このプロジェクトは、健康の研究のカナダの協会、アルバータ州の革新 - 健康ソリューション/アルバータ州がん財団からの助成金によって賄われていた。著者は神経生物学コア施設機器、建物、スライド、WHCAS でスキャン可能にされた、財団と製品の作成者のポーラの Gedraitis の仕事の使用のために再生装置を認めるたいです。分子デバイスは、この資料に記載されています。

腫瘍の標本は、ローカル施設内審査委員会および倫理委員会で承認された各国の規制に従って実施プロトコルに従って得られました。WHCAS とその関連ソフトウェアのこの記事で使用の材料表のとおりです。
1. 仕訳帳をインポートします。
<ol><li>関連付けられたソフトウェアを開きます。</li>
	<li>材料の表に示されているジャーナル スイートをダウンロードします。</li>
	<li>メイン メニューのジャーナルの見出しをクリックして、適切なディレクトリにジャーナル スイートをインポートインポート仕訳帳スイート...を選択し、インポートをクリックします。</li>
</ol>2. 作成の設定プレビュー スキャン取得
<ol><li>プレート獲得のセットアップ] ダイアログ ボックスでに行く目的とカメラ] タブ [4 X 倍率、カメラのビニングとして 1 と 2 のゲインとして。</li>
	<li>図 1 aにタブ板-Slidescanningの下の設定を入力します。 注: これらの設定は、ユーザーに表示し、最大 3 つのスライドを移動できるように作成されています。各スライドは、簡単なナビゲーションのための 3 の隣接する井戸に分割されているし、'ライブ' 組織スライスまたは細胞の可視化。</li>
	<li>[訪問サイト] タブでサイトに井戸を均一に埋めます。</li>
	<li>プレート下部設定の編集...] をクリックし、図 1 bに表示される値を入力します。</li>
	<li>集録ループ] タブで、[プレビュー スキャンの所望の波長 (この例では、核の染色) を入力します。最高のコントラストと画像ベースの焦点は、最も明るい蛍光信号 (例えば、しばしば核染色) を使用します。 これにより、バック グラウンドと比較してコントラストの高いのでメモ: 核染色など明るい染みのついた組織を染色推奨します。サンプルの場所にこの援助をするだけ、明るい色を他の色のイメージのオフセットを基に使用されます次の高倍率獲得の 1 つ以上の蛍光イメージングしているとき、。</li>
	<li>画像を一緒にステッチするプレート ・ アクイジション ・ モードでは、シェーディング補正を有効にします。</li>
	<li>A. 設定としてこの設定を保存します。</li>
</ol>3. 高倍率でスライド取得の設定の作成
<ol><li>プレート獲得のセットアップ] ダイアログ ボックスでに行く目的とカメラのタブ選択 40 X (最高デジタル解像度の)、ビニング カメラとして 1 と 2 (信号と画像の明るさを向上させる) を利得として、倍率として。 注: は、対物レンズの倍率を低く設定を使用できますが、筆者は 40 X 人間ミクログリアと多波長セル スコアリングモジュールを使用して脳腫瘍組織におけるマクロファージの分析に最適の設定をします。</li>
	<li>プレート-Slidescanningおよび編集プレート下部の設定... ] タブと同じ A の設定は、すべての設定を確認 (手順 2 を参照してください)。</li>
	<li>得られる画像が鮮明ではなく、フォーカスを調整する井戸の深さ、プレートの高さ、およびプレートの下の設定を変更します。フォーカスの問題はまだ、オート フォーカス オプション] セクションの下でイメージの回復とレーザーを選択します。</li>
	<li>集録ループ] タブで、[、サンプルで現在の波長の数を入力します。レーザー ベースの焦点を有効にして、イメージ ベースの (買収またはレーザー回復) の焦点を有効にするオプションを確認します。</li>
	<li>[オート フォーカス] タブ [プレートと下部にもフォーカスを選択します。</li>
	<li>仕訳帳] タブで、図 2も選択できないようにする非同期ハードウェアに移動を確実に記載されているオプションを選択します。</li>
	<li>B. 設定としてこの設定を保存します。</li>
</ol>4. 広視野高コンテンツ分析システムでスライドを配置します。
<ol><li>メイン メニューを表示f4 キーを押します。スライドのスキャンを選択します。オープンドア-取り出しスライドをクリックし、(図 3 a と 3 b) WHCAS スライドとスライド アダプター (が最大 3 つのスライドを保持できる) に挿入します。下向き coverslip スライド アダプター (図 3 a) の切り込み側にラベルとスライドを向き。 注: この実験で使用するスライドは、1 mm スライド x 75 x 標準 25 でした。</li>
	<li>ドアを閉じる-スライドをロードするをクリックします。</li>
</ol>5. プレビュー スキャンを取得
<ol><li>スクリーニングの見出しの下プレート集録/制御.とプレートの取得設定を選択し、設定 A に読み込む</li>
	<li>訪問する井戸タブの下も含むサンプルでは、マウスの右ボタンを使用して移動します。訪問するサイトタブの下には、セルがあるまでライブ画像キャプチャと別のサイトに移動します。手動でサンプルに焦点を当てるか、オート フォーカスを使用します。スナップを使用して、イメージをキャプチャします。 注: このサンプルは、詳細サイトやフィッティングもサイトで検索が容易に (手順 2.3 を参照してください)。</li>
