この作品は、JCJCに健康補助金の国立研究所R01 - HL70393およびR01 - NS060706によってサポートされていましたスペンサーT.オリン基金に関する医工学の教授である。

1。卵母細胞へのmRNAの注入<ol><li> 0.05注入- Nanoject IIオートナノリッターインジェクター（ドラモンドサイエンティフィック社、モデル3-000-204）を使用して、 アフリカツメガエルの卵母細胞（ステージV - VI）にin vitroで転写した50 ngのメッセンジャーRNAを。各mRNAのダースの卵母細胞での注入を繰り返します。 </li><li>倍ND - 96ソリューション（96 mMの塩化ナトリウム（NaCl、氏58.44グラム/モル）、2 mMの塩化カリウム（KCl、氏74.56グラム/モル）、1.8 mMの塩化カルシウム（CaCl 2で •2H 2 Oを用いて注入した卵母細胞を洗い流す、氏147.02）、1mMの塩化マグネシウム（MgCl 2の •6H 2 O、ミスター203.31グラム/モル）、5 mMの4 - （2 -ヒドロキシエチル）-1 - piperazineethanesulfonic酸（HEPES、氏238.31グラム/モル）、2.5 mMのピルビン酸ナトリウム（ミスター110.04グラム/モル）、および1xペニシリン - ストレプトマイシン。pH7.6）で、その後2 +の間に18℃で培養プレートとインキュベート中に置いてください。 </li></ol> 2。灌流システムの準備<img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig1.jpg" alt="図1" /> 自動化ValveLink 16灌流システムのイラスト。灌流システムは、灌流チューブを介して、ソリューションの貯水池の灌流液を押し出すために加圧された窒素を使用し、血流の鉛筆、チップに。灌流液の各ストリームの流れは、1つのタンクのバルブの一電子バルブによって制御されます。このプロトコルでは、貯水池の一つは、廃棄物の収集だけでなく、圧力放出機構として加圧や機能ではありません。 （写真は、ベンダーのWebサイトのhttp://www.autom8.comから適応） <ol><li>灌流の鉛筆にチューブを接続します。電磁弁コントローラをオンにして、電磁弁を開きます。 </li><li>チューブと灌流の鉛筆が目詰まりして気泡のないことを保証するために、脱イオン水で満たされた注射器を用いて各チューブを脱イオン水（DI）を押してください。 </li><li>ソリューションの貯水池にチューブを接続し、加圧された窒素を適用するにはガスボンベのバルブを開きます。 </li><li>リザーバー溶液とチューブを埋めるためにタンクのバルブを開きます。必要に応じて、溶液中の気泡を除去するためにタンクのバルブをはじく。チューブが液で満たされた後バルブを閉じます。 </li><li>水で灌流チップを記入し、血流の鉛筆にそれをねじ込む。先端を接続するときに気泡をトラップしないように注意してください。 </li><li>粘土を使ってバスのステージへの血流の鉛筆を修正。灌流チップは、バスのスペースになっていることを確認します。灌流システムは、現在設定されています。 </li><li>お風呂にDI水を追加。灌流先端が水中にされていることを確認します。 </li><li>それぞれの灌流液が正しく灌流の先端から出ることをテスト。廃棄物のコレクターのチューブに接続された電子バルブを閉じ、一度に灌流液（140 mMの水酸化カリウム（KOH、バルブを開いてM rは 56.1グラム/モル）、20mMの4 - （2 -ヒドロキシエチル）-1 - piperazineethanesulfonic酸（HEPES、M rは 238.31グラム/モル）、2 mMの塩化カリウム（KCl、M rは 74.56グラム/モル）、1mMのエチレングリコール-ビス（2 - aminoethylether）- N、N、N&#39;、N&#39; -四酢酸（EGTA、M rは 380.35グラム/モル）、pHはメタンスルホン酸（メソ3、M rは 96.1グラム/モル）が7.1から7.2に調整され、 カルシウム 、必要なときに+またはMg 2 +を所望の濃度に追加されます）。顕微鏡下で、血流の先端から出てくる灌流液の噴出を観察。灌流液用バルブを閉じて、廃棄物のコレクターのためのバルブを開きます。血流のジェットはほぼ消えるはずです。すべての灌流液で同じテストを繰り返します。 </li><li> （2 -ヒドロキシエチル）-1 - piperazineethanesulfonic -あなたが正しく、すべての灌流液の流れを確認したら、浴溶液（140 mMの水酸化カリウム（KOH、M rは 56.1グラム/モル）、20mMの4に風呂にDI水を交換してください酸（HEPES、M rは 238.31グラム/モル）、2 mMの塩化カリウム（KCl、M rは 74.56グラム/モル）、pHをメタンスルホン酸（メソ3、M rは 96.1グラム/モル））によって7.1から7.2に調整されます。 </li></ol> 3。パッチクランプ法<ol><li>各パッチクランプセッションの前に再塗装塩化銀と銀の記録電極。最初に、ピペットホルダーと水没から少なくとも15分間は新鮮な漂白剤の入ったバイアルに、電極ワイヤの先端の半分を電極線を取り外します。これは、ワイヤ上の塩化銀の層を堆積。 </li><li>脱イオン水とブロット乾燥と電極ワイヤをすすぎます。その後ピペットホルダーに戻ってAg / AgCl電極をインストールしてください。 </li><li>ヘッドステージにバス（参照）電極を接続し、お風呂に入れてください。これは記録用の電極を準備します。 </li><li>今すぐデータを取得するための準備。コンピュータの電源をオンにして、コンピュータのプリンタポ​​ートにハードウェアキーを差し込みます。あなたがHEKAパルスであるデータ収集ソフトウェアを、使用するためのハードウェアキーを接続する必要があります。 </li><li>アンプのスイッチ（アクソンインスツルメンツ、AXOPATCH 200B）とHEKAパルスを開始します。このような刺激の尺度として、プロトコルのファイルをロードし、構成設定を調整します。構成設定を調整するための目標は、テストの潜在的なコマンドの潜在的に正確に等しいことを保証することである。これは、データ収集装置を準備します。 </li><li>卵母細胞を準備します。ストリッピング溶液中に浸し卵母細胞（200mMのN -メチル- D -グルカミン（NMG、M rは 195.22グラム/モル）、200mMのアスパラギン酸（無K +）（M rは 133.1グラム/モル）、2 mMの塩化カリウム（KCl 、M rは 74.56グラム/モル）、10mMのエチレングリコール-ビス（2 - aminoethylether）- N、N、N&#39;、N&#39; -四酢酸（EGTA、M rは 380.35グラム/モル）、1mMの塩化マグネシウム（塩化マグネシウム2•6H 2 O、M R 203.31グラム/モル）、10mMの4 - （2 -ヒドロキシエチル）-1 - piperazineethanesulfonic酸（HEPES、M rは 238.31グラム/モル）、pHを水酸化ナトリウム（NaOHにより7.4に調整され5 M R 40.0グラム/モル） - 10分で剥離液により、卵黄膜を除去するなり、細胞膜から卵黄膜を切り離します。 </li><li>ゆっくりと鉗子の2つのペアを使用して卵母細胞から卵​​黄膜を取り除く。 devitellinized卵母細胞は非常に壊れやすく、そのため必要に応じて少しに移動する必要があります。 </li><li>空気や気泡にdevitellinized卵母細胞の接触を避けるために注意しながら、お風呂に卵母細胞を転送するのに十分な溶液で満たされたガラスピペットを使用してください。これは録音のための卵母細胞を準備します。 </li><li>パッチピペットを準備します。サターP - 97火焔/ブラウンマイクロピペットプラーにガラス毛細管（VWRインターナショナル、カタログ番号53432から921）を挿入した後、ガラスピペットを引き出します。先端の形状と開口部の直径を決定するために顕微鏡下でピペットを守ってください。開口径は2-4マイクロメートルにする必要があります。 </li><li>録音中に容量性電流を低減するために、滑らかな先端、コートワックスとの先端を確実にし、それを火 - ポーランド語。 </li><li> （2 -ヒドロキシエチル）-1 - piperazineethanesulfonic酸（HEPES、M R -ピペット溶液（140 mMの水酸化カリウム（KOH、M rは 56.1グラム/モル）、20mMの4内のピペットの先端を配置することにより、ピペットチップを埋める238.31グラム/モル）、2 mMの塩化カリウム（KCl、M rは 74.56グラム/モル）、2mMの塩化マグネシウム（MgCl 2の •6H 2 O、M R 203.31グラム/モル）、pHはメタンが7.1から7.2に調整され酸（メソ3、M rは 96.1グラム/モル））とプランジャーを描画。これは、先端を濡らす。 </li><li>ピペット溶液注射器を使用し、Ag / AgCl電極を内側にピペットホルダーにピペットを配置し、ピペット溶液との接触を完全にピペット1 / 3を埋める。これは、パッチピペットを準備します。 </li><li>準備卵母細胞から切り出すインサイドアウトパッチをするために、顕微鏡下で卵母細胞の明確なエッジを見つける。マニピュレータを使用して卵母細胞に近いパッチピペットを移動します。ピペットの直列抵抗を記録。パッチピペットの理想的な直列抵抗は、ピペット溶液で満たされたと浴溶液に浸漬MΩ1から1.5の間です。 </li><li>抵抗が約2倍になるまで徐々に卵母細胞に対してピペットを押してください。 </li><li>ギガオームシールが得られるまでピペットホルダーに接続された吸引管を介して口の中で膜に穏やかな吸引を適用します。分のカップルのための電圧-30 mVでそれを保持することによってパッチを安定させます。 </li><li>すぐに卵母細胞にさらにピペットを押し、次に静かに引き出してインサイドアウトパッチ、消費税のパッチを入手してください。 </li><li>インサイドアウトのパッチは現在、クランピングのための準備ができています。灌流先端の開口部から離れて約100ミクロンにインサイドアウトパッチをホールディングピペットを移動します。 </li><li>廃棄物の収集のための電子バルブを閉じて、希望する灌流液用タンクのバルブを開き、 </li><li>パッチ間の電流の録音を開始します。必要に応じて電圧と灌流液を変更します。 </li><li>録音が終了したら、目詰まりを避けるために、脱イオン水を介してプッシュすることで灌流チューブ、鉛筆、チップを清掃してください。 </li></ol> 4。代表的な結果パッチクランプのための卵母細胞の準備中に、剥離液の5〜10分の治療では、卵黄膜を除去可能にする形質膜、から卵黄膜を切り離すでしょう。 パッチピペットの理想的な直列抵抗は、ピペット溶液で満たされたと浴溶液に浸漬MΩ1から1.5の間です。 以下は、卵母細胞膜パッチ上の野生型のBKチャネルの代表的な録音です。 50mVの増分で50 mVから200 mVまでの電圧増加の第二段階 - 左上部に、方形波は、パッチに印加される電圧を示している。下記の灌流液が公称値のCa 2 +（フリーの[Ca 2 +]が約0.5 nM）を持って対応する現在のトレースです。の電流振幅のしわは、BKチャネルの開確率は電圧と共に増加することを示しています。右側に、同じパッチは、1.0μMのCa 2で灌流される+と同じ電圧のプロトコルを使用して適用される場合。電流振幅は、[Ca 2 +]の持つオープンな確率が増加することを示す、同じ電圧でより多くを向上させます。 <img src="/files/ftp_upload/2269/2269fig2.jpg" alt="図2" />

