私たちは、R.太陽と植物材料の生成への貢献のために陳氏の研究室の他の学生に感謝します。また、技術革新（CTI）の大学の学部の研究の彼のサポートのために博士D.グリーンに感謝します。この研究は、Q.陳にNIH助成U01 AI075549と1R21AI101329、およびQ.陳にアリゾナ州立大学のCTIからSSE助成金によって部分的にサポートされていました。 K. Leuzinger、M.デント、J.ウルタドとJ. Stahnkeは、SSEの助成金によって支え学部学生です。

1。植物成長<ol><li>伝播トレイに60泥炭ペレットを置きます。水道水4リットルを追加し、泥炭ペレットは2時間のために水を吸収することができます。 </li><li> 2 Nを追加シーダーを使用して、各泥炭ペレットにbenthamianaの種子は、透明なプラスチックドームでトレイをカバーし、それらが8分の16時間の昼/夜サイクル（ 図1A）で25℃、84％湿度環境で発芽することができます。 </li><li>二週間播種後ドームを外し、トレイから水を排水し、1.48グラム/ L（ 図1B）の濃度でジャックの肥料の2 Lを追加します。 8分の16時間昼/夜サイクルは25℃、湿度50％の環境下で植物を成長を続けています。トレイあたり2日ごとにジャックの肥料の2 Lを供給してください。 </li><li>彼らは6週齢（ 図で浸透させることが準備が整うまで、4週では、更なる成長（ 図1C）のために十分なスペースを提供するために6工場をホストする新しいトレイに泥炭ペレット工場を移転1D）。 </li></ol> 2。A.ツメファシエンス文化準備シリンジ浸潤用2.1準備<ol><li>ストリークA. geminiviralベクトルP19、pREP110、pBYGFP、およびカナマイシン（100μgの/ ml）を含有するLB寒天プレート上でpBYDsRedを含むツメファシエンス GV3101菌株。ストリーク1プレート当たりひずみと48時間30℃で成長する。 </li><li>同様に、筋や5のMagnICONベクトル宿すGV3101株 &#39;モジュール（pICH15879）、3&#39; LB寒天上にGFPあるいはDsRedを（PICH-GFPまたはPICH-DsRedを）、およびインテグ（pCH14011）の標的遺伝子を含むモジュールを育てるカルベニシリンを（は100μg/ ml）を含有するプレート。 </li><li> LB寒天プレート上の単一のコロニーから、YENBメディア3mlの（0.75％バクトイーストエキス、0.8％栄養ブロスは、NaOHでpHを7.5に調整）+カナマイシン（100μgの/ ml）の中にgeminiviralベクトルを保有GV3101株を接種15ミリリットル丸底培養管、30℃で液体培養を成長°Cで300 rpmの回転速度で一晩振とう機。 </li><li>同様に、30℃で一晩振とう機に+カルベニシリン（100μg/mlの/ ml）を℃のYENBメディアにMagnICONベクトルを保有GV3101株を接種し、成長</li><li>分光光度計で各液体培養のために測定し、記録OD 600値は、適切な抗生物質でYENB培地10ml中の0.025の開始OD 600と新しい文化のために継代培養することに必要な容積（V サブ ） を計算するには、以下の式を使用し。 V サブ （溶液）=（10ml）溶液×（0.025）/ OD 600 </li><li>一晩培養の譲渡V サブ （ML）（10 - V サブ ）に各菌株に対する適切な抗生物質とYENBメディアのmlの。 OD 600値が1.7から2.0の範囲内になるまで、250 rpmの回転速度で30℃で一晩新しい文化°シェーカーでCを育てる。 </li><li>測定し、それぞれの液体培養のためにOD 600の値を記録し、計算値には、以下の式を使用し各株について0.12の最終的なOD 600を与えるために浸透バッファー50mlに希釈することが必要な容積（V INF）を ulate。 V infファイル （溶液）=（50ミリリットル）×（0.12）/ OD 600 </li><li>転送Vマイクロ遠心チューブに各培養のinfファイル （ml）と2分間12,000 xgで遠心分離して細胞をスピンダウンし、10mMのMES、pHは5.5（10ミリリットル浸潤バッファーに細胞を再懸濁後、上清を除去し、10mMの硫酸マグネシウム4）簡単にボルテックスで。 </li><li> 、pBYGFP + pREP110 + P19の再懸濁した細胞を混ぜて2分間12,000 xgで細胞をスピンダウンし、浸潤バッファー50mlの合計に懸濁します。このアグロバクテリウム組み合わせは、GFPのgeminiviral表現のためである。 </li><li>同様に、 アグロバクテリウム細胞の次の組み合わせを混ぜ、スピンダウンと浸潤バッファー50mlに再懸濁します。彼らは、（1）pBYDsRed + pREP110 DsRedのgeminiviralの表現、（2）pBYGFP + pBYDsRed + pREP110用+ P19GFPとDsRedを、（3）pREp110のgeminiviral共発現のための+ P19 + P19 geminiviral式のネガティブコントロールとして、（4）PICH-GFP + pICH15879 GFP、（5）PICH-DsRedをのMagnICON発現用+ pCH14011 + pICH15879 + DsRedを、（6）pICH15879のMagnICON発現のpCH14011 + pCH14011 MagnICON発現のネガティブコントロールとして。 </li></ol>減圧浸潤用2.2準備<ol><li>接種や文化それぞれGV3101 50ミリリットルオートクレーブフラスコ内の適切な抗生物質でYENBメディアの15ミリリットルにgeminiviralベクトルまたはMagnICONベクトルを含むひずみと成長は一晩、上記のシリンジ浸潤に関して説明。 </li><li>分光光度計、適切な抗生物質でYENBメディアの250ml中に0.025の開始OD 600と新しい文化のために継代培養することに必要な容積（V サブ ） を計算するには、以下の式を使用して各液体培養のための測定と記録OD 600値。 V サブ </sub&gt;（溶液）=（250ml）中×（0.025）/ OD 600 </li><li> （250 - V サブ ）に一晩培養の譲渡V サブ （ml）を各株のための適切な抗生物質を1 Lオートクレーブフラスコ中YENBメディアmlの一夜上記シリンジ浸潤に関して説明新しい文化を育てる。 </li><li>測定し、それぞれの液体培養のためにOD 600の値を記録し、各株に対して0.12の最終OD 600を与える浸透バッファ3Lに希釈されるために必要な容積（V INF）を計算するには、以下の式を使用します。 V infファイル （ML）=（3000ミリリットル）×（0.12）/ OD 600 </li><li>ペレットと浸透バッファ内の各文化の再懸V INF（ml）を注射器浸潤で説明し、シリンジ浸潤のため記載の組合せに応じて再懸濁培養液を混ぜると。 Repellet混合アグロバクテリウム細胞と浸潤バッファ3Lに、それらを再懸濁します。 </li></ol> 3.1シリンジ浸透<ol><li> 4 6週齢のNを選択してください5葉それぞれにベンサミは植物。各工場の上から数えて最初の三つの葉はAの組み合わせのいずれかが完全に浸透されます浸透バッファ内の歪みをツメファシエンス 。第四の葉がgeminiviral式またはMagnICON式の3つのすべての組み合わせについてすべての4つの歪みの組み合わせでスポット浸透されます。各工場の最後の葉が陰性対照の組み合わせで浸透されます。 </li><li>葉の裏側（ 図2A）上の表皮に針で小さなニックネームを作成します。注意：浸潤混合物中のアグロバクテリウム細胞は葉の反対側に穿刺を通過するように、両側を通して葉貫通するように一生懸命傷つけないように注意してください。 </li><li>葉の表側をしっかりホールドを取り、穏やかかけながら片手の親指でニックにカウンター圧力が、針（ 図2B）なしシリンジでニックに浸透バッファ内のアグロバクテリウムの混合物を注入する。注： アグロバクテリウムの混合物は、葉の細胞間隙に入ると、浸潤領域（ 図2C）目に見えて暗く緑色に変わります。 </li><li>暗い緑色の円が拡大して止まるまでニックにアグロバクテリウム混合物を注入し続けています。全体の葉が浸透し、全体の葉は最初の三つの葉と最後の葉のために暗い緑色に点灯するまで、別のニックネームと繰り返し3.1.2-3.1.4を作成します。 </li><li>各工場の第四の葉は、4つのすべて（geminiviralベクトル）または3（MagnICONベクトル）の組み合わせは、それに浸透されます。 アグロバクテリウム株の組み合わせごとに1つのニックネームを作成し、1つの組み合わせで、各ニックネームに潜入。 </li><li>浸透した後、成長室とMONIに工場を戻すポスト浸潤（dpi）で2-15日の間にTorのタンパク質発現。 </li></ol> 3.2減圧浸潤<ol><li>真空デシケーターと浴槽へのアグロバクテリウム株を含む振込3 L浸潤バッファに浴槽を置きます。 Vacuubrandダイヤフラム真空ポンプ（ 図3A）にデシケーターを接続します。 </li><li>デシケータープレート（ 図3B）に逆さまに工場を置き、全体の葉や茎システムは浴槽の上に休んでいる板を浸透バッファに浸漬されるまで、植物とプレートを下げる。リムに沿ってデシケーターOリングを置き、室（ 図3C）のデシケーターのふたを置く。 </li><li>真空ポンプの電源を入れ、真空が100ミリバールに達したときにタイミングを開始します。ゆっくり沈んで植物組織の間質空間にアグロバクテリウムの入り口を可能にするために100ミリバールで1分後にデシケーターのリリースバルブを開きます。このステップを1 additiを繰り返し良い浸透を確保するためonal時間。 </li><li>浸透した後、デシケーターの植物を取り出し、その直立の位置に戻す。成長室とモニター2-15解像度間でのタンパク質発現に植物をバックに移動します。 </li></ol> 4。蛍光タンパク質の検出と写真<ol><li>暗い部屋に2解像度、移動植物からの起動と手持ちのUVランプで浸潤葉の裏面にUV光を当てる。 </li><li> GFPまたはDsRedのの赤色蛍光の緑色の蛍光を観察する。 DsRedのは、短波のUV光の下で強くなる一方GFPは、長波長のUV光で強い信号を放つ。 </li><li>フラッシュなしとの定期的なデジタルカメラで蛍光葉の写真を撮る。 </li><li>観察や撮影後の成長部屋に植物をバックに移動します。 </li></ol>