	<li>メイン メニューのスライドのプレビューを選択します。</li>
	<li>自動的にポップアップ表示されるダイアログ ボックスでスキャンしようとしているどのように多くのスライドを反映してオプションを選択します。一度に 1 つのスライドをスキャンします。[Ok]を押します。倍率として 4 X を選択します。[Ok]を押します。スライドの向きを (使用する補正カラー別 coverslip の厚さが使用される場合) としてCoverslip (0.17 mm) ダウンを選択します。[Ok]を押します。続行をクリックします。 注: ユーザーが 2 以上のスライドのプレビュー スキャンを取得しようとすると、各プレビュー スキャンは、個別に対応する高倍率の画像の獲得の前に開きます。</li>
	<li>[ロード スキャン スライド設定]取得の設定、キャリブレーションのボックスがチェックされますを確認します。ボタンを押してキャンセルします。スライド設定のスキャンボックスが再び表示される場合は、続行を選択します。</li>
	<li>スライドをスキャン] ダイアログ ボックスが表示されたら、図 4 a-4 Cで推奨されている設定を調整します。閉じる終了を選択します。 注: は、低いデジタル解像度、ダイナミック レンジ、それぞれ、それ故に減少の画質とはいえ高速スキャンになりますカメラのビニングとカメラの露光時間の減少を増加します。シェーディング補正は単一の視野間一様な強度を保ちます。スキャンは、フォーカス、走査速度が低下、ハードウェアとイメージのオート フォーカス オンされますを確認します。時間を節約、低倍率のスキャンを取得しながら陰影補正とハードウェアとオフ画像のオート フォーカスを持っているが、これらのオプションを持っているオン手順 6 の高倍率画像の中にそれをお勧めします。低倍率のスキャンの解像度は、高倍率のスキャンの解像度には影響を与えません。</li>
	<li>スライドのスキャニング データ用のディレクトリを選択します。[Ok]をクリックします。ファイルの名前を入力します。[Ok]をクリックします。</li>
	<li>描画領域] ダイアログ ボックスが自動的に表示されます。図 5 bに示すように、全体のプレビューのスキャン領域を選択するには、矩形ツール (図 5 a) を使用します。続行をクリックします。</li>
	<li>[セットアップの完了] ダイアログ ボックスが表示されます。続行を選択します。 注: プレビュー スライドのスキャンを開始します。</li>
	<li>プレビューを完了すると、スキャン完了のダイアログ ボックスが表示されます。続行を選択します。プレビュー スキャン ウィンドウは閉じないで (この例では、 DAPI スキャンウィンドウは図 6を参照)。 注: セットアップと低倍率スキャン習得過程約 20 分になります。後続の高倍率画像の取込時間は各チャンネルの露出度だけでなく、選択したサイトの数によって異なります。</li>
</ol>6. 高倍率のスキャン
<ol><li>B. の設定をロードします。</li>
	<li>イメージを作成する井戸を決定します。訪問する井戸タブの下も含むサンプルでは、マウスの右ボタンを使用して移動します。 注:、技術がよく 1 をイメージングによって実証ここ。</li>
	<li>訪問するサイトのタブの下には、細胞や組織があるまでLiveの機能を持つ別のサイトに移動します。手動でサンプルに焦点を当てるか、オート フォーカスを使用します。スナップを使用して、イメージをキャプチャします。 注: 高倍率でサンプルを見つけるを支援するためには、どこでも 5 からオート フォーカスできない場合は、サンプルを見つけるの 100 μ m のステップ サイズ調整するのにプレート集録/制御ダイアログを使用します。</li>
	<li>W1 DAPI ] タブで、[自動公開をクリックします。鮮明なプレート取得スナップ - DAPIイメージを確認します。</li>
	<li>メイン メニューで、[ジャーナルプルダウン ・ メニューを明らかにするためにクリックします。ジャーナル. を実行を選択します。</li>
	<li>それを起動してスライド領域取得セットアップジャーナルをダブルクリックします。セットアップのスライド領域の取得] ダイアログ ボックスが表示されたら、続行を選択します。</li>
	<li>指示されると、正しく、 DAPI スキャン低倍率スライド イメージを選択するを選択します。[Ok]を押します。同様に、強調表示プレート取得スナップ - DAPI プレート取得スナップを求められたとき。[Ok]をクリックします。</li>
	<li>作成またはロード領域ボックスが表示されたら、DAPI スキャン (図 6) 利息の (a) の地域を選択するのに四角形領域ツールを使用します。続行を押します。 注: 40 X で選択できる最大面積は、45 列、35 行です。興味の複数の領域を選択すると、最大領域] ボックスに領域のサイズが変更されます。サイズ変更後は、ボックスの位置を変更できます。</li>
	<li>負荷領域] ダイアログ ボックスでいいえを選択します。 注: 選択はい負荷以前に保存したスライドのバッチのための領域の興味の場所の同じ地域。</li>