<ol>
	<li>Methfessel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+measurements+on+Xenopus+laevis+oocytes:+currents+through+endogenous+channels+and+implanted+acetylcholine+receptor+and+sodium+channels.">Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels.</a> Pfl&#252;gers Arch. 407, 577-588 (1986).</li><li>Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maxi-K+(Ca),+Unique+Member+of+the+Voltage-Gated+K+Channel+Superfamily.">Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily.</a> News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).</li><li>Fettiplace, R., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hair+cell+tuning.">Mechanisms of hair cell tuning.</a> Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).</li><li>Du, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensitive+potassium+channelopathy+in+human+epilepsy+and+paroxysmal+movement+disorder.">Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder.</a> Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).</li><li>Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-activated+potassium+channels+and+the+regulation+of+vascular+tone.">Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone.</a> Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).</li><li>Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-conductance+potassium+channels+of+the+SLO+family.">High-conductance potassium channels of the SLO family.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).</li><li>Shi, J., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mg2++enhances+the+function+of+BK-type+Ca2+-activated+K++channels.">Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels.</a> J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).</li><li>Magleby, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+mechanism+of+BK+(Slo1)+channels:+so+near,+yet+so+far.">Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far.</a> J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).</li><li>Latorre, R., Brauchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conductance+Ca2+-activated+K++(BK)+channel:+activation+by+Ca2++and+voltage.">Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage.</a> Biol. Res. 39, 385-401 (2006).</li><li>Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+gating+of+a+large+conductance+Ca-activated+K++channel.">Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).</li><li>Cui, J., Aldrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+linkage+between+voltage+and+Ca2+-dependent+activation+of+BK-type+mslo1.">Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1.</a> K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).</li><li>Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Slo1+BK+channels+by+Mg2++coordinated+between+the+voltage+sensor+and+RCK1.">Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1.</a> 15, 1152-1159 (2008).</li><li>Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term={beta}+subunit-specific+modulations+of+BK+channel+function+by+a+mutation+associated+with+epilepsy+and+dyskinesia.">{beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia.</a> J. Physiol. , 587-1481 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

