Supportato dalla concessione NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Wyoming. Tutte le procedure, comprese le registrazioni elettrofisiologiche, sono effettuate a temperatura ambiente, circa 23 ° C. Tutti i metodi descritti qui sono ottimizzati per la registrazione di neuroni tectal da girini tra fase inerente allo sviluppo 42 e 49 (rappresentata nel secondo Neiuwkoop e Faber15).
1. preparazione in Vivo
<ol><li>Anestetizzare il girino.<ol>
<li>Posizionare il girino in un piccolo piatto di Petri contenente soluzione di Steinberg con 0.01% MS-222 per circa 5 min. Nota: MS-222 aka "tricaina" è un comune pesci e anfibi anestetico. I girini sono allevati nella soluzione di Steinberg in mM: 0,067 KCl, 0.034 Ca (NO3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES.</li>
		<li>Garantire che il girino è profondamente anestetizzato (non-responsivi e non più nuoto) prima di procedere al passaggio 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fissare il girino anestetizzato a un blocco di silicone sommerso al piano del piatto di dissezione/registrazione.<ol>
<li>Utilizzare una pipetta monouso per spostare il girino anestetizzato in un piatto di dissezione/registrazione contenente soluzione di registrazione esterna (115mm di NaCl, KCl, spessore 2 mM 3 mM di CaCl2, 3mm di MgCl2, 5mm di HEPES, 1 mM di glucosio; regolare il pH a 7,25 utilizzando 10 N di NaOH, osmolarità 255 mOsm).<ol>
<li>Per ridurre al minimo spontanea del muscolo twitches, aggiungere il bloccante del recettore dell'acetilcolina, tubocurarina (100 µM) alla soluzione esterna. (In genere, ciò avviene mediante una pipetta di 200 µ l per aggiungere 100 µ l di uno stock di tubocurarina 10 mM a 10 mL di soluzione esterna).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzando spilli entomologici, sicuro il girino, lato dorsale fino, a un blocco sommerso di elastomero di silicone (ad esempio Sylgard 184, Vedi Tabella materiali per dettagli), che è stato incollato al pavimento piatto per dissezione. Nota: Il posizionamento dei perni è critico: metterli su entrambi i lati del cervello, sufficientemente caudale per evitare impalare gli assoni afferenti di RGC quel progetto dall'occhio ed entrare nel cervello solo anteriore il tectum ottica (Figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filetto del cervello lungo la linea mediana.<ol>
<li>Per una visione chiara del cervello, togliere la pelle che ricopre il cervello facendo un'incisione superficiale lungo il midline usando un ago sterile 25-G.</li>
		<li>Sfilettare il cervello sullo stesso asse del midline inserendo l'ago nel tubo neurale e tirando delicatamente verso l'alto (dorsalmente) tale che la porzione dorsale del tubo è tagliata in modo pulito (mozzata), lasciando intatta la piastra di pavimento (Figura 1B). Nota: È importante che la piastra di pavimento del tubo neurale rimasto intatto perché l'input sensoriali afferenti immettere il tectum tramite la piastra di pavimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere la membrana trasparente ventricolare che copre i neuroni tectal.<ol>
<li>Spostare il piatto di registrazione per l'impianto di perforazione di elettrofisiologia e utilizzare la punta di una pipetta di vetro rotto per rimuovere la membrana ventricolare che ricopre i corpi cellulari di neuroni tectal. Rompere la punta leggermente trascinandolo attraverso un tergicristallo delicato compito.</li>
		<li>Avvitare la pipetta Dispensare titolare e abbassarla verso il tectum ottica tramite il micromanipolatore.</li>
		<li>Usare la pipetta rotta per sbucciare la membrana ventricolare lontano il tectum. Nota: Non è necessario rimuovere la membrana dal tectum intero; una piccola finestra sarà sufficiente e fornire l'accesso a un sacco di neuroni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ottenere l'intera cellula registrazioni di patch clamp. Nota: L'approccio da questo punto in avanti è simile a svolgere le registrazioni a cellula intera patch clamp da fette di cervello del topo come descritto in Segev, et al. 16 (Figura 1C).</li>
	<li>Registrare le risposte di neuroni tectal a un flash di tutto il campo di luce proiettati sulla retina.<ol>
<li>Per proiettare un lampo di tutto il campo di luce sulla retina, posto adiacente all'occhio del girino una fibra ottica. A altra estremità della fibra ottica è un LED in linea con un resistore variabile che permette per la luminanza leggera essere controllato. Attivare il LED di uscita digitale dell'amplificatore. In questo modo, tutto il campo flash di diversa intensità della luce può essere registrata (Figura 4A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. whole Brain preparazione
<ol><li>Eseguire i passaggi da 1.1 a 1.3. Nota: Non esiste alcuna necessità di tubocurarina nella soluzione esterna per questa preparazione.</li>
	<li>Isolare il cervello.<ol>
<li>Usare un ago da 25 G per interrompere hindbrain (Figura 2A).</li>
		<li>Per isolare l'intero cervello da girino, eseguire delicatamente l'ago sotto il cervello, in direzione caudale--rostrale di recidere tutti i laterale e ventrale del tessuto connettivo e fibre nervose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fissare il cervello a un blocco di elastomero di silicone.<ol>
<li>Una volta completamente liberato, fissare il cervello a un blocco di elastomero di silicone inserendo un pin attraverso uno dei bulbi olfattivi e un altro attraverso il hindbrain (Figura 2B). Questa è la configurazione ottima per la registrazione da neuroni tectal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spostare il piatto contenente la preparazione appuntato intero cervello dall'ambito dissezione per l'impianto di perforazione di elettrofisiologia. Togliere la membrana ventricolare usando una pipetta di vetro rotto come descritto al punto 1.4.</li>
	<li>Posizionare un elettrodo stimolante bipolare il chiasm ottico (dove i tratti dell'assone da ogni occhio Croce al mesencefalo) per attivare direttamente gli assoni RGC.<ol>