	<li>検索ツールを使用すると、関心の最大領域をハイライトし、 [領域の選択] ダイアログ ボックスで続行を押します。領域の確認ボックスが表示されたら、続行を選択します。保存領域] ダイアログ ボックスが表示されたら保存する領域が必要かどうかを決定します。</li>
	<li>サイトの間隔、次のダイアログ ボックスでは、タイル重複、または10% の重複なしでイメージで結果を選択することができます。オプションを選択し、 [ok]をクリックします。著者は、タイルを選んだ。</li>
	<li>3 つのダイアログ ボックスが今すぐ表示されます。セットアップの完了ボックスは、続行を押すことで閉じることができます。40 X の取得サイトのセットアップボックス (図 7 a) を開いたまま今のところ明確などのように多くの列になりますので行プレート取得セットアップボックス (図 7 b) に入力する必要があります。WellPositionsボックス (図 7) が表示されたら左下隅で開いたまま、イメージングの持続期間のため。</li>
	<li>訪問する井戸、下のプレート取得セットアップボックスで以前に選択した関心領域と同数の井戸がある必要があります (図 7) を強調表示します。 注: スライドあたりの金利の 9 つの地域の最大のこのプロトコルを開発しました。場合はより多くがある、関心領域の数を反映するプレート - SlideScanningタブに列または行の数を増やします。これらの井戸が空間的任意の方法で関心領域の場所を表さないが、適切な数は、強調表示されている (左クリック) をする必要があります。</li>
	<li>プレート取得設定ボックスで訪問するサイト] タブに移動は、提示された列と行 (図 7 b) を入力します。タイルのサイト上をクリックしてください。</li>
	<li>サンプルが含まれているサイトを見つけることの当て推量を排除するために事前に選択した関心領域にステージを配置する[概要] タブの下でプレートの取得を押します。カメラをパン細胞を含むサイトを一度、画像の取得を停止するには、右下隅でキャンセルを押します。舞台は現在を確認、サンプル上に位置します。</li>
	<li>重点的と高ダイナミック レンジ画像が得られることを確保するための波長設定を最適化します。問題がなければ、[概要] タブとプレートの取得をクリックします。</li>
</ol>7. 画像解析
<ol><li>目的のカスタム モジュールを選択します。 注: 著者は、脳腫瘍のスライドの自動セグメンテーションを実証する多波長セル スコアリングモジュールを選んだ。</li>
	<li>すべてのサイトの分析を実行します。解析パラメーターは、多くのスライドのため同じです、プレート取得セットアップボックス [投稿買収] タブで分析が囲めます。</li>
	<li>分析が完了すると、結果をバイアスしないように画質の悪さのすべてのサイトを除外します。この分析の目的は小グリア細胞および腫瘍細胞のマクロファージを定量化するため、腫瘍サンプルのエッジに関心の領域を選択します。さらに、焦点がずれているおよび/または組織のひだまたは泡およびティッシュで涙を含むサイトを除外します。デモンストレーションでは、代表の結果を参照してください。また、どのサイトが除外される以下のしきい値としてレーザー反射の振幅によってサイトごとに生成されるレーザー フォーカス スコアを使用して (しきい値は、カスタマイズと露光時間などのパラメーターによって異なります、使用するメディアの種類)。 メモ: 高倍率画像ください必要に応じて具体的には大きな血管や壊死の領域などの構造を除外すること。また、hypercellular などの関心のある分野だけを含めることが可能です。このように、特異性、分析の精度を向上できます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hua, Y., Shun, T. Y., Strock, C. J., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+positional+biosensor+screening+assay+for+compounds+to+prevent+or+disrupt+androgen+receptor+and+transcriptional+intermediary+factor+2+protein-protein+interactions.">High-content positional biosensor screening assay for compounds to prevent or disrupt androgen receptor and transcriptional intermediary factor 2 protein-protein interactions.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (7), 395-418 (2014).</li><li>Rishal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WIS-NeuroMath+enables+versatile+high+throughput+analyses+of+neuronal+processes.">WIS-NeuroMath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes.</a> Developmental Neurobiology. 73 (3), 247-256 (2013).