著者の謝辞があります。

人間行列その制度審査委員会 (IRB) からの承認を得て商業ソースから購入したが、感染の危険性として扱う必要があります。使用される実験室環境安全12の文化を維持することを確認します。
1. 測定を開始する前に
<ol><li>製造元の手順13によると磁気ビーズ ERT 共役ストレプトアビジンを準備します。</li>
	<li>
品質コントロールのサンプル (QCs) の準備: スパイク (例えばプールされた髄液や血清) の種特異的なマトリックスのポジティブ コントロール抗体 (PC) (例えばNAb)。 注: FDA と EMA のガイダンスは、高および低品質管理分析バリデーション及び日常1,14のテストの準備をお勧めします。<ol>
<li>たとえば、10 μ G/ml で QC を取得するで、(例えばCSF) 関連する行列の 990 μ L にその 1,000 μ L の総ボリュームの 1 mg/mL 在庫肯定的な制御の 10 μ L を追加します。</li>
		<li>分注単一に適したボリュームで QC サンプルは (例えば、50 μ L) を使用して、-80 ° C1-60 で因数を凍結します。</li>
		<li>カット-ポイント-コントロール (CC)、単一のテスト記事 (例えばプールされた髄液や血清) と扱われない特異行列因数 (例えば、50 μ L) を使用し、-80 ° C1-60 で因数を凍結します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光体と製造元のプロトコル15に従ってタンパク質ラベリング キットを使用して専門家の抱合反応を実行します。割り切れる単一に適したボリュームでサンプル (例えば、50 μ L) を使用し、因数-60--80 ° C で凍結</li>
</ol>2 1 日目: セルめっきおよびサンプル準備
<ol><li>
細胞板の準備
	<ol>
<li>ティッシュ文化フードを使用し、次の手順のための無菌環境を維持します。70% のエタノールとフードで配置され、クリーンな環境16,17,18が維持される各オブジェクトをスプレーします。</li>
		<li>細胞分化培地 (例えば10% 胎仔ウシ血清および 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを RPMI 1640) を 37 ° C19水かビーズのお風呂で暖かい。</li>
		<li>カウント ヒト T リンパ球 Jurkat 細胞およびプレート 100 μ L/ウェル 7.5 x 105セル/mL 96 ウェル丸底で細胞培養プレート プレート ローダー装備流れの cytometer で使用する適切です。<ol>
<li>たとえば、セル20,21をカウントするのに診断または自動化された細胞カウンターを使用します。</li>
			<li>セルが少なくとも 70% を持っているを確認実験を行う前に生存率 (例えば、トリパン ブルー染色の実行可能性を評価)17。</li>
		</ol>
</li>
		<li>14-20 h のために夜通し 5% CO2と 95% 湿度 37 ° C のインキュベーターでセルを孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スクリーニング サンプル準備
	<ol>
<li>件名に希釈又は血清自由な媒体 (例えば、RPMI 1640) を使用してコントロールのサンプルを分析します。例のメソッドここでサンプル 1:2.5 RPMI 1640 年に 60 μ L のサンプルを 90 μ L の血清無料メディアに追加することで希釈します。(例えば、8 ストリップ管)。3.1 蛍光ラベルの専門家を準備する試金プロシージャのための手順に進みます。 注: 1:2.5 の希釈は実験的に決定された、ここで紹介した方法に最適です。開発は各メソッドの最適な試料の希釈を決定してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
確証ビードおよびサンプル準備
	<ol>
<li>検証サンプルに必要な専門家共役のビーズの数を計算します。<ol>
<li>例では、10 個のサンプルの使用サンプル + 30% 余分な洗浄工程中に任意の損失を補うためにあたり専門家共役ビーズ 10 サンプル x 100 μ = ERT 共役ビーズの 1,300 μ L。</li>
		</ol>
</li>
		<li>渦ビーズ徹底的に。洗浄用 15 mL の円錐管にビーズの計算の数を追加します。</li>
		<li>結合バッファーまたは (例えば0.1% ポリソルベート 20 をリン酸緩衝生理食塩水) の製造元が推奨する、1,300 μ L を追加することによって専門家共役の磁気ビーズを洗う13以下の手順します。</li>
		<li>渦管徹底的に。2 分間磁気管ラックにチューブを置きます。ビーズを乱すことがなく慎重に吸引し、上澄みを廃棄します。 注: オフにビーズが磁石に引っ張られるときに褐色からソリューションになります。</li>
		<li>バッファーを結合の 1,300 μ L でビーズを再懸濁します。合計 4 つの洗浄の洗浄手順を繰り返します。</li>
		<li>最終的な洗浄後 (以前 2.3.1.1 のステップで計算された) バッファーを結合の 1,300 μ L でビーズを中断します。96 ウェル、白、丸底によく、プレート マップ (例えば、1 つのサンプルまたは QC あたりも検証; 蛍光ラベル ERT で培養したときに、重複分割サンプルが) によると非バインド ポリプロピレン板あたり 100 μ L を追加します。</li>