<ol>
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S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+production+of+virus-like+particles+and+monoclonal+antibodies+with+geminiviral+replicon+vectors+in+lettuce.">Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce.</a> Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).</li><li>Giritch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+high-yield+expression+of+full-size+IgG+antibodies+in+plants+coinfected+with+noncompeting+viral+vectors.">Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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著者らは、金銭の利益を競っていない。

タンパク質ベースの医薬品の需要の増加は、世界的な堅牢でスケーラブルな、低コストかつ安全で新しい生産プラットフォームが必要です。植物は、医薬用タンパク質生産のための最も有望な代替的な生産システムのいずれかであることが示されている。近年では、解体ウイルスに基づくベクターの開発が大きく速度および植物発現系2,10の収率を高める植物におけるタンパク質の一?...

1970年代から、植物は、組換えタンパク質およびタンパク質治療1の商業的生産のために、哺乳動物、昆虫、および細菌細胞培養物の代替として検討されている。バイオ医薬品の発現のための植物ベースのシステムでは、ゴーシェ病2、鳥H5N1インフルエンザ3のように、病気のためのいくつかの新規治療法として近年の約束を示している臨床試験の成功を示している。それらの最初の実験以来、数十年の植物での組換えタンパク質の発現のために有能なメカニズムの開発には、3つの主な理由のためにタンパク質生産の現在のパラダイムを変更する植物ベースのシステムの可能性を作成しました。まず、哺乳類、昆虫、そして細菌のバイオリアクターは、かなりのスタートアップコスト、高価な増殖培地、下流浄化4のための複雑なプロセスを必要とし、コストの顕著な低下を起こすことがあります。安定したトランスジェニック植物の作成ラインはまた、タンパク質を発現する植物が成長し、農業の規模5で収穫することができるように、彼らが他の発現システムのスケーラビリティを上回ることができます。第二に、植物に基づく発現系は、著しく公共の安全6の優位性を実証し、ヒトへのタンパク質を発現する宿主からヒトまたは動物の病原体を送信する危険性を低減する。最後に、植物は、グリコシル化およびマルチサブユニットタンパク質のアセンブリ7を含むタンパク質の適切な翻訳後修飾を可能にする、哺乳動物細胞に類似している真核細胞内膜システムを利用する。この能力が先に細菌などの原核生物系、に基づいて、それらの植物ベースのシステムを置き、モノクローナル抗体（mAb）を含む医薬品の組換えタンパク質の広い数が、より複雑な構造を持ち、広範な翻訳後修飾またはアセンブリ8が必要です。 二つの主要な適切があります植物において組換えタンパク質を発現する痛み。まず、標的タンパク質をコードするDNAを発現カセットにクローニングし、核または葉緑体ゲノムのいずれかに導入されて安定してトランスジェニック系統の開発である。そうすることで、外来DNAは、後続世代を遺伝になり、はるかに他の発現系1のそれを超えて、途方もなく改善されたスケーラビリティを可能にします。核ゲノムへの外来DNAの導入は通常、組織9の微粒子銃によって、よりしばしば、植物組織のアグロバクテリウム·ツメファシエンスの感染によって達成されるか。植物ホルモンは、その後、根や葉などのトランスジェニック植物組織の分化と増殖を誘導するために使用される。葉緑体ゲノムの形質転換は、A.では達成できないツメファシエンスが、DNAでコーティングされた金またはタングステン粒子に完全に依存しては、植物細胞に弾道発射。再結合を表現する第二の方法植物中のntタンパク質は、一過性発現10を介してである。このシナリオでは、目的の遺伝子を保持するウイルス由来のベクターは、A.を介して配信されていアグロと呼ばれるプロセスを経て完全に開発された植物にツメファシエンス 。代わりに、植物ゲノムに統合することで、送達、遺伝子構築物は、短い潜伏期間の後に採取し、単離することができる所望のタンパク質の一時的な生産を指示し始める。植物はアグロ11後約1〜2週間を収穫できるようになりますように一過性の遺伝子発現は、より大きな全体のタンパク質の蓄積だけでなく、タンパク質生産の改善、時間の利点を提供しています。これは、生成、選択、年に数ヶ月かかることが安定したトランスジェニック植物系統の確認、のプロセスよりもかなり高速です。それは遺伝的に安定植物リチウムが得られないのでしかし、これは、また、一過性発現系の制限です大規模な商業生産のための種子バンクを生成するために使用することができる別項。これにもかかわらず、アプローチは、大規模な一過性の発現を改善するために開発されてきた。ここでは、A.によって配信解体ウイルスベクターを用いた一過性タンパク質発現ベンサミアナタバコ植物の発生する1つの方法を示すツメファシエンス 。 二つの主要な方法がAの送達のために開発されている植物組織へのツメファシエンス ：真空チャンバを介して注射器や大規模溶浸を介してベンチスケールの浸潤。両方のプロトコルは、Nを使用してここで説明されている密接に共通のタバコ植物に関連しているベンサミ、、2つの蛍光タンパク質の一過性発現のための宿主植物として：クラゲオワンクラゲとDiscosomaサンゴ（DsRedを）12,13から赤色蛍光タンパク質から緑色蛍光タンパク質（GFP）。 N. benthamianaのはのための最も一般的な宿主植物であるそれは遺伝的形質転換に従順であるため、組換えタンパク質は、急速にバイオマスを大量に産出し、スケールアップ生産14多作シードプロデューサーであることができます。 N.を使用することの別の利点タンパク質発現のための宿主としては、ベンサミ発現ベクター2,5の様々な可用性である。本研究では、2解体ウイルスベクター、タバコモザイクウイルス（TMV）RNAレプリコンシステム（MagnICONベクトル）とBean黄色萎縮ウイルス（BeYDV）DNAレプリコン系（geminiviralベクトル）4,11由来その他、に基づくもの15-18は 、GFPとDsRedの遺伝子を運ぶとNにそれらを提供するために使用されA.経由benthamianaの細胞ツメファシエンス。スリーDNA構築物は、GFPまたはMagnICONベクトルとDsRedの発現のために使用されます。彼らは、5 &#39;プロモーターおよび標的遺伝子の発現を駆動するための他の遺伝要素を含むモジュール（pICH15879）、3&#39;関心のある遺伝子（PICHを含むモジュールを含む-GFPまたはPICH-DsRedを）、およびインテグモジュール（pICH14011）は、式8,15次第5 &#39;および3&#39;モジュールを一緒に統合する酵素をコードする。三DNA構築物はまた、geminiviralベクターで発現のために必要とされる。標的遺伝子（pBYGFP又はpBYDsRed）のレプリコンを含むベクターに加えて、複製タンパク質（pREP110）をコードするベクターは、標的レプリコン11,14,16の増幅に必要とされる。また、トマト毛スタントウイルス由来のサイレンシング抑制P19をコードするベクターの包含は、高レベルの標的遺伝子発現11,16が望まれる。 植物の成長、A.含むアグロによる植物細胞への組換えタンパク質の遺伝子を導入するための3つの手順は、一般にありツメファシエンス文化の準備、および浸潤。すべてのステップでは、それぞれの詳細な説明が提供され、したがって、この手順の最終的な成功のために重要であるように、シリンジ浸潤と下減圧浸潤の両方に。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V353-20</td>
			<td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> See reference: Lico and Chen, et al 2008</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632152</td>
			<td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> See reference: Baird and Zacharias, et al 2000</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MagnICON Vector</td>