</li><li>Kanungo, J., Lantz, S., Paule, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+changes+in+axon+length+using+transgenic+zebrafish+embryos.">In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos.</a> Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 618-623 (2011).</li><li>Schurmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+illumina+gene+expression+microarray+data+from+different+tissues:+methodological+aspects+of+data+analysis+in+the+MetaXpress+Consortium.">Analyzing illumina gene expression microarray data from different tissues: methodological aspects of data analysis in the MetaXpress Consortium.</a> PLoS ONE. 7 (12), e50938 (2012).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e1900 (2010).</li><li>Bravo-San Pedro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantification+of+GFP-LC3++dots+by+automated+fluorescence+microscopy.">High-throughput quantification of GFP-LC3+ dots by automated fluorescence microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 71-86 (2017).</li><li>Varga, V. 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C., Ankeny, D. P., van Rooijen, N., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+method+for+quantifying+macrophages+in+different+experimental+models+of+central+nervous+system+pathology.">An efficient and reproducible method for quantifying macrophages in different experimental models of central nervous system pathology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 181 (1), 36-44 (2009).</li><li>Kozlowski, C., Weimer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+method+to+quantify+microglia+morphology+and+application+to+monitor+activation+state+longitudinally+in+vivo.">An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31814 (2012).</li><li>Fish, K. N., Sweet, R. A., Deo, A. J., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+segmentation+methodology+for+quantifying+immunoreactive+puncta+number+and+fluorescence+intensity+in+tissue+sections.">An automated segmentation methodology for quantifying immunoreactive puncta number and fluorescence intensity in tissue sections.</a> Brain Research. 1240, 62-72 (2008).</li><li>Zock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+high+content+screening+in+life+science+research.">Applications of high content screening in life science research.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 12 (9), 870-876 (2009).</li></ol>

