Name: preparations and protocols for whole cell patch clamp recording of xenopus laevis tectal neurons
Uploaded: 2018-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
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NIH グラント SBC COBRE 1P20GM121310-01 によってサポートされています。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ワイオミング大学のによって承認されています。電気生理学的記録を含めたすべての処理は、部屋の温度、およそ 23 ° c. で実施されてここで説明したすべてのメソッドは、発達段階 42 と 49 (Neiuwkoop、フェイバーの15によると上演) 間オタマジャクシからの視蓋ニューロンを記録するために最適化されています。
1体内の準備。
<ol><li>タドポールを麻酔します。<ol>
<li>0.01% スタインバーグのソリューションを含む小さなシャーレにタドポール MS-222 約 5 分。 注: MS-222 別名"Tricaine"は一般的な魚と両生類の麻酔です。オタマジャクシは mM でスタインバーグのソリューションで発生します: 0.067 倍 4.9 HEPES 5.8 NaCl、KCl、0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O。</li>
		<li>タドポールは手順 2 に進む前に、深くハイパーカプニア (応答がない、もはや水泳) を確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>解剖記録/料理の床に冠水したシリコーン ブロック麻酔下のオタマジャクシを保護します。<ol>
<li>使い捨て可能な移動のピペットを使用して外部録音ソリューションを含んでいる解剖/記録皿にハイパーカプニアのオタマジャクシを移動 (115 mM nacl、KCl の 2 mM CaCl2の 3 mM、MgCl2の 3 mM、5 mM HEPES、ブドウ糖; の 1 mM の pH 調整 7.25 を使用するには10 N naoh、浸透圧 255 mOsm)。<ol>
<li>自発的な筋肉を最小限に抑えるためのけいれん、アセチルコリン受容体拮抗薬、ツボクラリン (100 μ M) 外部のソリューションに追加します。(通常、これは、外部溶液 10 mL に 10 mM ツボクラリン株式の 100 μ L を追加する 200 μ L ピペットを使用して)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>おたまじゃくし、背側、シリコーン ・ エラストマーの湛水ブロックに固定昆虫ピンを使用する (Sylgard 184 など詳細については表を参照してください、) を解剖皿床に接着されています。 注意: ピンの配置は重要です: 目からそのプロジェクト脳、RGC の求心性軸索を刺しを避けるために十分に尾の両側にそれらを配置し、ちょうど前方視蓋 (図 1A) 脳を入力してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>牛フィレ肉の正中線に沿って脳。<ol>
<li>脳のクリアな視界、滅菌 25 G 針を使用して正中線に沿って表面的な切開することによって脳を覆う皮膚を削除します。</li>
		<li>神経管に針を挿入して (背側) チューブの背の部分 (切断) の床の板がそのまま (図 1B) を残しながらカットがきれいにそのような物を引いてそっと上向きに同じ正中線軸に沿って脳を切り身。 注: 求心性感覚フロア プレートを介して蓋を入力するので、神経管の底板がそのまま残ってことが重要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蓋ニューロンを覆う透明な心室膜を削除します。<ol>
<li>電気生理学のリグに記録皿を移動し、壊れたガラスのピペット チップを使用して蓋ニューロンの細胞体を覆う心室膜を削除します。軽く繊細なタスク ワイパーの間でドラッグすることで先端を破る。</li>
		<li>ピペット ホルダーにピペットをネジし、マニピュレーターを介して視蓋にそれを下げます。</li>
		<li>壊れたピペットを使用して、蓋から心室膜を剥離します。 注: 全体の蓋; から膜を削除する必要はありません。小さなウィンドウは十分で、ニューロンの多くへのアクセスを提供します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パッチ ・ クランプ記録セル全体を取得します。 注意: このポイント前方からのアプローチ Segevらに従ってマウス脳切片からセル全体パッチ クランプ録音実施と同様です。16(図 1C)。</li>
	<li>蓋ニューロン全体フィールド フラッシュ光を網膜上に投影のレスポンスを記録します。<ol>
<li>網膜上に光のフィールド全体のフラッシュに、幼生の目に隣接する光ファイバーを配置します。光ファイバーのもう一方の端を制御できる光の輝度は、可変抵抗器に沿った LED です。アンプのデジタル出力で LED をトリガーします。この方法では、光の強度変化の点滅がすることができます全体のフィールドは、(図 4A) を記録しました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 全脳の準備
<ol><li>1.1 から 1.3 の手順に従います。 注: この準備のための外部のソリューションでツボクラリンの必要はありません。</li>
	<li>脳を分離します。<ol>
<li>後脳 (図 2A) を断つに 25 G 針を使用します。</li>
		<li>タドポールから全脳を分離、そっと尾側吻側方向すべての側面と腹側の結合組織と神経線維を断つことで、脳の下に針を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シリコーン ・ エラストマーのブロックには、脳を保護します。<ol>
<li>一度完全に解放された, 嗅球のいずれかを 1 つピンと後脳 (図 2B) を別のピンを配置することによってシリコーン ・ エラストマーのブロックには、脳を保護します。これの視蓋ニューロンから記録に最適な構成です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>電気生理学のリグに切り裂くスコープから固定された全脳の準備を含んでいる皿を移動します。1.4 の手順で説明するように壊れたガラス ピペットを使用して心室膜を削除します。</li>
	<li>双極刺激電極に配置視交叉 (中脳でそれぞれの眼から軸索路断面どこ) RGC 軸索を直接アクティブにします。<ol>
<li>吻側、および大きい中間心室にほぼ隣接する双極刺激電極を配置します。視交叉は大きい中間室 (図 2B) にすぐに吻側に位置しています。<ol>
<li>優しく下の刺激電極視交叉の上に小さなへこみが組織で形成されるように。バイポーラの電極は、正確に制御するために刺激の強度を可能にするパルス刺激によって駆動されます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Segev et al.による記述で全細胞パッチク ランプ記録 (図 2C) を実行します。16
</li>
</ol>3. 水平脳スライス標本
<ol><li>2.1 から 2.3 の手順に従います。</li>
	<li>消費税 1 つこまの 1 つの側面の最も外側 4 番目 (どの生体内で最も背側の 4 番目に対応) にかみそりの刃を使用します。図 3Aに示すように吻側尾側平面に平行に作られるこのカット。</li>
	<li>再、スライスとシリコーン ・ エラストマーの側に脳をピン側 (つまり、突起や神経は、記録のため直接アクセスできます) 上向きとシリコーンのエラストマー ブロック (図 3 から離れて直面して脳の心室の表面B) (つまり、バイポーラ電極は、視交叉に配置できます)。</li>
	<li>Segev et al.による記述で全細胞パッチク ランプまたはローカルの下に潜在的な記録 (図 3C) を実行します。16
