私たちは、博士からのディスカッション、指導·支援に感謝しています。マイケルAndreeff氏医学博士。、そしてジャレッドバークス博士号。 MDアンダーソンフローサイトメトリーおよび細胞イメージング基盤施設から。この作品は、FCMのための国立がん研究所（RC1-CA146381、CA-083639、R01NS06994、CA116199およびCA109451からの助成金によって部分的にサポートされていました。ELSも国防軍学科（BC083397）でサポートされています。

同系マウス骨髄移植（BMT）は、制度的IACUCプロトコルによって承認された（ 注：このプロトコルの成功は、マルチスペクトル解析の対象として任意の標識細胞タイプ（S）の利用を必要とし、下流の分析を容易にするためには、任意の遺伝性を利用することができますまたは安定な細胞性標識我々は任意の細胞、組織、または器官に被移植モデルに適用した研究が有用と認める移植として多くのユニークな標識された集団を含むことができることができることを示唆している。さらに、多標識セルラシステム例えば、ある種の病理学的状態の研究のための移植合併症を排除するように設計され、複数の系統制限された蛍光標識することができる集団を含有するトランスジェニックマウスで見られるもの。 <ol><li>致死的に四時間ドナー骨髄で再構成する前に、9.5 Gyの単回用量のBMTレシピエントマウスに照射される。 （BMT GFPの受信者は、生後6〜10週でな​​ければなりません）。 </li><li>クリッピングし、無菌手術用ハサミで後肢を露出させ、それをバック剥離する前に70％エタノールでマウスの毛皮を濡らす。仙腸関節の腸骨稜を含む足全体を削除します。ちょうど足首の上にカットして足を破棄して、徹底的に骨からすべての筋肉、靭帯、余分な組織を取り除きます。 PBS中の2％滅菌FBS（P​​BS-2）を使用して、23 G針で脛骨、fibiaと腸骨稜からのフラッシュ骨髄。 （BMTのRFPドナーは制度上の基準に従って犠牲にする必要があります。） </li><li>スライスやそっとでは、メスとピンセットを用いてフラグメントに残りの骨を粉砕した後、私は300 rpmで37℃、1時間、3μg/ mlのコラゲナーゼで50ミリリットルコニカルチューブを配置します。 </li><li> PBS-2でチューブの締めくくりと新しいチューブに上清を回収し、フラッシュの細胞と結合します。 4℃で5分間250rpmでのスピンダウン</li><li> PBS-2に細胞を再懸濁し、40 nmのセルフィルタを通して濾過する。この時点で、細胞をfluorescenために標識することができるtは1がBMTのための特定の集団を操作したい場合選別（FACS）細胞を活性化した。 </li><li>マウスあたり100μlのPBSあたり2×10 6の細胞を、再懸濁します。全身尾または眼窩後静脈ベベル側を上向きで照射のGFPレシピエントマウスに注入するために29ゲージ針を使用してください。唯一の生着の対照として100μlのPBSで1マウスを注入する。注射の前に血管を拡張し、注射すると尾静脈注射の拘束を使用するように加熱ランプを使用してください。テールポスト噴射に光圧力を加えるために滅菌ガーゼを用意します。 </li><li>三週間は、BMTを投稿血液眼窩を収集し、GFPの循環細胞の存在およびRFP循環細胞が存在しないことを確認するために、フローサイトメトリーによって分析する。対照マウスは、この時点で死亡しているでしょう。 </li></ol> 2。機関動物実験委員会のガイドラインによると、腫瘍の生着<ol><li>前の生体内注入（1×10 6℃〜in vitroでの ID8卵巣マウス腫瘍細胞を増殖させるマウス当たりのエル）。注射の日、トリプシン処理細胞は、100μLあたり1×10 6個の細胞でPBSにPBSで洗浄し、再懸濁する。 </li><li>マウスのintaperitoneal腔に腫瘍細胞を注入し、針はベベル側を上向きにする必要があります。 70％エタノールで注入視力を滅菌する。 （頭蓋少し雌マウスの腹部乳首の下位集合に外側から内側）腹部の左下または右下の象限に注入、臓器を打つことは避けてください。首筋でつかみ、小指や薬指で尾を保持することによって、マウスを抑制する。マウスは、この手順のためのイソフルランで麻酔することができます。 </li><li>このような軽度の腹部膨満感などの腫瘍の生着の兆候は、明らかであるとき、マウスを生け贄に捧げる。これは4月12日週間にわたって行われます。 </li><li> IPキャビティから物品の腫瘍。空洞内の腫瘍は、臓器の表面および周囲に白い結節のようになります。メスで、腫瘍を除去し、24時間固定し、10％ホルマリン管/瓶内に配置。