<li>Posizionare l'elettrodo stimolante bipolare rostrale e quasi adiacente al, ventricolo medio grande. Il chiasma ottico si trova immediatamente rostral al ventricolo medio grande (Figura 2B).<ol>
<li>Abbassare delicatamente l'elettrodo stimolante giù sul chiasma tale che una piccola ammaccatura è formata nel tessuto. L'elettrodo bipolare è guidato da uno stimolatore di impulso che permette la forza di stimolazione per essere controllato con precisione.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la registrazione di morsetto di patch intera cellula (Figura 2C) come descritto da Segev, et al. 16
</li>
</ol>3. orizzontale cervello fetta preparazione
<ol><li>Eseguire i passaggi 2.1 a 2.3.</li>
	<li>Utilizzare una lama di rasoio per asportare il quarto più laterale (che in vivo corrisponde alla quarta più dorsale) di un lato di un ottica tectum. Questo taglio è fatto parallelo al piano rostrale caudale come mostrato in Figura 3A.</li>
	<li>Re-pin il cervello al lato dell'elastomero siliconico con le fette lato rivolto verso l'alto (in modo che il somata e neuropil sono direttamente accessibili per la registrazione) e la superficie ventricolare del cervello dalla parte opposta del blocco di elastomero di silicone (Figura 3 B) (in modo che un elettrodo bipolare può essere posizionato su chiasm ottico).</li>
	<li>Eseguire l'intera cellula patch morsetto o registrazione potenziali archiviato locale (Figura 3C) come descritto da Segev, et al. 16
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).</li><li>Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+Order+in+Human+Neurological+Disorder+Using+a+Tadpole.">Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole.</a> Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).</li><li>Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+and+function+of+the+Xenopus+tadpole+retinotectal+circuit.">Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).</li><li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+regulation+of+voltage-gated+intrinsic+currents+in+the+developing+optic+tectum+of+the+Xenopus+tadpole.">Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole.</a> J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).</li><li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+intrinsic+excitability+and+synaptic+transmission+in+a+developing+visual+circuit.">Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit.</a> J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).</li><li>Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+analysis+of+electrophysiological+diversity+of+Xenopus+visual+neurons+during+development+and+plasticity.">Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity.</a> Elife. 4, 11351 (2015).</li><li>Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visually+driven+regulation+of+intrinsic+neuronal+excitability+improves+stimulus+detection+in+vivo.">Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo.</a> Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).</li><li>Wu, G., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cline+H.T.+of+a+central+glutamatergic+synapse.">Cline H.T. of a central glutamatergic synapse.</a> Science. , 972-976 (1996).</li><li>Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory-evoked+spiking+behavior+emerges+via+an+experience-dependent+plasticity+mechanism.">Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism.</a> Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).</li><li>Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+transcription+of+BDNF+enhances+visual+acuity+during+development.">Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development.</a> Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).</li><li>Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+window+for+cooperation+and+competition+among+developing+retinotectal+synapses.">A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses.</a> Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).</li><li>Dong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+avoidance+in+Xenopus+tadpoles+is+correlated+with+the+maturation+of+visual+responses+in+the+optic+tectum.">Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum.</a> J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).</li><li>Hamodi, A. S., Pratt, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+horizontal+brain+slice+preparation:+a+novel+approach+for+visualizing+and+recording+from+all+layers+of+the+tadpole+tectum.">The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum.</a> J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).</li><li>Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Relationships+Impact+Neuronal+Tuning+within+a+Phylogenetically+Ancient+Vertebrate+Brain+Structure.">Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure.</a> Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).</li><li>Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation+and+inhibition+in+recurrent+networks+mediate+collision+avoidance+in+Xenopus+tadpoles.">Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles.</a> Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).</li><li>Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+to+see:+patterned+visual+activity+and+the+development+of+visual+function.">Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function.</a> Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).</li><li>Pratt, K. G., Aizenman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisensory+integration+in+mesencephalic+trigeminal+neurons+in+Xenopus+tadpoles.">Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles.</a> J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Tutti i metodi descritti in questo lavoro sono ottimizzati per la registrazione di neuroni tectal da girini tra fase inerente allo sviluppo 42 e 49 (rappresentata nel secondo Neiuwkoop e Faber15). Dalla fase 42, i girini sono sufficientemente grandi e sufficientemente sviluppati affinché i perni degli insetti possono essere posizionati su entrambi i lati del cervello per le registrazioni in vivo e di eseguire la dissezione del cervello intero. Nelle fasi precedenti, quando i girini sono ...