			<td>Icon Genetics</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> See reference: giritch and Marillonnet, et al 2006</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Geminiviral Vector</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Chen and He, et al 2011</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>N. benthamiana</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agrobacterium tumefaciens strain gv3101</td>
			<td>Author's Lab</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See reference: Lai and Chen 2012</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Carbenicillin-100, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0418</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LB Agar Kanamycin-50, plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0543</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium sulfate hepa hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773-500 g</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto-Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>73049-73-7</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 212750</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difco Nutrient Broth</td>
			<td>Becton, Dickinson &amp; CO.</td>
			<td>REF 234000</td>
			<td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MES hydrate Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250-1kg</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1613-1ML</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70560-51-9</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Jack's Fertilizer</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>Jul-25</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuubrand MD4 Vacuum Pump</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-878-113</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vacuum Air Regulator Valve</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9386590</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Desiccator 12 1/8" with O ring</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-594-15C </td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>3 L Tub</td>
			<td>Rubber-Maid</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rubbermaid Servn' Saver Bowl, 10-cup will work</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>plate/shelf 230ML</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9489269</td>
			<td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peat Pellet</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>14-2370-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagation Tray Dome</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>132052</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propagaiton Tray</td>
			<td>hydrofarm</td>
			<td>138758</td>
			<td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Virbo Hand Seeder</td>
			<td>Gro-Mor INC</td>
			<td>n/a</td>
			<td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank">www.gro-morent.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flora Cart 4 shelf</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>65-6924-1</td>
			<td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Round Bottom Culture Tubes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS430172-500EA</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectrophotometer Cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>223-9950</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2500</td>
			<td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>166-0602EDU</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubator/Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank">www.eppendorf.com</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultraviolet Light Model#: UVGL-25</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0021-12</td>
			<td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins

哺乳動物細胞培養は、ヒト用ワクチンと治療用タンパク質の商業生産のための主要なプラットフォームです。しかし、その限られたスケーラビリティと高コストのために医薬の増加世界的な需要を満たすことができない。植物は、低コストで安全な、スケーラブル、堅牢で最も有望な代替医薬品製造プラットフォームの1つであることが示されている。ウイルスベースのベクターの最近の開発は、植物における組換えタンパク質の迅速かつ高レベルの一過性発現を可能にした。さらに一過性発現システムの有用性を最適化するために、我々はこの研究では、植物組織に標的遺伝子を含有するアグロバクテリウムを導入するための、単純で効率的でスケーラブルな方法を示す。 GFPとDsRedの、両方シリンジ、真空方法は葉と2つの蛍光タンパク質の強固な生産にアグロバクテリウムの効率的な導入につながったとの我々の結果は、アグロを示している。さらに、我々は両方の方法によって提供されるユニークな利点を示しています。シリンジ浸潤は簡単で、高価な機器を必要としません。また、柔軟性がいずれかの標的遺伝子で全体の休暇に潜入するために、または1つの葉に複数のターゲットの遺伝子を導入することができます。このように、組換えタンパク質の実験室規模の発現のために、並びに収率又は発現動態のために異なるタンパク質またはベクターを比較するために使用することができる。シリンジ浸潤のシンプルさは、またバイオテクノロジーの主題のための高校や大学教育におけるその有用性を示唆している。対照的に、真空浸潤がより堅牢であり、医薬タンパク質の商業的製造のためにスケールアップすることができる。また、レタスやシロイヌナズナなどのシリンジ浸潤従順でない植物種をagroinfiltrateすることができるという利点があります。全体的には、注射器、真空アグロの組み合わせは、シンプルで効率的、かつ堅牢な研究者や教育者を提供しています一過性タンパク質発現のための方法。それが大幅に医薬品タンパク質の開発を促進し、科学教育を推進していきます。