著者は、本稿に記載されている製品の金銭的な利益と開示する他の何もあります。

生物科学の研究の効率を妨げる共通の問題まだ蛍光標識した組織の公平な正確なそして正確な定量化とその構造内のプロトコルの開発であります。時間と労力のかなりの量は、彼らのイメージが作成された後、組織スライドを分析する方法を見つけるし向けています。多くの既存メソッドは、ユーザーがプログラム12,13,14内を再作成するためのアルゴリズムを提供します。これらのメソッドは受け入れられる, しかし、この報告書の意義は、簡単かつ迅速に確立包括的な画像の獲得および分析のプロトコル、ユーザーは、WHCAS へのアクセスを持っている場合することができます。たとえば、細胞の種類を区別し、複数の構造とプロセス、細胞周期解析、核移行を定量化の試金は関連するソフトウェアで利用可能な既に。
セットアップには、いくつかの重要な手順が含まれます。まず、スライドの空間パラメーターは、プレートであるかのように定義されます。第二に、高倍率のイメージングのための関心領域の選択元となる低倍率の概要スキャンが作成されます。最後に、精度と解析の精度に影響を与えるサイトは除外されます。この技法の最大の制限は、適用性に依存しているかどうか、ユーザーは、WHCAS へのアクセスです。ただし、ハイコン テント分析システムの増加する必要性とでは、競争力のある15のままに自分の研究者にこれらの多くの機関を提供します。トラブルシューティングが必要最もよくティッシュ セクションは同じ厚さを持っていないときです。興味の複数の領域が選択されている場合いくつか焦点になります一方、他の人はしません。理想的には、断面、中にユーザーを取る気になる同質なサンプルを作成します。ただし、サンプルの整合性がない場合関心ごとアウト フォーカス領域とビューの各フィールド フォーカスするために使用、核染色波長 (またはユーザーの最も明るい蛍光) にフォーカスが調整できます。他の波長は単に核染色の波長からオフセット、区画整理この波長だけ必要があります。
このレポートでは、スキャンおよび WHCAS と関連付けられているソフトウェアを使用してスライドを分析する方法を詳しく説明します。多波長セル スコアリング モジュールでは、蛍光ラベル付けされているすべての核、細胞質マーカーを自動的にカウントすることができます。フォーカス設定を調整し、幅や組織のイメージを作成するモジュールをカスタマイズするエリアなど携帯電話の特性を定義した後にさらにイメージ化されたスライドと定量的データを取得するユーザーの介入の必要性があります。最大 3 つのスライドのイメージを作成時に、興味の複数の領域を定義することができます。このプロトコルではスライドを分析する必要がある WHCAS ユーザーを活用、カスタマイズ可能な多目的、自動ワークフローには少しの最適化を必要とし、将来的に組織の組織学的解析を含むすべてのプロジェクトで適用できます。