Il circuito di retinotectal è il componente principale del sistema visivo anfibio. Si compone di RGCs nell'occhio, che proiettano i loro assoni al tectum ottica dove formano connessioni sinaptiche con neuroni postsinaptici tectal. Il circuito di retinotectal girino Xenopus è un popolare modello di sviluppo per studiare la funzione e la formazione di circuiti neurali. Ci sono molti attributi del circuito retinotectal di questo girino che lo rendono un potente modello sperimentale1,2,3. Un attributo importante e il focus di questo articolo, è la capacità di effettuare tutta la cella patch morsetto registrazioni da neuroni tectal, in vivo o usando una preparazione di tutto il cervello. Con un impianto di perforazione di elettrofisiologia equipaggiato con un amplificatore che supporta la modalità di registrazione a morsetto di tensione e corrente, le registrazioni a cellula intera patch clamp permettono di elettrofisiologia di un neurone a caratterizzarsi ad alta risoluzione. Di conseguenza, tutta la cella patch clamp le registrazioni da neuroni tectal attraverso le fasi chiave della formazione del circuito di retinotectal hanno fornito una comprensione completa e dettagliata dello sviluppo e plasticità di intrinseca4,5 , 6 , 7 e proprietà sinaptiche8,9,10,11 . Combinando le registrazioni a cellula intera patch clamp tectal del neurone, la capacità di esprimere geni o morpholinos di interesse in questi neuroni12e un metodo per valutare il comportamento visivo guidato tramite un stabilito elusione visual test13 promuove la identificazione dei collegamenti tra molecole, circuito funzione e comportamento.
È importante notare che il tipo di alta risoluzione di dati acquisiti da registrazioni di cellula intera patch clamp non sono possibili utilizzando i più recenti approcci di imaging come l'indicatore di calcio genetica GCaMP6, perché anche se utilizzando indicatori di calcio permette l'imaging di calcio dinamiche attraverso le grandi popolazioni di neuroni simultaneamente, non c'è nessun diretto o modo ovvio che i parametri elettrici specifici possono essere ottenuti misurando la fluorescenza di delta nel somata e non c'è alcun modo per tensione morsetto il neurone per misurare rapporti corrente-tensione. Chiaramente questi due approcci distinti, registrazioni elettrofisiologiche e imaging del calcio, possiedono punti di forza non sovrapposte e generare diversi tipi di dati. Pertanto, l'approccio migliore dipende la questione sperimentale specifica affrontata.
Qui, descriviamo il nostro metodo per l'acquisizione di registrazioni di morsetto a cellula intera patch da neuroni del tectum ottica girino utilizzando una preparazione in vivo , preparazione di tutto il cervello, e una più recente modificato preparazione di tutto il cervello che è stato sviluppato nel nostro laboratorio14 . Nella sezione risultati rappresentante, dimostriamo i vantaggi sperimentali di ogni preparazione e le tipologie di dati che possono essere ottenuti. I limiti e i punti di forza di preparazioni differenti, così come suggerimenti per la risoluzione dei problemi, sono inclusi nella sezione discussione.

