この方法は、マイクロ流体系の組み合わせ技術と、マイクロ流体デバイスや非対称PCR法などの分子バイオテクノロジー分野における重要な質問に答える手助けとなります。この技術の主な利点は、高度に均質化された微小球の効率的な生成と、追加の分離ステップなしで一本鎖DNAを生成することです。この技術の意味は、様々な疾患の診断または治療にまで及ぶ。
一本鎖DNAの生成はap-ta-mo-sisアッセイの鍵となるため、検出や治療に使用できます。この方法は、MEMSの三次元微小流体系に関する洞察を提供することができますが、病気の検出と治療に使用される他のシステムにも適用できます。一般に、この方法に新しい個人は、逆方向に流れるから流体を適切に制御するために苦労します。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、生成された微小球の流れの焦点を合わせる幾何学および凝固の微小球形成を観察するために重要である。まず、塩基ポリマーと触媒を10対1比で混合して20ミリリットルの液体PDMSプレポリマーを調製する。マイクロ流体ネットワークの上部のシリコンウェーハ上の準備されたSU-8型に液体PDMSの10ミリリットルを注ぎます。
底面平らな部分の場合、同じ量の液体PDMSを金型構造なしでシリコンウェーハに注ぎます。液体PDMSプレポリマーでコーティングされた2つのシリコンウエハーを予熱ホットプレートに置き、摂氏75度で30分間硬化します。これに続いて、硬化PDMS層をSU-8モールドから手動で剥離する。
直径1.5ミリメートルの丸い穴パンチングツールを、複製されたマイクロ流体ネットワークのオイルポートに合わせて、ミクロンスケールの流路をマクロ流体サンプルと接続します。その後、手動でスルーホールをパンチアウト。パンチングプロセスを3回繰り返した後、ハンドヘルドコロナ治療器を使用して上側と下側のPDMS層の両方で、サンプルあたり数秒間親水性表面処理を行います。
PDMS-PDMS間の結合プロセスのためのホットプレートの上に2つのプラズマ処理PDMS層を積み重ね、摂氏90度で30分間熱を出します。ボルテックスと簡単に遠心分離法標準的な一本鎖DNAアクリル標識プローブと19対1のアクリルアミドビスストック溶液。25マイクロリットルの40%アクリルアミドビス溶液、10マイクロリットルの一本鎖DNA、10マイクロリットルの5X TBEバッファー、5マイクロリットルの水を混合して溶液を調製します。
20%過硫酸アンモニウムの50マイクロリットルで溶液2を調製します。溶液1と溶液2で個別に充填された2つのシリンジを準備し、それらをシリンジポンプに取り付けて、マイクロ流体プラットフォームにソリューションフローを導入します。微小球の表面凝固のために0.4%TEMEDと混合鉱物油を準備する。
ガラス瓶にミネラルオイルを充填した後、マイクロ流体貯留層としてガラス瓶のキャップにある空気圧および流体ポートに2つのチューブを挿入します。マイクロ流体装置のガラス瓶とオイルポートの間にチューブを接続します。マイクロ流体デバイスの 2 つのソリューション ポートにチューブを接続して、シリンジ ポンプから 2 つのソリューションを供給します。
次に、生成されたマイクロスフィアをビーカーに移すために、チューブを出口ポートに挿入します。次に、シリンジポンプの流量を1時間あたり0.4~0.7ミリリットルに設定します。レギュレータを使用して、コンプレッサーの圧縮空気圧を調整します。
ホットプレートに磁気攪拌バー付きのガラスビーカーを置き、回転速度を設定します。シリンジポンプを操作し、外部コンプレッサで発生した圧縮空気を、電磁弁のオンオフ制御を使用してガラス瓶に供給します。デジタル顕微鏡を用いて、フローを合わせる幾何学的形状における微小球の形成と、生成されたマイクロスフェアの凝固をガラスビーカーで観察します。