		<li>96 ウェル側スカート付きマグネット プレートを置き、ペレットを形成するためにビーズを許可します。慎重に明確な上清を吸引し、それを破棄します。 注: ソリューションになります暗いから茶色側スカート磁石の約 1-2 分後に明らか。得られたビーズは、「ドライ」ビーズと呼ばれます。</li>
		<li>サンプルは肯定的なスクリーニングし、確認されているが、適切な割り当てられたにも ERT 共役ビーズと各サンプルを 100 μ l 添加するを追加します。プラスチック フィルムでプレートをシールし、シェーカーは室温 (RT) で約 800 rpm 上少なくとも 60 分間振る。 注: 以前の準備し、正と負を冷凍 QCs と CC が含まれますすべてのプレートに。</li>
		<li>、孵化後 96 ウェル側スカート磁石に確証のプレートを置き、ペレットを形成するためにビーズを許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
価希釈系列の作製
	<ol>
<li>価シリーズを準備、連続カット ポイント1所定の価を横断する十分な回数のプールのマトリックスのサンプルを希釈します。</li>
		<li>たとえば、60 μ L 8 希釈 (例えば、8 ストリップ管) の合計のための 1:3 希釈系列でプールされたマトリックスのサンプルの 30 μ L をミックスします。3.1 蛍光ラベルの専門家を準備する試金プロシージャのための手順に進みます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 1 日目: 試金プロシージャ
<ol><li>
(例えば、60 μ L まあ、または約 6 mL/プレート/) 無血清培地で蛍光ラベル ERT を準備します。
	<ol>
<li>たとえば、1 μ g/mL の 10 mL を準備する蛍光標識は ERT ストック 1 mg/mL の 10 μ L を追加蛍光標識血清自由な媒体 (例えば、RPMI 1640) 9.99 mL に専門家レビュー チーム。</li>
	</ol>
</li>
	<li>新しい培養プレート (例えば、96 ウェル、白、丸底、拘束力のないポリプロピレン プレート)、追加作製した試料からステップ 2.2、2.3、または 2.4 および重複する井戸 (例えば、それぞれの転送 60 μ L の 1:1 混合物の蛍光ラベルの専門家サンプルを準備し、60 μ L/ウェル蛍光ラベル ERT を追加)。 注:図1 実験プレート マップの例が提供されます。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig1.jpg"> 図 1: 実験板レイアウトの例です。サンプルおよび蛍光標識 ERT は、2-8 ° C で夜通し孵化しました。高品質管理 (HQC)、低品質管理 (LQC)、負の品質管理 (NQC) などのコントロールは、上映され、プレートの均一性を評価するためにプレートの反対のコーナーで確認します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="3"><li>マルチ チャンネル ピペットを上下に数回をピペットでサンプルと蛍光標識 ERT を混ぜます。ホイルは、プレートをラップし、14-20 h の 2-8 ° C でそれらを一晩インキュベートします。</li>
</ol>4 2 日目: 作製した試料をセルに追加します。
<ol><li>2-8 ° C に加温からサンプルの培養プレートを外し、プレートを 10-15 分の 37 ° C でビーズのお風呂に置くことによって暖かい。</li>
	<li>CO2インキュベーターからセルを削除します。めっきされたセルのセルが井戸17,19全体健康と均等に配置された表示されるように倒立顕微鏡を使用しての目視チェックを実行します。</li>
	<li>板実験地図によるとセル板に以前混合試料の蛍光ラベル ERT 100 μ L を追加します。</li>
	<li>37 ° C で CO2インキュベーターに戻って追加のサンプル細胞プレートを置き3 h と ± のプレートをインキュベート 15 分。 注: 今回は、アッセイの信号対ノイズ応答に最適としてラボで設立されました。</li>
	<li>遠心分離機の 14-18 ° C で卓上遠心分離機で 320 x gで 6 分のセル板プレートのウェルの底で細胞ペレットの存在を確認します。</li>
	<li>プレートを 30 ~ 45 ° の角度で保持します。細胞ペレットを乱すことがなく各ウェルから上澄みを慎重に取り外します。各ウェルに、細胞を再懸濁します細胞ペレットに 1 x DPBS の 200 μ L を追加します。</li>
	<li>セル洗浄 3 洗浄の合計のための手順を繰り返します。細胞生存率の染色は、手順 5 に進んでください。</li>
</ol>5 2 日目: セル実行可能性の染色
<ol><li>マルチ チャンネル ピペットを使用して、蛍光標識 ERT は、異なる波長を選択し、製造元の手順22に基づき、各ウェルに 100 μ L ライブ/デッド汚れ x 1 の実用的なソリューションを追加します。</li>
	<li>暗闇の中で常温 15 分間プレートを孵化させなさい。14-18 ° C で卓上遠心分離機で 320 x gで 6 分のプレートを遠心分離します。</li>