卵母細胞発現系は、内在性のチャンネルの相対的に低い背景に起因する電位依存性イオンチャネルの電気生理学的特性評価に最適です。さらに、それは一過性発現系なので、それはこれらのチャネルの突然変異誘発試験を行うの効率的な方法を提供する。しかし、それは卵母細胞発現系は、哺乳類細胞では異なることに留意すべきである、したがって、異なるサブユニットと翻訳後修飾との?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company</td>
<td>3-000-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion System and Electronic Controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutoMate Scientific, Inc.</td>
<td>ValveLink 16</td>
<td>Inner diameter of perfusion tip: 100 microns</td>
</tr>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>CKX31</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR International</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>AXOPATCH 200B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer Interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>INSTRUTECH Corporation</td>
<td>ITC-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Headstage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>CV 203BU</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patch clamp and perfusion techniques for studying ion channels expressed in xenopus oocytes

大コンダクタンス、電圧およびCa 2 +活性化K +（BK）チャネルの活性化を研究するために設計されているプロトコルは、ここで紹介。プロトコルはまた、他のイオンチャネルや神経伝達物質受容体1の構造機能相関を研究するために使用されることがあります。 BKチャネルは、幅広くさまざまな組織で発現され、平滑筋収縮、内有毛細胞の周波数同調と神経伝達物質放出2-6の規制の規制などを含め多くの生理機能に関与している。 BKチャネルは、膜の脱分極によっておよび細胞内Ca 2 +およびMg 2 + 6〜9によって活性化されています。そのため、プロトコルは、膜電位と細胞内液の両方を制御するように設計されています。このプロトコルでは、BKチャネルのメッセンジャーRNAを18℃で10から13のインキュベーションの2-5日間続いてアフリカツメガエル卵母細胞（ステージV - VI）に注入されます。単一または複数のBKチャネルを含む膜のパッチは、パッチクランプ法を10-13を使用してインサイドアウトの構成で切り出しています。パッチの細胞内側は、異なる条件下でのチャネルの活性化を調べることができるように記録する際に必要なソリューションで灌流される。要約すると、BKチャネルのmRNAは卵母細胞膜上のチャネルタンパク質を発現するアフリカツメガエル卵母細胞に注入され、パッチクランプ技術は、制御電圧と細胞内のソリューションの下にチャネルを流れる電流を記録するために使用されます。

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Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

BKチャネルのイオン電流をパッチクランプ技術を使用して記録されます。 BKチャネルはで表されます<em&gt;アフリカツメガエル卵母細胞</em&gt;メッセンジャーRNAを注入することにより。パッチクランプ記録中に細胞内液を灌流システムによって制御されます。

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

patch-clamp-perfusion-techniques-for-studying-ion-channels-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

20.8K ビュー.  Washington University in St. Louis. BKチャネルのイオン電流をパッチクランプ技術を使用して記録されます。 BKチャネルはで表されますアフリカツメガエル卵母細胞メッセンジャーRNAを注入することにより。パッチクランプ記録中に細胞内液を灌流システムによって制御されます。

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Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

がくからパッチクランプの静電容量の録音のための方法

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

生物学

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

改善されたパッチクランプ記録のための圧力 - 研磨ピペット

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

イメージングとパッチクランプ電気生理学用ジャイアントリポソーム製剤

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

一チャネルセル付パッチクランプ法

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...