組織学的P試薬および材料は、パラフィン包埋し、スライドの準備のために容易に入手できない場合は、賠償金は、アウトソースさ病理/組織学コアにすることができます。その後の染色手順のためのスライドガラス上5-8ミクロンスライスにセクション組織。 </li></ol> 3。マルチパラメータ免疫蛍光染色<ol><li>実験に利用され、すべての蛍光プローブのための単一のカラーコントロールスライドを準備します。このシナリオでは、4つの色が使用される。そのため、個々の色のための4つのスライドだけでなく、バ​​ックグラウンドノイズ制御と完全な組み合わせ染色のため、最終的に1スライドの1のスライド。 （合計スライド= 6）全てのスライドを実験変動を最小限にするために同一の方法で並べて処理される。 </li><li> 1時間56℃でパラフィン切片を焼く。 </li><li>洗ったスライドをキシレンに10分を3倍。 </li><li>洗浄を2×5分間、100％エタノール。 </li><li>洗浄1×3分間95％エタノール</li><li> 1X 2 min90％エタノールを洗う。 </li><li> 1X 2 min70％エタノールを洗う。 </li><lI&gt;水洗い1X 2分。ゆっくりと水の10倍の内外染色ラックを浸す。 </li><li>最後の洗浄シリーズの間に、2分（高に対するマイクロ波）の事前沸騰クエン酸ナトリウム緩衝液。 （使用中の抗体によってはトリス-EDTA緩衝液で置き換えることができます） </li><li>クエン酸ナトリウム緩衝液（10％のパワーオンまたは圧力釜中でマイクロ波）で20分間、スライドを沸騰させる。バッファが沸騰したら、電子レンジをオフにして放置します。 </li><li>熱源から外し、スライドを冷却するクエン酸ナトリウム緩衝液中で30分間休ませ。 </li><li> 5分間水中でスライドを洗浄します。 </li><li>マーク·パップペンで腫瘍切片の周囲に、1時間ブロッキングバッファーの2％BSA / 1％FBSマレイン酸を入れた。彼らは、このステップの間に乾燥させないように、個々のスライドを準備します。 </li><li>ブロッキングバッファー中、最適な希釈率で一次抗体を準備します。 （使用中の抗体は、異なる種の全て（またはIgGチェーン変動-EXしている場合：同じ種のIgG2aのVSのIgG1）彼らが中に混合して使用することができるイングルの潜伏期間。抗体種が重複した場合は、インキュベーションは、抗体交差反応を最小限にするために連続して行われなければならない。） </li><li>この時点では、唯一のブロッキングバッファーで2のスライドにしておきます。これら2スライドは染色していないコントロールや核染色コントロールとして機能します。他の単一色のコントロールは、個々の一次抗体と共にインキュベートする。唯一の分析スライドは一次抗体の組み合わせを持つことになります。 </li><li>でスロー回転シェーカー上で水分室ボックスに一次抗体とスライドをインキュベート4℃で一晩（〜16〜20時間）（ 注：4 +蛍光体、連続染色または直接結合を操作する場合は、抗体交差反応を最小限にする必要があるかもしれないすべての抗体をスライドに適用されるまで。このような状況下でのステップ1.16から1.21を繰り返します。） </li><li>そっとシェーカー上、PBST中で10分間（2回）のためのスライドを洗う</li><li>ウォッシュが起こっているが、最終希釈のためにアレクサ488、594と647の二次抗体を調製ブロッキング緩衝液中1:1,000の。 （これらの抗体および希釈液をバッチ間で、時間をかけて蛍光を維持するために、常に4℃で、暗所に保管していることを確認します。） </li><li>単色制御スライド上で、使用される一次抗体の種に一致する単一のアレクサ希釈液を配置。全ての二次抗体は、分析スライド上に配置される。無染色と核染色コントロールスライドは、この手順全体をブロッキングバッファーに残ります。 </li><li>室温で2時間ゆっくりと回転シェーカー上（露光を避けるために、アルミホイルで覆われた）水分室ボックスにインキュベートする。 </li><li>そっとシェーカー上、PBSTで5分間（2回）のためにスライドを洗浄します。光から保護するためにアルミホイルでカバーしています。 </li><li> DAPIのみのスライドと分析スライドに1分間、DAPI（1:10,000）を追加します。光から保護するためにアルミホイルでカバーしています。他のスライドは、洗浄容器内に覆われて残されてもよい。 </li><li> 2 DAPIインキュベートを洗うDAPI染色で他のスライドを汚染しないために、最初の5分の洗浄のための別々の容器内にスライドする。