このプロトコルは、腫瘍および組織における抗体分布の発現と精製および抗体分布のリアルタイムモニタリングを実証する。記載されたプロトコルを用いた抗体のスクリーニングは、限定的な非特異的組織分布を有する抗体の選択を助け、腫瘍の局在を豊かにする。記載された技術は、迅速かつ費用対効果が高い。
単光子放射コンピュータ断層撮影や陽電子放出断層撮影などの他の技術は非常に高価であり、放射性および他の洗練されたトレーサーを必要とする。この技術は、がん標的抗体に限定されない。これは、体内の抗体分布の分析のために、肺や心臓病などの他の疾患に適用することができます。
手順を実証すると、私の大学の獣医技術者ジェレミー・ゲイツマンになります。200ミリリットルのメディアの生のCHO細胞は、デロンで、エルレンマイヤーバッフルフラスコ。CHOフリースタイル培地5ミリリットルと可変重クローンDNA50マイクログラム、15ミリリットルチューブ内の可変光クローンDNA75マイクログラムを組み合わせます。
次いで、チューブを渦に入れ。混合物を室温で5分間放置します。1ミリリットルの750マイクロリットルを1ミリリットルのポリエチレンアミンストックをDNA溶液に加え、30秒間積極的に渦液化します。
さらに5分間室温で混合物を残します。フラスコを手動で振りながら、CHOセルに全体の混合物を追加します。130 RPMで振りながら、すぐに37°Cで細胞をインキュベートします。
翌日、100X抗凝集剤を2ミリリットル、100X抗菌抗菌性抗菌溶液を2ミリリットルを細胞に加えます。フラスコを摂氏32~34度でインキュベートし、130RPMで揺れ動かします。10〜11日間細胞を培養し続け、トリプトンN1飼料10ミリリットル、5日ごとに100 Xグルタミンサプリメント2ミリリットルを加えます。
細胞の生存率が10日または11日に80%を超えることを確実にするために、3日ごとに細胞を数え、培養物を3000倍Gで遠心し、40〜60分間摂氏4度で抗体精製用培地を収穫する。次に、0.22マイクロメートルのボトルフィルターで透明な媒体を濾過します。抗体を精製するために、結合バッファーの2列体積でプロテインAカラムを平衡化する。
1 分間に 1 ミリリットルの流量で、フィルターされたメディアをカラムに通します。次に、2段の結合バッファーでカラムを洗います。溶出バッファーの 5 ミリリットルを使用して、抗体を 500 マイクロリットル分数に溶出させます。
そして、分画のために中和バッファーの10マイクロリットルを添加することによって、ほのめかされた抗体のpHを中和する。IgGのデフォルトプロトコルを使用して、分光光度計で精製された抗体の濃度を測定します。1リットルの共役バッファーに透析カセットを用いた抗体の透析0.5ミリリットル。
4時間後、透析カセットを新鮮なバッファーに移し、一晩透析します。共役反応を設定するには、抗体の1ミリグラムあたり0.03マイクログラムのIRR色素800 CWUを合計容量500マイクロリットルで添加します。混合物を摂氏20度で2時間インキュベートし、PBSに対する広範な透析によって標識コンジュゲートを精製する。
色素780ナノメートルの吸光度を測定し、タンパク質の吸光度を280ナノメートルで測定して標識の程度を推定する。マウスの異種を開発するには、動物の皮膚をそっと持ち上げ、下層の筋肉層から分離します。26ゲージ針で皮膚の下に100マイクロリットルの細胞懸濁液をゆっくりと注入する。
ニードルを取り出す前に数秒待って、地下マトリックス培地が皮膚下の細胞と一緒に半固体ゲル状の構造を知らせ、注射部位から混合物が出てくるのを防ぎます。インビボイメージングを行うために、尾静脈を介して色素標識抗体を注入する。マウスを麻酔した後、ペダル反射に対する応答の欠如を確認し、温水を適用して静脈を拡張します。
26ゲージ針の1ccインスリン注射器を使用して、100マイクロリットルの体積で標識抗体の25マイクログラムを注入する。陰性対照として、癌細胞を標的としない非特異的IgGアイソタイプ抗体を標識して注入する。インビボイメージングを行う 8、24、48 抗体注射後。
イメージング ソフトウェアで、[初期化] をクリックします。ステージ温度が摂氏37度であることを確認します。コントロールパネルで、イメージングウィザードを使用して蛍光イメージングを設定し、励起を773ナノメートルに設定し、放出を792ナノメートルに設定します。
麻酔マウスを撮像室に移します。ノーズコーンを使用してイメージングフィールドに配置します。準備ができたら、イメージ取得用のコントロールパネルの取得をクリックし、[自動公開]をクリックします。
生成された画像は、光蛍光と濃度がカウントまたは光子の単位で表示された写真画像上の蛍光のオーバーレイです。可変重および可変光ドメインを有する陽性cDNAクローンはコロニーPCRで確認された。非還元および還元SDSページでの精製されたファルレツズマブランの代表的な結果をここに示す。
重鎖および軽鎖は、還元後に50キロと25キロダルトンバンドを生産した。細胞表面における天然タンパク質に対する抗体の結合も確認された。蛍光標識抗体は、尾静脈を注射し、腫瘍を発現する完全なR1で移植されたマウスに注射した。
動物は、IVISを使用して複数の時点で生きた画像であった。このデータは、腫瘍に完全なR1およびBaCa抗体の選択的濃縮を打ち明ける。このプロトコルを試みるとき、CHO細胞の維持は抗体の収量にとって重要であることを覚えておいてください。
そして、競合性腫瘍局在化のために同様の程度の蛍光色素結合を有することが重要である。この手順に従って、組織免疫組織化学や組織または腫瘍特異的ELISAなどの他の方法を、生きたマウスのイメージングデータを支持するように行うことができる。