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).</li><li>Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+Order+in+Human+Neurological+Disorder+Using+a+Tadpole.">Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole.</a> Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).</li><li>Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+and+function+of+the+Xenopus+tadpole+retinotectal+circuit.">Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).</li><li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+regulation+of+voltage-gated+intrinsic+currents+in+the+developing+optic+tectum+of+the+Xenopus+tadpole.">Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole.</a> J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).</li><li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+transmission+in+a+developing+visual+circuit.">Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit.</a> J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).</li><li>Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+analysis+of+electrophysiological+diversity+of+Xenopus+visual+neurons+during+development+and+plasticity.">Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity.</a> Elife. 4, 11351 (2015).</li><li>Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visually+driven+regulation+of+intrinsic+neuronal+excitability+improves+stimulus+detection+in+vivo.">Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo.</a> Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).</li><li>Wu, G., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cline+H.T.+of+a+central+glutamatergic+synapse.">Cline H.T. of a central glutamatergic synapse.</a> Science. , 972-976 (1996).</li><li>Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory-evoked+spiking+behavior+emerges+via+an+experience-dependent+plasticity+mechanism.">Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism.</a> Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).</li><li>Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+transcription+of+BDNF+enhances+visual+acuity+during+development.">Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development.</a> Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).</li><li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses.">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).</li><li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+avoidance+in+Xenopus+tadpoles+is+correlated+with+the+maturation+of+visual+responses+in+the+optic+tectum.">Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum.</a> J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li><li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horizontal+brain+slice+preparation:+a+novel+approach+for+visualizing+and+recording+from+all+layers+of+the+tadpole+tectum.">The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum.</a> J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).</li><li>Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Relationships+Impact+Neuronal+Tuning+within+a+Phylogenetically+Ancient+Vertebrate+Brain+Structure.">Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure.</a> Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).</li><li>Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+and+inhibition+in+recurrent+networks+mediate+collision+avoidance+in+Xenopus+tadpoles.">Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles.</a> Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).</li><li>Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+to+see:+patterned+visual+activity+and+the+development+of+visual+function.">Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function.</a> Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).</li><li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+integration+in+mesencephalic+trigeminal+neurons+in+Xenopus+tadpoles.">Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles.</a> J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