第2の5分間の洗浄のために、スライドは（すべての洗浄は、シェーカー上で行われるべきである）PBSTで組み合わせることができる。光から保護するためにアルミホイルでカバーしています。 </li><li>カバー滑り（蛍光を維持するために、水性マウントメディアと1.5厚）前に水で簡単にディップスライド</li><li>室温暗所で乾燥3時間をしてみましょう。 </li><li>爪硬化剤とカバースリップの端をシールします。 （アセトン、蛍光シグナルを消光可能性があるのマニキュアを使用しないでください）​​。 </li><li>すぐにスライドを分析したり、将来の分析のために4℃で保存する。 </li></ol> 4。マルチスペクトル画像<ol><li>データ収集のためのニュアンスソフトウェアとOLYMPUS X-63正立顕微鏡に（液晶チューナブルフィルタを含む）ニュアンスEXカメラを利用したマルチスペクトル画像を収集。 </li><li>解像度を高めるために、オイル対物レンズを用いて画像を収集する。 </li><li>イニシアLのセットアップは、使用中の各蛍光団のスペクトル範囲を設定することが含まれています。 <ol class="lalpha"><li> 4色の場合： <ol class="lroman"><li> DAPI：420-480nmの</li><li> AF488：490-580nmの</li><li> AF594：590-640nmの</li><li> AF647：650-720nm </li></ol></li></ol></li><li>スペクトル範囲の各々に対して適正な露光時間を得るために分析スライドの初期画像を取る。 </li><li>ソフトウェアは、互いにフルオロフォアの信号対雑音比及びバックグラウンド信号を識別し、分離するために使用することを「スペクトルライブラリー」を作成する。 （ 注：各蛍光色素は、データセットの適切な分析を確実にするために適切な波長曲線とスペクトルライブラリを組み立てるために、独自の単色コントロールスライドを持っている必要があります。例：3蛍光団= 4コントロールスライド、5蛍光団= 6コントロールスライド。）。 <ol><li>最初の画像未染色スライドを 。このスライドは、スペクトル図書館（室）内で指定される背景として、Y&gt; </li><li>画像DAPIのみの第二スライド 。このスライドは、「描く」ツールを使って、DAPI染色された核を示すために使用され、DAPIなどのスペクトルライブラリ内に保存されます。&gt; </li><li>画像AF488のみの第3のスライド 。このスライドは、「描く」ツールを使ってAF488染色した領域を指定するために使用され、AF488などのスペクトルライブラリ内に保存されます。&gt; </li><li>画像AF594のみの第四スライドさせます 。このスライドは、「描く」ツールを使ってAF594染色した領域を指定するために使用され、AF594などのスペクトルライブラリ内に保存されます。&gt; </li><li>画像AF647専用五スライドさせます 。このスライドは、「描く」ツールを使ってAF647染色した領域を指定するために使用され、AF647などのスペクトルライブラリ内に保存されます。&gt; </li><li>それぞれの個々のスペクトル成分の収集に続いて、スペクトルライブラリとプロトコルを保存します。&gt; </li></ol></li><li>スペクトルライブラリが完了したら、顕微鏡での分析スライド上に関心領域を見つけて、画像を保存/収集します。&gt; </li></ol> 5。マルチスペクトル画像の定量分析<ol><li>ソフトウェアに通知用いて取得ニュアンス·イメージの代表品揃えをインポートします。 </li><li>プログラムの指示に従って保存されたスペクトルライブラリを開く</li><li>分析しようとする目的の組織領域を特定します。 （脂肪組織に対して例えば、腫瘍組織）。 </li><li> DAPI染色に基づいて個々の細胞を同定する。細胞質は核の形状に基づいて自動的に定義される。 </li><li>各蛍光パラメータのための選択の蛍光強度の読み出しを選ぶ（ 例えば平均、標準偏差） </li><li>バッチの画像を取得し、提案されたアルゴリズムを使用して、ソフトウェアのプロセスをしてみましょう。 </li><li>画像処理が終了すると、マージ結果ファイル。 </li><li> Excelでの結果（または任意の他の分析ソフトウェアパッケージ）を開き、X-Y軸にお互いに対して2の蛍光強度をプロットします。各蛍光強度は、セルごとに与えられます。二重陽性細胞は、右上の象限に表示されます。ユーザーは、ベースラインの蛍光強度を定義する必要があります。 </li></ol>