	<li>細胞ペレットを乱すことがなく各ウェルから上澄みを慎重に取り外します。洗浄セル 1 1 x DPBS と x。</li>
</ol>6. 2 日目: 固定 1% パラホルムアルデヒドとセル
<ol><li>マルチ チャンネル ピペットを使用して、各ウェルに 100 μ L 冷蔵 (2 ~ 8 ° C) での 1% パラホルムアルデヒド (PFA) を調剤します。</li>
	<li>シール プレートと優しくパルス渦をミックスします。ホイルは、プレートをラップし、固定のために少なくとも 10 分 2-8 ° C に配置。 注: プレート シールに水しぶきを避けるように注意します。</li>
	<li>分析の前に上下にマルチ チャンネル ピペットを使用して各ウェルに 1 x DPBS の 50 μ L を追加します。</li>
</ol>7. フローサイトメトリー
<ol><li>プレート ローダーと流れの cytometer でプレートを置き、それらを実行します。</li>
	<li>取得し、流れの cytometry のソフトウェアを使用して測定の平均蛍光強度 (MFI) を記録 (材料の表を参照してください)。 注: は、ブートローダーの設定の例として図 2を参照してください。サンプル フロー レート、サンプル ボリューム、ボリューム、混合の速度、およびミックスの数を混合は、このアッセイに最適です。これらの基準は、流れ cytometry 集録ソフトウェア23によって、条件ごとに、番号の横に「矢印」をまたは「ダウン」ボタンを使用して調整できます。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig2.jpg"> 図 2: 流れの cytometer ブートローダーの設定の例です。ブートローダーの設定を最適化して開発されたそれぞれの試金のためください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="3"><li>プロットの作成、cytometer分析/ゲート/図 3に示すように。 注: ゲートの作成とアプリケーションは、各流れの cytometry ソフトウェア23のため異なる場合があります。</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig3.jpg"> 図 3: フローサイトメトリー戦略をゲーティングします。Jurkat 細胞はイベントの総数から分離され、側方散乱 (SSC) チャンネルと前方散乱 (FSC) をプロットし、ターゲット人口のまわりのゲートを描画によって収集されました。ダブレットから分離したシングレット (単一セル) またはより大きいセルの集計 FSC 領域を使用して (FSC-A)、FSC 高さ (FSC H) チャンネル。生きているセルは、一重項細胞生存の汚れのため負のゲートによって選ばれました。平均蛍光強度 (MFI) シングル、ライブ Jurkat 細胞で測定し、, ヒストグラムとしてプロットされます。薬物吸収と細胞の MFI の値 (例えばHQC) ブロックし、制御と細胞の吸収量が示されている (赤と青、それぞれ)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="4"><li>死んだ細胞を解析から除外し、23のおよそ 10,000 のイベントを記録します。</li>
</ol>8. データ分析
<ol><li>(生 MFI) データを解析ソフトにエクスポート (材料の表を参照してください)。 注: 必要な分析によって次のデータ分析を実行できること解析ソフトウェア。</li>
	<li>平均 (QCs とサンプル) 重複する井戸の MFI との変動 (CV %) 平均から重複のスプレッドの変動を評価する係数を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq1v2.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq2v2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq3v2.jpg">
</li>
	<li>サンプルおよびアッセイに上映された QCs を計算の割合信号抑制 (%si) の平均の MFI を基準にして、QCs プールされたマトリックス CC。 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq4v2.jpg">
</li>
	<li>必要な場合は、確認の QCs とサンプル画面の対応する値を基準にして回復率 (Rr) を計算します。 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq5v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
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著者は、従業員と BioMarin 製薬株式会社の株主