スライドに蛍光標識した組織の正確かつ正確な定量は多くの科学分野で非常に人気の技術です。ただし、研究者は多くの場合手動で標本をカウントまたはこれを達成するために密教の自動化された技術の開発にかなりの時間を過ごします。ここで、自動スライドのスキャニングと、WHCAS とその関連のソフトウェアを用いた例として冷凍人間の脳腫瘍のセクションの自然免疫系細胞の細胞の定量のためのプロトコルを提供します。関連ソフトウェアは、神経突起伸長細胞型1,2,3,4,5,の分化にカウントから組み込みカスタマイズ可能なモジュールの広い範囲を提供しています6。 このメソッドの目標の画像を取得し、任意のスライド マウントの組織内のエンティティの蛍光標識を量的に表わす開始から終了まで、簡単に再現できるプロトコルを研究者に提供することです。
このプロトコルでは、WHCAS は、イメージング関連ソフトウェアのそれに続く分析のためプレート スライド アダプターと基本スライド スキャン7利用可能であったにもかかわらずに用いられます。製品担当者と連絡を合わせた loadouts を作成、適切な仕訳帳の選択取得面積の注意空間キャリブレーションが必要なのでイメージのスライドに法外だった。専用スライド画像や分析装置8、購入の代わりに、文献の広いボディでは、このソフトウェアへのアクセスを以前の技術レポートは WHCAS 全体で9のスライド画像の獲得を回避しました。画像集録や画像解析を実行する異なるプラットフォーム上には、それぞれが他と互換性があることを確認する追加の作業が必要となります。
イメージをキャプチャする、WHCAS とそのソフトウェアを使用する能力は、検索またはこれらのツールをワークフロー エイリアンの開発の不必要な合併症を避けるでしょう。この記事で、プレートとしてスライドを扱うことで低倍率の概要スキャンおよび対応する高倍率画像の作成に必要な手順と多波長セル得点セグメンテーション モジュールを使用して以降の解析を可能にする、WHCAS の転用。WHCAS で画像を集録したら、アルゴリズムまたはマルチ ステップ カウント プロトコル10,11を開発する必要性がないために、この容易に利用可能なプロトコルは代替技術上の優位性を提供します。このプロトコルは定量法の最適化に必要な時間を軽減より正確な12と手動カウントよりも効率的、WHCAS を最大限に利用し。画像とスライドに蛍光標識したティッシュの分析が可能になります、このプロトコルを広く簡単に使用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1640">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">ImageXpress MicroXLS</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td style="width:1087px;">Apparatus for image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">MetaXpress 5.1</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Slide adapter</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide_Region_Acquisition_revA.jzp</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&#38;highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:108px;">NA</td>
			<td>Select this journal in Step 6.6.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated slide scanning and segmentation in fluorescently-labeled tissues using a widefield high-content analysis system

自動スライドのスキャニング、蛍光標識した組織の分割全体スライドや大きなティッシュ セクションを分析する最も効率的な方法です。残念ながら、多くの研究者は、大量の時間とリソースの開発と独自の実験には、ワークフローの最適化を過ごします。この記事に関連するソフトウェアは、あらかじめ構築されたモジュール内でカスタマイズするためのオプションと、スライド マウントする任意の組織をイメージする広視野高内容分析システム (WHCAS) へのアクセスとのそれらによって使用できるプロトコルについて述べる.本来意図しないスライドをスキャンするため、この資料で説明されている手順は、関連ソフトウェアにインポートすることができます WHCAS のイメージをスキャンするスライドを得ることが可能。この例では、脳腫瘍のスライドの自動セグメンテーションを示したが、蛍光標識した核や細胞質マーカーの自動セグメンテーションが可能です。さらに、蛋白質のローカリゼーション/転置、細胞の増殖・生存率/アポトーシス、および実行することができます血管新生アッセイを含む他の定量的なソフトウェア モジュールのさまざまながあります。この手法は研究者の時間と労力を節約、スライド分析の自動化されたプロトコルを作成します。

