これは、標的抗体中和を用いてDCAF分子を合成する方法に関する重要な質問に答えるのに役立つかもしれません。この手法は、DCAF分子を高い生産性で合成する最も簡単な方法を提供します。世界は、DCAF分子がデング熱や筋無力症などの疾患を扱う抗体に潜在的な介入を持っていると判断します。
この方法は、異なるエピトープを有する他のDCAF分子に適用して、同結合抗体を標的とすることができる。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の上級技術者であるXue Baiです。2-塩素樹脂をヒドラジン由来の2-塩素樹脂に変換するには、ペプチド合成容器の上部から、2-塩素樹脂の0.25ミリモルにDMFを5ミリリットル加えます。
キャップを元に戻し、容器を15秒間軽く振り、鉄のスタンドで水切りします。DMF洗浄をさらに2回繰り返します。その後、容器に5ミリリットルのDCMを加え、キャップを元に戻し、容器を15秒間静かに振り、鉄のスタンドで排水します。
さらに2回DCM洗浄を繰り返し、DMF洗浄をさらに3回繰り返します。次に、DCM上のDMFの50%体積濃度の6ミリリットルを加えて、樹脂を30分間膨らましてから、水切りします。今度は、ヒドラジンとDMFの5%体積濃度の6ミリリットルを反応容器に移す。
シェーカーの上に120 RPM、摂氏30度で30分間置き、真空ポンプで溶液を排出します。Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体を精製するために、HPLCシステムを使用して、1分間に1ミリリットルの流速で30分間の勾配の溶出によってペプチドを精製する。原稿によるタンパク質精製後、新しいチューブに、SUMOタグ付きタンパク質1ミリ1ミリグラム、SUMOプロテアーゼ1ミリリットル、10X SUMOプロテアーゼバッファーの1ミリリットル、および6ミリリットルの二重蒸留水を加えて反応液を調製する。
混合物を摂氏4度で12〜16時間インキュベートする。その後、混合物を8つの1.5ミリリットルのエペンドルフ管にアリコートし、摂氏4度で10分間Gの15,000倍の遠心分離機を作る。ピペットを使用して下部の凝集体を捨て、10ミリリットルの清澄化した上清に、50ミリモルPBSで50%ニッケルNTAビーズスラリーの0.5ミリリットルを加えます。
チューブをロータリーシェーカーに200 RPM、摂氏4度で置き、60分間軽く混ぜます。次に、リサデとニッケルNTA混合物を底出口キャップ付きのカラムに積み込みます。底部キャップを取り外し、流れを15ミリリットルの遠心管に保存します。
HISタグ相撲タンパク質はカラム上で結合している。リンカー抗原部分は、天然の化学ライゲーション反応のためにCISで始まり、流れに入っています。現在、Fc-IIIペプチドのヒドラジン誘導体を2ミリリットルのエペンドルフチューブに1.8ミリグラムの重量を量り、pH3で0.2モル一リン酸ナトリウム溶液に6モルグアニジニウムクロリドの0.8ミリリットルを加える。
ボルテックスは粉末を溶解する。7でチューブを遠心した後、室温で1分間Gを200回Gに200回、上清を新しいチューブに移す。チューブに攪拌棒を加え、磁気スターラーの氷塩浴にチューブを入れ、溶液を15分間緩やかに攪拌します。
その後、溶液に0.5モル亜硝酸ナトリウムの40マイクロリットルを加えて、ヒドラジン基を酸化する。氷塩浴でさらに15分間、溶液を軽く攪拌します。HPLCの精製および凍結乾燥リンカー抗原部分の11ミリグラム、氷塩浴中の反応管に13.6ミリグラムのMPAAを計量します。
5分間かき混ぜ、6モル水酸化ナトリウムで温帯でpH値を6.8〜7.0に調整します。天然の化学ライゲーションの最も重要なステップは、pH値を慎重に調整してライゲーション反応を開始することです。氷塩浴で12時間後、0.1モルTCEP中性溶液の0.4ミリリットルを反応系に加え、20分間攪拌して反応を終了させた。
遠心分離およびHPLC精製後、脱硫のためのコンジュゲートピークIIIを得る。0.2モルリン酸ナトリウム溶液中の6モルグアニジニウムクロリドの50マイクロリットルに溶解します。その後、1モルTCEPの50マイクロリットル、Tert-ブチルチオールの10マイクロリットル、および4つの溶液のための0.1モルVAOの5マイクロリットルを加えます。
溶液の最終的なpHを6.9に調整し、約5時間シェーカーで37°Cに保ちます。遠心分離機と再び浄化します。調製したペプチドを32ミリモル酢酸の200マイクロリットルに溶解し、次いで反応混合物を室温で4時間撹拌する。
ペプチド上の銀チオラ化を遊離チオールに変換するには、塩化グアニジニウム6モルに1モルDTTの3マイクロリットルを加え、pH7で0.2モル一ナトリウムリン酸ナトリウムを加える。質量分析計をフルスキャンモードで操作し、m/z範囲を300~2,000、解像度を60,000に設定します。質量スペクトルデータを開き、各ステップで生成物のピークを見つけ、化学反応が正常に行われているか確認します。
DCAF1と4G2抗体の相互作用のELISAアッセイを実行するには、コーティングバッファーの100マイクロリットルに抗GST抗体の1ピコモールを用いた96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルをコーティングします。シーリングテープでプレートを密封し、シェーカーで一晩摂氏4度でインキュベートします。朝には1%BSAとPBSの200マイクロリットルで各井戸をブロックします。
プレートを密封し、シェーカーで1時間温帯で部屋をインキュベートします。その後、0.05%Tween 20でPBSを使用して、それぞれを4回よく洗います。このプロトコルでは、天然の化学ライゲーション法をDCAF1分子の半合成に使用した。
質量スペクトルは、最終的なDCAF1分子が11,053のデコンボリューション分子重さを有する。ELISAアッセイ中、抗原ペプチドFc-IIIおよびDCAF1は4G2抗体結合を競合的に阻害する。抗原ペプチドとDCAF1はいずれも4G2結合を有意に遮断したのに対し、Fc-IIIペプチドは抗原抗体相互作用に影響を与えなかった。
この開発の後、この技術は有害な抗体関連疾患の介入への道を開いた。ペプチド合成および天然の化学結紮に使用される領域のロットは非常に有毒です。あなたの化学フードでこれらの実験を取ることを確認してください。