<ol>
	<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+the+tumor+microenvironment:+quantitative+assessment+of+adipose-derived+and+bone+marrow-derived+stroma.">Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma.</a> PLoS ONE. 7, e30563 (2012).</li><li>Quintavalla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+mesenchymal+stem+cells+(MSCs)+maintain+multilineage+potential+and+can+be+detected+following+implantation+into+articular+cartilage+defects.">Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects.</a> Biomaterials. 23, 109-119 (2002).</li><li>Sasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+are+recruited+into+wounded+skin+and+contribute+to+wound+repair+by+transdifferentiation+into+multiple+skin+cell+type.">Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type.</a> Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).</li><li>Spaeth, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+transition+to+tumor-associated+fibroblasts+contributes+to+fibrovascular+network+expansion+and+tumor+progression.">Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression.</a> PLoS ONE. 4, e4992 (2009).</li><li>Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neighbors+and+distant+invaders:+Tumor-associated+niche+cells.">Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells.</a> Genes and Development. 22, 559-574 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+molecular+pathways+and+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets.</a> Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).</li><li>Bataille, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+immunofluorescence+on+paraffin-embedded+tissue+sections.">Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).</li><li>van Vlierberghe, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+staining+combining+fluorescence+and+brightfield+microscopy+for+simultaneous+immune+cell+phenotyping+and+localization+in+tumor+tissue+sections.">Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections.</a> Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).</li><li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissue.">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC cell biology. 9, 13 (2008).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+routes+for+transgenesis+of+the+mouse.">New routes for transgenesis of the mouse.</a> Journal of applied. 53, 295-315 (2012).</li></ol>