WHCAS ソフトウェア内で画像を表示できます。図 8には、関心の特定の領域内のすべてのサイトの高倍率のサムネイルが表示されます。(例図 8 図 9、低、高倍率でそれぞれ) 解析から除外すべきものを識別するために各サイトを確認してください。たとえば、サイト 149 が合って (図 9 a)、サイト 219 は泡 (図 9 b) およびサイト 54 倍 (図 9) を含む、除外する必要があります。イメージを作成するすべてのサイトの 10-15% を除外するが一般的です。例では、サイトの 15.3% を除外した (25/300 いた泡、17/300 が合っていた、3/300 が折り畳まれた, し、1/300 の端にあった)。図 10 aは、分析 (対応する低倍率サムネイルは図 8に示す) 代表的なイメージです。多波長セル スコアリング モジュールによって生成された対応するオーバーレイが著者の仕様に合わせてカスタマイズ サイト 59 に対して自動分割の結果を示すここでは、(核最小幅 2.5 μ m、最大幅を = = 7.5 μ m上記のローカル背景強度 = 35 graylevels;CD11b 陽性細胞の最小幅 4 μ m、最大幅を = = 18 μ m、最小すすけるエリア = 15 μ m2、上記のローカル背景強度 = 310 graylevels;CD45 陽性細胞の最小幅 4 μ m、最大幅を = = 18 μ m、最小すすけるエリア = 15 μ m2、上記のローカル背景強度 50 graylevels を =)。次の分割、各マーカー陽性細胞の割合の定量的データ (6.2 ± 5.1% と cd11b 3.8 ± 2.1%+と CD45+の細胞は、それぞれ)、両方のマーカー (3.5 ± 2.1 %cd11b+CD45+細胞)、マーカーなし (86.6 ± 9.0 %cd11b-CD45-細胞;図 10 b) 平均すすけるエリア (40.0 ± 9.2 μ m と cd11b 36.7 ± 7.6 μ m+と CD45+の細胞は、それぞれ;図 10) と蛍光強度を意味 (408.9 ± 40.3 相対蛍光ユニットと cd11b 373.9 ± 38.1 相対蛍光ユニット+と CD45+の細胞は、それぞれ;図 10)得られます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig1.jpg"> 図 1: スライドを習得する低倍率の設定。A. このイメージ プレートの設定が表示されます。B. プレート下の設定が表示されますここでは。<a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig2.jpg"> 図 2: スライドを習得する高倍率の設定します。この図には、適切なジャーナルの選択が表示されます。<a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig3.jpg"> 図 3: スライド アダプターを使用してスライドをロードする方法のデモです。A. スライド、coverslip のダウン スライド アダプター ノッチ側面のラベルと配置されています。B. スライド アダプターは広視野高内容分析システムに読み込まれます。<a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig4.jpg"> 図 4: スライドのプレビュー設定します。A。 この図は、買収のパラメーターを表示します。B。 ここでは、Hoescht/DAPI 波長設定の値が表示されます。Cします。 このイメージは、ジャーナルの設定を示しています。<a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig5.jpg"> 図 5: スライドの領域を描画します。A. 矩形ツール (他の描画ツールを使用することはできません) プレビューのスキャン領域を選択し、DAPI スキャンに関心の領域を作成するために使用します。B。 この図ではティール概要 (ラベルを含む) スライドの全体の区域の選択方法を示しています。<a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig6.jpg"> 図 6: プレビュー スキャンの関心領域を作成します。プレビューまたは DAPI スキャンは、スライド領域全体を表します。この例では、3 つのシリアル脳切片 (固体白い長方形輪郭) があります。これらのセクションの上の領域では、スライドに円形のラベルを表します。別のセクション アレンジない関心領域の後続の選択が制限されます。この例では関心領域が白い四角形の点線で表示されます。縮尺記号 = 1 mm.<a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig7.jpg"> 図 7: 高倍率の重要な windows イメージ取得します。A. 興味の地域の内で、どのように多くの列と行の取得サイトのセットアップ ウィンドウが表示されます。B. 正しい列数を確保・ プレート取得セットアップ ボックスに図 7 aに示されている行を入力し、サイトが並べて表示します。C. にもかかわらず、それは空白 WellPositions ウィンドウを画像集録時間を開いたままする必要があります。D. 関心領域の適切な数を強調する必要があります。<a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig8.jpg"> 図 8: 関心領域の代表的なイメージです。各サイトは、関心領域の複合サムネイルに表示することができます。(赤いボックスでマーク) 除外されている代表的なサイトと (緑のボックスでマーク) 含まれているサイトの例より高い倍率で表示されます。それは分析のための十分な品質を確保するためサイトをそれぞれ確認することをお勧めします。縮尺記号 = 1 mm.<a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig9.jpg"> 図 9: 事例分析から除外する必要がありますサイトです。A. 人間の脳腫瘍のセクションは CD11b (緑) と CD45 (赤)、小グリア細胞および大食細胞のマーカー染色されています。このイメージは、焦点が合っていない、分析から除外されています。B. 泡がある最終的な分析から除外されているこの画像。C。このサイトは、組織の倍のため解析から除外されました。スケール バーは、20 μ m<a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57440/57440fig10.jpg"> 図 10: 代表的な画像と解析します。A. 自動分割の結果を表すオーバーレイの横に各画像が表示されます。オーバーレイでは、核が白色で表示され、積極的に陽性細胞は CD45 の CD11b と赤の緑色で表示されます。不十分な質のサイトを解析から除くと残りすべてのサイト、 Bの結果を組み合わせること。各マーカーに陽性、両方のマーカーは、 Cというラベルの付いた共同各サイト内のセルの合計数の割合の平均値です。平均染色領域、およびD.平均セル強度は視覚的に表されます。RFU 相対蛍光ユニットを =。データは、平均 ± 標準偏差で表されます。スケール バーは、20 μ m<a href="/files/ftp_upload/57440/57440fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。