<table><tbody><tr><td>Stemi Stereo 508</td><td>Zeiss</td><td>495009-0006-000&amp;nbsp;</td><td>Dissecting microscope</td></tr><tr><td>MS-222 &quot;Tricane&quot;</td><td>Finquel</td><td>ARF5G</td><td>Amphibian general anesthetic</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Used to prepare Stienberg&#039;s solution and external solution</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Used to prepare Stienberg&#039;s solution and external solution</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-1KG</td><td>Used to prepare Stienberg&#039;s solution and external solution</td></tr><tr><td>Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&amp;bull;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124-500G</td><td>Used to prepare Stienberg&#039;s solution&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Used to prepare Steinberg&#039;s solution</td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>Used to prepare external recording solution</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>J.T. Baker</td><td>2444-01</td><td>Used to prepare external recording solution</td></tr><tr><td>D-glucose Anhydrous</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Used to prepare external recording solution</td></tr><tr><td>Tubocurarine hydrochloride pentahydrate</td><td>Sigma</td><td>T2379</td><td>Nicotinic acetylcholine receptor antagonist</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>0.1mm diameter stainless steel pins</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>761028</td><td>Preweighed monomer and curing agent kit</td></tr><tr><td>Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS4052</td><td>Small petri dishes</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Syringe needles</td></tr><tr><td>1mL Slip Tip Tuberculin Syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Disposable, sterile syringes</td></tr><tr><td>Borosilicate pipette glass</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10HP</td><td>Pulled to desired specifications using pipette pulling machine</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Fabricates micropipettes for electrophysiology recording</td></tr><tr><td>Kimwipes Kimtech wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>Delicate task lint-free wipers</td></tr><tr><td>Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td>Current clamp and voltage clamp headstage</td></tr><tr><td>MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285/T</td><td>Control for headstage on electrophysiology rig</td></tr><tr><td>Fiber-Coupled LED (Green)</td><td>Thorlabs</td><td>M530F2</td><td>Fiber optic cable paired with green LED</td></tr><tr><td>Cluster Bipolar Electrode (25&amp;micro;m diameter)</td><td>FHC</td><td>30207</td><td>Bipolar stimulating electrode</td></tr><tr><td>ISO-Flex Stimulator</td><td>A.M.P.I. (Israel)&amp;nbsp;</td><td>Contact manufacturer</td><td>Flexible stimulus isolator</td></tr><tr><td>Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Amplifier for voltage- and current-clamp recording&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digidata 1322A digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-135</td><td>Data acquisition system for electrophysiology recording</td></tr><tr><td>Axio Examiner.A1</td><td>Zeiss</td><td>491404-0001-000&amp;nbsp;</td><td>Microscope for electrophysiology</td></tr><tr><td>Micro-g Lab Table</td><td>TMC</td><td>63-533</td><td>Air table for electrophysiology microscope</td></tr><tr><td>Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit</td><td>Dell</td><td>D06D001</td><td>Computer running electrophysiology software</td></tr><tr><td>c2400 CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>70826-5</td><td>Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging</td></tr><tr><td>7 O&#039;Clock Super Platinum Stainless Razorblades</td><td>Gillette</td><td>CMM01049</td><td>Platinum-coated stainless razor blades</td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Disposable Polyethylene transfer pipets</td></tr></tbody></table>