FCM、CMB、およびELSは開示する競合とは何もない。

ここに、我々は腫瘍微小環境の骨髄由来間質成分を分析するために、多重化された細胞組成物のMIMicc - マルチスペクトル尋問として記述するマルチスペクトルイメージングのアプリケーションを記述し、しかし、この方法論や概念が複雑に構成する他の細胞要素を解読に適用することができこのような創傷治癒反応中または回生組織中に​​見られるような組織。これらの実験において、我...

組織の発生と修復を理解することは、創傷治癒、2,3再生医療、発生生物学および腫瘍生物学に参加して細胞成分の解明にとって重要である。修復の状況下では、多数の細胞型は、血管新生、ECM沈着、増殖および組織再構築を支援するために周囲の微小環境に浸潤する。細胞性因子および表現型マルチパラメータ、局在を同定することができる多重化マーカー、分化状態、調査微小環境内の細胞成分との相互作用に基づいて同定することができる。ここで、我々はマルチスペクトル画像化とスペクトルアンミキシング方法論が続き、この多色·多細胞移植モデルの典型例として、腫瘍発生について説明します。 腫瘍の進行は、A、増殖の増強が含まれるいくつかの買収能力によってマークされている多段階プロセスであり、、ntiapoptotic侵襲及び血管新生特性図4腫瘍の開発は、成長因子、構造マトリックス、血管網および免疫調節を提供するために、周囲の環境中に動員される非腫瘍細胞によって促進される。1,5,6この微小生息域は由来細胞からなる局所、隣接例えば脂肪などの組織、および血管および骨髄由来細胞1と遠隔の供給源。非腫瘍細胞取り込みの程度は、多くの場合、腫瘍の病期/グレードに対応する腫瘍からの需要に依存している。腫瘍微小環境の支援の役割を理解するためには、非腫瘍細胞集団の起源と分化能を理解する必要があります。 このプロトコルは、細胞成分を、骨髄由来の両方の可視化を介して腫瘍の進行の解釈を助けるために設計され、局部組織DERIVされている細胞を編蛍光レポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを利用して、我々は、致死的に照射RFP（赤色蛍光タンパク質）をマウスにGFP（緑色蛍光タンパク質）の骨髄を移植した。成功した骨髄移植に続いて、同系腫瘍細胞株を同所に注射し、4〜8週間のために移植するために許可されています。得られた腫瘍をマウスから切除し、間質の成分を可視化するために免疫蛍光染色（IF）のために処理される。多重マーカーIFはかなりの最適化7-9が含まれ、一般的に使用される技術である、しかし、マルチスペクトル画像/アンミキシング·プラットフォームを使用すると、スペクトルの重なりを持った蛍光マーカーの組み合わせの可能性を向上させます。ここに我々はMIMicc - マルチスペクトルセルラー起源を分析するために染色し、単一のスライド上の腫瘍セクション内の8のマーカーまでを分析するために多重化細胞組成の尋問、細胞分化ST呼ぶ手法を提示のATUと腫瘍微小環境内の構成要素の細胞 - 細胞相互作用。この簡単な例は、抗体を利用した5つ、6つ、またはそれ以上のマーカーまたは細胞内プロモーター駆動の蛍光発現。 表1考慮する適切な種との潜在的な蛍光抗体染色の組み合わせを分析するために、上に展開される可能性を有する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>.2 &mu;m filter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>09-740-35A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>10 ml lure lock </td>
			<td >BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td >Cardinal</td>
			<td>BF305122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>40nm filter</td>
			<td >BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 ml conical tube</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>1495949A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 488-ms1</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 594-Rb</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Alexafluor 647-ch</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>A21449</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSA</td>
			<td >Sigma</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td >Corning</td>
			<td>2940-243</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CRI-Nuance</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dapi</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td >CellGro</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td >Dharmacon</td>
			<td>4004-DV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP-ms1</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>ab38689</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td >Acros</td>
			<td>100-16-7</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Moisture chamber box</td>
			<td >Evergreen</td>
			<td>240-9020-Z10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td >dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nail hardener</td>
			<td >Sally Hansen</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab2601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep L Glut</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Steril PBS</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>14040-182</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td >invitrogen</td>
			<td>252000-56</td>
			<td> </td>
		 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Blocking Buffer	
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>maleic acid</td>
 <td>14.51 g </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>10.95 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOH pellets (to 7.5pH)</td>
 <td>9+g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>250 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. 
	Antigen retrieval buffers:
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>1.21 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.37 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
	*Store at RT for 3 months or at 4 &deg; C for longer
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tri-sodium citrate (dihydrate)</td>
 <td>2.94 g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Distilled water</td>
 <td>1000 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl (adjust pH to 6.0)</td>
 <td>1N</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>0.5 ml</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantitative multispectral analysis following fluorescent tissue transplant for visualization of cell origins, types, and interactions

複雑な組織の発達への複数の細胞要素の寄与を理解する欲求と、そのような多数の組織の再生に関与する細胞型、腫瘍形成、又は脈管形成などを、我々は、腫瘍発生の多色セルラ移植モデルを考案細胞集団は、異なる蛍光着色レポーター遺伝子マウスに由来し、移植された移植された又は現像腫瘍および周囲に注入される。これらの着色次いで、細胞を動員し、腫瘍間質に組み込まれる。定量的に骨髄由来の腫瘍間質細胞を評価するために、我々はIACUCによって承認されたマウスを致死的に照射RFP発現するトランスジェニック全骨髄を発現するGFPを移植した。同所移植したマウスに注射した0ovarian腫瘍移植後6〜8週間を切除し、腫瘍関連を検出するために、骨髄起源（GFP）のマーカーならびに抗体マーカーについて分析したマルチスペクトル画像化技術を使用して、間質。次に、定量的にセルがいるから（元レポーター遺伝子ラベルに基づいて）起動集団、および4、5の非混合する当社の能力として来たラベルかを評価するためにfluoroprobesのマルチスペクトルアンミキシングを使用して、我々が多重細胞組成のMIMicc - マルチスペクトル尋問呼び出す方法論を適応スライドあたりに6個以上のスペクトルは、精度を高めるために細胞系譜や分化に関連する追加の免疫組織化学を追加しました。共局在して多重化された蛍光信号を検出するためのソフトウェアを利用して、腫瘍間質集団は、トレースさ列挙マーカー染色に基づいて特徴付けすることができる。1