1。シリンジ浸潤を蛍光タンパク質の発現 geminiviralとMagnICON - - N.二つの異なる解体植物ウイルスベクターによって- GFPとDsRedの-植物組織へのアグロバクテリウムのシリンジ浸潤の有効性を実証するため、我々は、2つの蛍光タンパク質の発現を試験したベンサミ 。 N.のために完全にアグロバクテリウムを含有geminiviralベクトル、GFPの発現と浸?...

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Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

植物は現在の式のパラダイムより、スケーラブルでコスト効率の高い、安全である商業規模で医薬品タンパク質の生産のための新たなシステムを提供しています。本研究では、我々を含む、標的遺伝子を導入するための簡単​​で便利な、まだスケーラブルなアプローチを報告<em&gt;アグロバクテリウム·ツメファシエンス</em&gt;タンパク質一過性発現のための植物へ。

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

efficient-agroinfiltration-plants-for-high-level-transient-expression

Research

JoVE Journal

Biology

47.7K ビュー.  Arizona State University. 植物は現在の式のパラダイムより、スケーラブルでコスト効率の高い、安全である商業規模で医薬品タンパク質の生産のための新たなシステムを提供しています。本研究では、我々を含む、標的遺伝子を導入するための簡単​​で便利な、まだスケーラブルなアプローチを報告アグロバクテリウム·ツメファシエンスタンパク質一過性発現のた...

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

メチロトローフ酵母における組換えタンパク質の発現ピキアパストリス</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製<em&gt; E.大腸菌の</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

マウスにおける流体力学的遺伝子送達によるタンパク質の一過性発現

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

の発現のためのHeLaベースの無細胞発現系<em&gt;マラリア原虫</em&gt; Rhoptryタンパク質

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Agrobacterium tumefaciensを用いたカカオ植物のプランタ一過性形質転換

Vacuum-Forced Agroinfiltration for In planta Transformation of Recalcitrant Plants: Cacao as a Case Study

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation rely on the use of Agrobacterium-mediated transformation. However, the protocols currently in use are standardized for small-sized plants due to the physical and economic constraints of submitting large-sized plants to a vacuum treatment. This work presents an effective protocol for localized vacuum-based agroinfiltration customized for large-sized plants. To assess the efficacy of the proposed method, we tested its use in cacao plants, a tropical plant species recalcitrant to genetic transformation. Our protocol allowed applying up to 0.07 MPa vacuum, with repetitions, to a localized aerial part of cacao leaves, making it possible to force the infiltration of Agrobacterium into the intercellular spaces of attached leaves. As a result, we achieved the Agrobacterium-mediated transient in planta transformation of attached cacao leaves expressing for the RUBY reporter system. This is also the first Agrobacterium-mediated in planta transient transformation of cacao. This protocol would allow the application of the vacuum-based agroinfiltration method to other plant species with similar size constraints and open the door for the in planta characterization of genes in recalcitrant woody, large-size species.

著者スポットライト:大型木本植物における組織培養フリー のアグロバクテリウム媒介形質転換

Here, we present the first protocol for localized vacuum infiltration for in vivo studies of the genetic transformation of large-sized plants. Using this methodology, we achieved for the first time the Agrobacterium-mediated in planta transient transformation of cacao.

難治性植物の プランタ内 変態のための真空強制農業浸透:ケーススタディとしてのカカオ

Transient in planta transformation is a fast and cost-effective alternative for plant genetic transformation. Most protocols for in planta transformation ...