来の蛍光タンパク質バイオ イメージング技術やフレットなど BiFC のアプリケーションと完全に互換性が。メソッドの検証としては、蛍光融合共同エクスプレス空胞並べ替え受容体と分泌キャリア膜タンパク質にこの新しいシステムを採用しました。結果は、その視点細胞内局在化が一過性発現と形質転換植物における先行研究と同じであることを示します。

共同工場で複数のキメラの蛍光融合タンパク質発現のため堅牢で非常に効率的な方法を開発しました。それは従来の障壁を通って壊れるアプローチは、図 1 a、B で示すように、共発現に複数の分離されたプラスミドを使用、一過性発現または安定な形質転換。この新しいメソッドでは、共発現を一度に (図 1</st...

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Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

従来の方法の難しさを克服するために植物の複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現手法を開発しました。タンパク質の共発現を達成するためにカセットを表現する複数の機能的に独立して蛋白質を含んでいる単一発現プラスミドを使用する利点がかかります。

植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

co-expression-multiple-chimeric-fluorescent-fusion-proteins-an

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.6K ビュー.  South China Agricultural University. 従来の方法の難しさを克服するために植物の複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現手法を開発しました。タンパク質の共発現を達成するためにカセットを表現する複数の機能的に独立して蛋白質を含んでいる単一発現プラスミドを使用する利点がかかります。

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

環境学

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the transgene, as multi-copy integrations are often subjected to gene silencing. The Gateway-compatible binary vector based on bacterial artificial chromosomes (pBIBAC-GW), like other pBIBAC derivatives, allows the insertion of single-copy transgenes with high efficiency. As an improvement to the original pBIBAC, a Gateway cassette has been cloned into pBIBAC-GW, so that the sequences of interest can now be easily incorporated into the vector transfer DNA (T-DNA) by Gateway cloning. Commonly, the transformation with pBIBAC-GW results in an efficiency of 0.2&#8211;0.5%, whereby half of the transgenics carry an intact single-copy integration of the T-DNA. The pBIBAC-GW vectors are available with resistance to Glufosinate-ammonium or DsRed fluorescence in seed coats for selection in plants, and with resistance to kanamycin as a selection in bacteria. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic plants using pBIBAC-GW: starting from recombining the sequences of interest into the pBIBAC-GW vector of choice, to plant transformation with Agrobacterium, selection of the transgenics, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts using DNA blotting. Attention is given to designing a DNA blotting strategy to recognize single- and multi-copy integrations at single and multiple loci.

Using a pBIBAC-GW binary vector makes generating transgenic plants with intact single-copy insertions, an easy process. Here, a series of protocols is presented that guide the reader through the process of generating transgenic Arabidopsis plants, and testing the plants for intactness and copy number of the inserts.

BIBAC GW バイナリ ベクトルを使用してシングル コピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

遺伝学

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

免疫・感染学

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

生物学

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

タンパク質の共発現の多面的メリットで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

緑の蛍光蛋白質感染時に細菌から配信されるエフェクターを視覚化するシステムを分割します。

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

要約

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ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

BIBAC GW バイナリベクトルを使用してシングルコピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーションシーケンスの同定

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

タンパク質の共発現の多面的メリットで

多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

緑の蛍光蛋白質感染時に細菌から配信されるエフェクターを視覚化するシステムを分割します。

植物の効率的な方法で複数のキメラ蛍光融合タンパク質の共発現

要約

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ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

BIBAC GW バイナリ ベクトルを使用してシングル コピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

タンパク質の共発現の多面的メリットで

多重化アプリケーションのための蛍光タンパク質との遺伝バーコーディング

培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

緑の蛍光蛋白質感染時に細菌から配信されるエフェクターを視覚化するシステムを分割します。

BIBAC GW バイナリベクトルを使用してシングルコピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーションシーケンスの同定