我々のトランスジェニックBMTマウスモデルにおいて移植された腫瘍を分析するためにマルチスペクトル画像化技術を使用して、我々は、骨髄起源である腫瘍間質成分を識別することができる。初期BMTは、フローサイトメトリー（ 図1）により、移植後三週間確認された。同所は、BMTの生着確認が最初の腫瘍注射後6週間を切除し、ホルマリンで固定し、次のラベルのない卵巣腫瘍?...

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Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

複雑な組織塊、器官からの腫瘍に、種々の細胞成分から構成されている。我々は、タンパク質の発現に基づいて細胞起源だけでなく、電池特性を解読するスペクトルアンミキシングに続くマルチパラメータ免疫蛍光染色と組み合わせたマルチ蛍光標識トランスジェニックマウスを利用して組織内の細胞の表現型の寄与を明らかにした。

細胞の起源、タイプ、および相互作用の可視化のための蛍光組織移植に続いて定量的マルチスペクトル解析

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.3K ビュー.  MD Anderson Cancer Center. 複雑な組織塊、器官からの腫瘍に、種々の細胞成分から構成されている。我々は、タンパク質の発現に基づいて細胞起源だけでなく、電池特性を解読するスペクトルアンミキシングに続くマルチパラメータ免疫蛍光染色と組み合わせたマルチ蛍光標識トランスジェニックマウスを利用して組織内の細胞の表現型の寄与を明らかにした。 

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Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

定量的な可視化と動的な熱画像を用いた皮膚癌の発見

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

医学

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上<em&gt;のin-situ</em肺組織とのX-gal染色の&gt;灌流<em&gt; lacZを</em&gt;タグ付き腫瘍細胞

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

事後組織から心筋細胞核の分離

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

ネズミ異心臓移植技術

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

人間のてんかん術後皮質組織の多電極アレイ録音

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Murine Kidney Transplant Technique

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique using the donor aorta to form the arterial anastomosis instead of the renal artery was developed and reported in 1993 by Kalina and Mottram 2 with a further advancement coming from the same laboratory in 1999 3. While one can become proficient in this model, a search of the literature reveals that many labs still experience a high proportion of graft loss due to arterial thrombosis. We describe here a technique that was devised in our laboratory that vastly reduces the arterial thrombus reported by others 4,5. This is achieved by forming a heel-and-toe cuff of the donor infra-renal aorta that facilitates a larger anastomosis and straighter blood flow into the kidney.

The goal of this manuscript is to describe the steps required to perform a kidney transplant in a mouse, paying particular attention to the details of the arterial anastomosis.

マウスの腎臓移植​​技術

The first mouse kidney transplant technique was published in 19731 by the Russell laboratory. Although it took some years for other labs to become ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

静脈介在モデル：バイパスグラフト開存を研究するための適切なモデル

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine balloon denudation model, which is comparable with established vessel injury models in large animals. The aorta denudation model with balloon catheters mimics the clinical setting and leads to comparable pathobiological and physiological changes. Briefly, after performing a horizontal incision in the aorta abdominalis, a balloon catheter will be inserted into the vessel, inflated, and introduced retrogradely. Inflation of the balloon will lead to intima injury and overdistension of the vessel. After removing the catheter, the aortic incision will be closed with single stiches. The model shown in this article is reproducible, easy to perform, and can be established quickly and reliably. It is especially suitable for evaluating expensive experimental therapeutic agents, which can be applied in an economical fashion. By using different knockout-mouse strains, the impact of different genes on MH development can be assessed.

This article demonstrates a murine model to study the development of myointimal hyperplasia (MH) after aortic balloon injury.

マウスの腹部大動脈 Myointimal 過形成を誘導するために気球を利用した傷害

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...