微小球の形成を観察することは、この研究で微小球および微小流体系を産生する主要なプロセスであるため、最も重要なステップの1つである。これに続いて、マイクロスフェアの100マイクロリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。その後、穏やかな遠心分離機とピペットを通して上清を除去します。
100マイクロモルの最終濃度を達成するために、1X TEバッファーの100マイクロリットルを使用して、無料のプローブ修飾シアニン-3を再中断します。次に、AP共重合した微小球を含む無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に相補的プローブ修飾シアニン-3の100マイクロモルを加える。チューブを数回タップして、暗闇の中で室温で1時間混ぜ合わせてインキュベートします。
インキュベーションに続いて、上清を捨て、ピペット処理を通して残留バッファーを取り除く。その後、500マイクロリットルのTEバッファーで3回リンスします。マイクロスフィアを75 x 50ミリメートルのガラススライドに置き、イメージングの前にアルミホイルで覆います。
40倍の光顕微鏡を用いて顕微鏡計数で約25個の微小球を得る。これに続いて、テキストプロトコルに記載されているとおりに、すべての試薬を組み合わせます。サンプルをサーモサイクラーに入れ、適切な条件下で非対称 PCR を開始します。
非対称 PCR 後の上清のコレクションは、微小球を持つ単一鎖 DNA を生成する主要なプロセスであるため、最も重要なステップの 1 つです。増幅後、各サンプルに6Xローディングバッファを8マイクロリットル加えます。各サンプルの15マイクロリットルを2%アガロースゲルにロードします。
その後、1X TAEバッファーで35分間、100ボルトで電気泳動を行います。ハイブリダイズした微小球をホルダーに入れ、ホルダーを共焦点顕微鏡のステージに取り付けます。レーザーを選択し、レーザーコントロールでオンにします。
顕微鏡コントロールで対物レンズを選択します。次に、構成制御でシアニン-3およびチャネルに対して目的のフィルタを選択します。最後に、実験を開始し、サンプルを観察します。
作製されたポリマー液滴ベースのマイクロ流体プラットフォームは、2つのPDMS層から構成されています。マイクロスフィアチャネルネットワークは、流れ焦点幾何学、溶液1と2を混合するための蛇行チャネル、および微小球凝固のための重合チャネルであるマイクロスフィアの生成に使用されます。マイクロ流体プラットフォームでマイクロスフィアを生成するために、鉱物油の連続流れ用のラボベースの空気圧制御システムと溶液流用の2つのシリンジポンプが使用されました。
微小球が5素数のアクリルダイトDNAプローブで正しく機能している場合、これらの蛍光画像に示すように、ハイブリダイゼーション実験中に表面上の蛍光活性のカバレッジをもたらすはずです。共重合が正しく行われない場合、光マイクロスフェア画像は微小球内部に内部汚染を示します。DNAオリゴプローブで微小球の3D表面を操作することははるかに高速なプロセスであり、オンフローマイクロスフィア合成プラットフォームは、一本鎖DNAの増幅と精製のためのツールを提供することができます。
最初に共重合された5素数APは、その相補的なテンプレートにアニールした後のDNA重合用の3素級ヒドロキシル末端を提供する。二本鎖DNA汚染物質は、非対称PCR実験で観察された。マイクロスフィアPCRから蓄積された得られた一本鎖DNAを、ゲル電気泳動解析を通じて合成サイズマーカーと比較して実証した。
この手順を試みる際には、PCR実験の最適化に一般的に必要なプロトコルと調整に関する事前知識が、この方法で増幅サイクル、アニーリング温度、プローブシーケンスを得るために必要であることを覚えておくことが重要です。開発後、この技術は、診断と治療の分野の研究者が分子バイオテクノロジーとバイオメディシンの2つの領域をつなぐ道を開きました。アクリルアミド溶液を使用することは危険であり、手袋やラボコートを着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。