preparations and protocols for whole cell patch clamp recording of xenopus laevis tectal neurons

Il circuito di retinotectal girino di Xenopus , comprende le cellule retiniche del ganglio (RGCs) nell'occhio che formano le sinapsi direttamente sui neuroni nel tectum ottica, è un modello popolare di studiare circuiti neurali come auto-assemblarsi. La capacità di svolgere tutta la cella le registrazioni del morsetto di patch da neuroni tectal e per registrare le risposte evocate RGC, entrambi in vivo o usando una preparazione di tutto il cervello, ha generato un grande corpo dei dati ad alta risoluzione circa i meccanismi di fondo normale e anormale, circuito formazione e funzione. Qui descriviamo come eseguire la preparazione in vivo , la preparazione originale di tutto il cervello, e più recentemente sviluppato preparazione di fetta di cervello orizzontale per ottenere le registrazioni a cellula intera patch clamp da neuroni tectal. Ogni preparazione ha vantaggi unici sperimentali. La preparazione in vivo permette di registrare la risposta diretta dei neuroni tectal agli stimoli visivi proiettato sull'occhio. Permette la preparazione di tutto il cervello per gli assoni RGC deve essere attivata in modo altamente controllato, e la preparazione di fetta di cervello orizzontale permette la registrazione da attraverso tutti gli strati del tectum.

Per registrare le risposte evocate luce un lampo di tutto il campo di luce viene proiettato la retina, mentre la risposta risultante viene registrata da singoli neuroni tectal (Figura 4A). Questo particolare protocollo è progettato per misurare sia la risposta del neurone alla luce accensione ("On" risposta) e quindi spegnendo 15 s più tardi per misurare la "risposta fuori." Neuroni tectal esibiscono tipicamente robusto e disattivare le ri...

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Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.

Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

9.4K Views.  University of Wyoming. In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.

Video: Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Ricerca

Biologia

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types that are distinct not only in molecular and morphological features but also in physiological properties. These differences reflect their diverse functions, which together establish the necessary microenvironment for the post-testicular sperm development in the epididymal lumen. The understanding of the biophysical properties of the epididymal epithelial cells is critical for revealing their functions in sperm and reproductive health, under both physiological and pathophysiological conditions. While their functional properties have yet to be fully elucidated, the epididymal epithelial cells can be studied using the patch-clamp technique, a tool for measuring the cellular events and the membrane properties of single cells. Here, we describe the methods of cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides.

We present a protocol that combines cell isolation and whole-cell patch-clamp recording to measure the electrical properties of the primary dissociated epithelial cells from the rat cauda epididymides. This protocol allows for investigation of the functional properties of primary epididymal epithelial cells to further elucidate the physiological role of the epididymis.

Registrazioni Patch-clamp intere cellule delle cellule epiteliali primarie isolate dall&#39;epididimo

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Biologia dello sviluppo

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Neuroscienze

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Bloccare Registrazioni patch da cellule embrionali Zebrafish Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Establishing a Whole-Cell Configuration through the Patch Clamp Method

Source: Segev, A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54024">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the whole-cell patch clamp technique in a mouse brain slice. This technique establishes a stable connection between micropipette and neuron membrane, which is further disrupted to establish a whole-cell configuration to study the neuron&#39;s health and physiological responses.

Definizione di una configurazione a cella intera tramite il metodo Patch Clamp

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Slice ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: A Method to Study Electrical Properties of Neurons

Source: Roy, B., et al. <a href="https://www.jove.com/v/50551/" target="_blank">Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells</a>. J. Vis. Exp. (2013).
This protocol describes a technique called whole-cell patch clamp electrophysiology, which is a method to study electrical properties of Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos.

Elettrofisiologia del Patch Clamp a cellula intera: un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni

Source: Roy, B., et al. Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells. J. Vis. Exp. (2013).
This protocol describes a technique called ...

Danio rerio (zebrafish)

Embryo

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

Source: Tu, H., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54608">Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a whole-cell patch-clamp technique for electrophysiological recording from a flat-mount mouse retina. A thin glass pipette with an electrode is used to approach starburst amacrine cells (SACs) within the retina. After forming a seal, suction is applied to rupture the membrane and form the whole-cell patch-clamp configuration. Finally, the flow of ions through the SAC synaptic receptors is measured using the configuration.

Definizione di un patch clamp a cellula intera per la registrazione elettrofisiologica da una retina di topo a montaggio piatto

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. External and Internal Solutions

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Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

Source: Zhu, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58479">Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.

Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis

Riepilogo

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