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Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

ここで広視野高内容分析システム (WHCAS) を使用してスライドに蛍光に分類された組織の自動抽出のためのプロトコルについて述べる。このプロトコルでは、生物科学、医用工学、健康科学など生体内蛍光マーカーの定量を含む任意のフィールドで幅広い用途があります。

自動スライド スキャンと広視野高コンテンツ分析システムを利用した蛍光標識した生体のセグメンテーション

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.1K ビュー.  University of Calgary. ここで広視野高内容分析システム (WHCAS) を使用してスライドに蛍光に分類された組織の自動抽出のためのプロトコルについて述べる。このプロトコルでは、生物科学、医用工学、健康科学など生体内蛍光マーカーの定量を含む任意のフィールドで幅広い用途があります。

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Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

ナイフエッジスキャン顕微鏡用試料作製、イメージング、および解析プロトコル

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

生物工学

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

の体系的な分析<em&gt;体外</emマルチウェルプレートマイクロ流体システムを使用して&gt;セルローリング

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

シングルセルおよび3D閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of nanometer-scale features. Historically, a major drawback of scanning probe lithography has been the intrinsically low throughput of single probe systems. This has been tackled by the use of arrays of multiple probes to enable increased nanolithography throughput. In order to implement such parallelized nanolithography, the accurate alignment of probe arrays with the substrate surface is vital, so that all probes make contact with the surface simultaneously when lithographic patterning begins. This protocol describes the utilization of polymer pen lithography to produce nanometer-scale features over centimeter-sized areas, facilitated by the use of an algorithm for the rapid, accurate, and automated alignment of probe arrays. Here, nanolithography of thiols on gold substrates demonstrates the generation of features with high uniformity. These patterns are then functionalized with fibronectin for use in the context of surface-directed cell morphology studies.

Here we present a protocol for wide-area scanning probe nanolithography enabled by the iterative alignment of probe arrays, as well as the utilization of lithographic patterns for cell-surface interaction studies.

広域走査型プローブ ナノリソグラフィ自動配置と細胞培養研究用基板作製への応用

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

広視野蛍光顕微鏡を用いたメカノバイオロジー研究の柔らかいシリコーン基板の剛性測定

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, including Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Here, we will describe how the system can be used to study the growth kinetics and the morphological properties such as the surface roughness and textural entropy of P. aeruginosa strain PA01 that expresses an enhanced green fluorescent protein (PA01-EGFP). A detailed protocol will describe how to grow and seed PA01-EGFP cultures, how to set up the microscope and autorun, and conduct the image analysis to determine growth rate and morphological properties using a variety of shear forces that are controlled by the microfluidic device. This article will provide a detailed description of a technique to improve the study of PA01-EGFP biofilms which eventually can be applied towards other strains of bacteria, fungi, or algae biofilms using the microfluidic platform.

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Here, we describe the use of a higher-throughput microfluidic bioreactor coupled with a fluorescent microscope for the analysis of shear stress effects on Pseudomonas aeruginosa biofilms expressing green fluorescent proteins, including instrument set up, the determination of biofilm coverage, growth rate, and morphological properties.

緑膿菌自動の高スループット マイクロ流体システムを使用して上のせん断応力のライブ細胞解析

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

自動化された微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

生体組織の刺激のための電界・磁場装置

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

自動スライド スキャンと広視野高コンテンツ分析システムを利用した蛍光標識した生体のセグメンテーション

自動スライドスキャンと広視野高コンテンツ分析システムを利用した蛍光標識した生体のセグメンテーション