この作品に記載されているすべてのメソッドは、発達段階 42 と 49 (Neiuwkoop、フェイバーの15によると上演) 間オタマジャクシからの視蓋ニューロンの記録に最適です。ステージ 42、オタマジャクシが十分に大きく、十分に発達した昆虫ピンは生体内での録音のため、全脳解剖を遂行するための脳の両側に置くことができるようにします。以前の段階、オタマジャクシが...

発達回路は、両生類の視覚系の主要なコンポーネントです。それは、どのプロジェクトの視蓋ニューロンにシナプスとシナプス結合を形成するための軸索の目、Rgc ので構成されます。アフリカツメガエル幼生発達回路は、神経回路形成と機能を研究する人気発達モデルです。強力な実験的モデル1,2,3レンダリングこの幼生の発達回路の多くの属性があります。1 つの主要な属性と、この資料の焦点はからの視蓋ニューロンの生体内や脳全体準備を使用してセル全体パッチ クランプ録音を遂行する能力。電圧と電流クランプの記録モードをサポートしているアンプが備わっています電気生理学リグ、セル全体パッチ クランプ録音が高解像度で特徴付けられるニューロンの電気生理学できます。その結果、発達回路形成の主要な段階間の視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音が開発の詳細かつ包括的理解と本質的な4、5の可塑性を提供しています。,6,7とシナプス8,9,10,11プロパティ。セル全体パッチ クランプ蓋ニューロン録音を組み合わせ、遺伝子またはこれらのニューロンの12、および確立された視覚的回避テスト13を介して視覚的なガイド付き動作を評価する方法への関心の morpholinos を表現する能力を促進する、分子、回路機能と行動間のリンクの id。
セル全体パッチ クランプ録音から得られるデータは不可能遺伝的カルシウム インジケーター、GCaMP6 など新しいイメージング手法を用いた高解像度型カルシウム指示薬を使用することが許可されていますイメージングが重要です。カルシウムのニューロンの大規模な集団全体のダイナミクス、同時には直接またはある明白な方法は、いつつ、デルタの蛍光を測定することにより特定の電気パラメーターを取得でき、電圧に逃げ道はないクランプ測定するニューロン電流-電圧特性。明らかにこれらの 2 つの異なるアプローチ、電気生理学的記録、カルシウム イメージング、非重複の強みを持っている、異なる種類のデータを生成します。したがって、最善の方法は、対処されて特定の実験の質問に依存します。
ここでは、脳全体準備、生体内で製剤を用いたオタマジャクシの視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を獲得する手法について述べるし、新しい変更14 研究室で開発された脳全体準備.代表結果] セクションで、各準備と得ることができるデータの種類の実験の利点を示します。制限と異なる準備として、トラブルシューティングのためのヒントの強みは、ディスカッション セクションに含まれます。

<table><tbody><tr><td>Stemi Stereo 508</td><td>Zeiss</td><td>495009-0006-000&amp;nbsp;</td><td>Dissecting microscope</td></tr><tr><td>MS-222 &quot;Tricane&quot;</td><td>Finquel</td><td>ARF5G</td><td>Amphibian general anesthetic</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Used to prepare Stienberg&#039;s solution and external solution</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Used to prepare Stienberg&#039;s solution and external solution</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-1KG</td><td>Used to prepare Stienberg&#039;s solution and external solution</td></tr><tr><td>Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&amp;bull;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124-500G</td><td>Used to prepare Stienberg&#039;s solution&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Used to prepare Steinberg&#039;s solution</td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>Used to prepare external recording solution</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>J.T. Baker</td><td>2444-01</td><td>Used to prepare external recording solution</td></tr><tr><td>D-glucose Anhydrous</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Used to prepare external recording solution</td></tr><tr><td>Tubocurarine hydrochloride pentahydrate</td><td>Sigma</td><td>T2379</td><td>Nicotinic acetylcholine receptor antagonist</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>0.1mm diameter stainless steel pins</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>761028</td><td>Preweighed monomer and curing agent kit</td></tr><tr><td>Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS4052</td><td>Small petri dishes</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Syringe needles</td></tr><tr><td>1mL Slip Tip Tuberculin Syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Disposable, sterile syringes</td></tr><tr><td>Borosilicate pipette glass</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10HP</td><td>Pulled to desired specifications using pipette pulling machine</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Fabricates micropipettes for electrophysiology recording</td></tr><tr><td>Kimwipes Kimtech wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>Delicate task lint-free wipers</td></tr><tr><td>Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td>Current clamp and voltage clamp headstage</td></tr><tr><td>MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285/T</td><td>Control for headstage on electrophysiology rig</td></tr><tr><td>Fiber-Coupled LED (Green)</td><td>Thorlabs</td><td>M530F2</td><td>Fiber optic cable paired with green LED</td></tr><tr><td>Cluster Bipolar Electrode (25&amp;micro;m diameter)</td><td>FHC</td><td>30207</td><td>Bipolar stimulating electrode</td></tr><tr><td>ISO-Flex Stimulator</td><td>A.M.P.I. (Israel)&amp;nbsp;</td><td>Contact manufacturer</td><td>Flexible stimulus isolator</td></tr><tr><td>Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Amplifier for voltage- and current-clamp recording&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1322A digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-135</td><td>Data acquisition system for electrophysiology recording</td></tr><tr><td>Axio Examiner.A1</td><td>Zeiss</td><td>491404-0001-000&amp;nbsp;</td><td>Microscope for electrophysiology</td></tr><tr><td>Micro-g Lab Table</td><td>TMC</td><td>63-533</td><td>Air table for electrophysiology microscope</td></tr><tr><td>Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit</td><td>Dell</td><td>D06D001</td><td>Computer running electrophysiology software</td></tr><tr><td>c2400 CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>70826-5</td><td>Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging</td></tr><tr><td>7 O&#039;Clock Super Platinum Stainless Razorblades</td><td>Gillette</td><td>CMM01049</td><td>Platinum-coated stainless razor blades</td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Disposable Polyethylene transfer pipets</td></tr></tbody></table>

preparations and protocols for whole cell patch clamp recording of xenopus laevis tectal neurons

アフリカツメガエル幼生発達回路、形成するシナプスの視蓋ニューロンに直接眼での網膜神経節細胞 (Rgc) の構成がどのように神経回路を研究する人気モデル自己組み立てます。全体を遂行する能力パッチ クランプ録音どちらか体内の RGC 誘発の応答を記録しての視蓋ニューロンからの細胞または通常の基になるメカニズムについて高解像度データの大きいボディを生成している全脳製剤を用いた、・異常、回路形成、機能。ここで体内の準備、元全脳の準備を実行する方法について説明より最近の視蓋ニューロンからセル全体パッチ クランプ録音を求める水平脳スライス標本を開発しました。それぞれの準備には、ユニークな実験的利点があります。生体内で準備できますの視蓋ニューロンの目に投影される視覚刺激への直接反応の記録です。脳全体の準備は、高度に制御された方法でアクティブにする RGC 軸索と水平脳スライス標本蓋のすべてのレイヤーにわたってからの録音が可能します。

光誘発電位を記録するには、光のフィールド全体のフラッシュは、個々 の視蓋ニューロン (図 4A) から結果の応答を記録しながら網膜上に投影されます。この特定のプロトコルは両方 (「オン」の応答) をオン、オフに 15 光にニューロンの応答を測定するように設計「オフ応答」を測定するために後で s視蓋ニューロンは通常応答の?...

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Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

アフリカツメガエル幼生の発達回路を勉強するセル全体パッチ ・ クランプ記録の 3 脳剤について述べる。それぞれの準備を独自の特定の利点は、神経回路機能を研究するモデルとしてアフリカツメガエルのオタマジャクシの実験的少ないに貢献します。

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

9.4K ビュー.  University of Wyoming. アフリカツメガエル幼生の発達回路を勉強するセル全体パッチ ・ クランプ記録の 3 脳剤について述べる。それぞれの準備を独自の特定の利点は、神経回路機能を研究するモデルとしてアフリカツメガエルのオタマジャクシの実験的少ないに貢献します。

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Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

生物学

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

精巣上体から分離した一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

発生生物学

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

神経科学

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

一チャネルセル付パッチクランプ法

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Establishing a Whole-Cell Configuration through the Patch Clamp Method

Source: Segev, A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54024">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the whole-cell patch clamp technique in a mouse brain slice. This technique establishes a stable connection between micropipette and neuron membrane, which is further disrupted to establish a whole-cell configuration to study the neuron&#39;s health and physiological responses.

パッチクランプ法による全細胞構成の確立

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Slice ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: A Method to Study Electrical Properties of Neurons

Source: Roy, B., et al. <a href="https://www.jove.com/v/50551/" target="_blank">Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells</a>. J. Vis. Exp. (2013).
This protocol describes a technique called whole-cell patch clamp electrophysiology, which is a method to study electrical properties of Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos.

全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

Source: Roy, B., et al. Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells. J. Vis. Exp. (2013).
This protocol describes a technique called ...

Danio rerio （ゼブラフィッシュ）

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

Source: Tu, H., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54608">Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a whole-cell patch-clamp technique for electrophysiological recording from a flat-mount mouse retina. A thin glass pipette with an electrode is used to approach starburst amacrine cells (SACs) within the retina. After forming a seal, suction is applied to rupture the membrane and form the whole-cell patch-clamp configuration. Finally, the flow of ions through the SAC synaptic receptors is measured using the configuration.

フラットマウントマウス網膜からの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. External and Internal Solutions

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Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

Source: Zhu, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58479">Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セルパッチ・クランプ記録のためのプロトコル

要約

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アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

精巣上体から分離した一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録

赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

一チャネルセル付パッチクランプ法

パッチクランプ法による全細胞構成の確立

全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

フラットマウントマウス網膜からの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

脊髄切片のゼラチノーサニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

要約

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アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

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赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

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イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

一チャネルセル付パッチクランプ法

パッチクランプ法による全細胞構成の確立

全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

フラットマウントマウス網膜からの電気生理学的記録のための全細胞パッチクランプの確立

脊髄切片のゼラチノーサニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セルパッチ・クランプ記録のためのプロトコル