CI M6PR を通じて専門家レビューチー ム吸収を防ぐ中和抗体等専門家の安全性や有効性の1に影響を与える可能性があります。そのため、薬剤の作用機序に関連する堅牢なモデルを用いた対象試料中 NAbs を評価することが重要です。我々、および他のいくつかの生物検定フォーマット(例えば、受容体の二量体化、ルシフェラーゼ発現等)の性能が測定精度、再現性、および感度の健康機関の推奨事項と整列していないことを発見しました。29. NAbs ライソゾーム ERT 取り込みに固有を監視するここで説明する生物検定法、内因性 CI M6PR エクスプレス Jurkat 細胞を採用します。流れ cytometry 読み出しと組み合わせると、このアッセイは、適切な測定精度、感度、再現性、および高いサンプル スループットと生理的細胞モデルを使用します。検出をつかまえる流れの cytometry 読み出しもに適用されている他の徴候。たとえば、E 型肝炎・ アデノ随伴ウイルス (AAV)30,31に対する既存の抗体を検出する方法が開発されています。
プロトコルの重要なステップは、適切な蛍光体、セル実行可能性の十分なレベルを確保し、インキュベーション時間を厳守は、アッセイの感度をモニター、LQC を組み込むことを選択できます。ここに示す例では、(例えば、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647 とサイファー 5 e) fluorophores が付いては、ライソゾームの専門家、彼らのパフォーマンスでは様々 に共役。これも明るい蛍光テスト32、Alexa Fluor 647 アッセイ開発さらに選ばれました。いくつか fluorophores が付いてが最高の感度とダイナミック レンジを提供するために試金の開発の早い段階で評価することをお勧めします。サンプル テスト中に測定感度は、十分なテストを実行1の 1% それ失敗する感度限界に近い LQC を含む監視しなければなりません。HQC、と共に、LQC がまた時間3以上のアッセイ ドリフトを監視する QC システム適合性の役割を果たします。最適なセル実行可能性とパフォーマンスは、シングル使用因数の細胞バンクの準備と匹敵する QC 結果3,18に基づいて新しい細胞バンクでの予選によって実現されます。薬物吸収の薬剤は細胞培養時間と増加するのでセル、蛍光体共役薬物インキュベーション時間が一貫した分析パフォーマンスの中心も。、薬物吸収の日々 の変動を最小限に抑えるプールされたマトリックス コントロールのサンプル (例えば、上記の方法でカット ポイント コントロール サンプル) 各プレート上にサンプル データを正規化する場合があります。この方法で一貫性のあるデータを生成のもう一つの重要な要因は、プレート均一性を監視して可能なエッジ効果を最小限にすることです。最初の実験は、アッセイ検証 (例えば精度と確度)1時より信頼性の高い実験を行うことができる間、単一 QC を使用して全体の板経由で試金の実行などがあります。これはプレート マップ レイアウト33の重要性を示しています。プレート マップの例のように、品質コントロールのサンプルは売れ行きジェニングス グラフ34時間の経過と共に追跡できます均一プレート モニターの両側に配置。
この試金は、NAbs とリソソームの ERT の吸収を阻害する可能性がその他の要因を監視、一方、抗体による吸収抑制を確認する追加実験を行うことができます。1 つのオプションは、A/G/L、非特異免疫グロブリン35を結合する蛋白質のサンプルを扱うことです。サンプルは、タンパク質 A/G/L の枯渇後の肯定的なテストを続け、非抗体抑制因子は薬物の吸収をブロックするための責任にあります。ここで説明する方法は、抗体の吸収抑制、および肯定的な制御と非抗体抑制因子による対象試料の割合が高いが見つかった場合、パラメーターを見直す必要がある他のアッセイを測定する設計されました。
アッセイには、薬剤の作用機序に基づく適切な細胞内コンパートメントに蛍光標識薬物伝送を実証するさらに特徴があります。ここに示す例では、細胞表面に CI M6PR をバインドし、リソソームにトラフィックに、ERT は期待されます。以前報告したことを示すいくつかの実験の結果ほぼすべてリソソーム8の蛍光ラベル専門家レビュー チームからメソッドの結果にみられる蛍光信号の.ERT の蛍光標識信号が次のサイトカラシン B、アクチン再編成の阻害により内面化を混乱させると細胞の治療除去されたが分かった。また、4 ° c、セルを配置することによって外部 fluorophore トリパン ブルーと鈍化している内面を急冷実験を示す蛍光ラベル ERT は急速に内面化し、非常に小さな蛍光は細胞表面でバインドされている専門家レビュー チームによるもの。リソソームのターゲットは、共焦点顕微鏡を用いた蛍光体共役薬物と pH に敏感な lysotracker 色素の共局在を可視化によって確認されました。CI M6PR の取り込みの特異性は、ラベルの付いた薬受容体結合と競合する外因性 M6P を使用しても検証可能性があります。同様の実験は、摂取動態と他のアッセイの fluorophore 共役薬物の細胞局在を確認する実行必要があります。
この細胞に基づく試金のプラットフォームは、NAbs を CI M6PR 受容体を介したエンドサイトーシスを活用した治療薬の研究に使用されています。我々 は最近、elosulfase アルファ36,37NAb と薬物効果の開発の間の相関関係を示さなかったこのアッセイプラット フォームを使用して、結果を報告しました。臨床検体検査、アッセイの感度、精度、選択性、特異性、薬物耐性、堅牢性を含むパラメーターのアッセイを検証し、カットのポイント、確立された guidances3,によると評価されるべき4. それも留意され、ライソゾーム ERTs の NAbs が酵素の触媒部位付近のバインディングによって薬の活動に干渉する可能性を開発します。一般的には、リソソームの過酷な酸性で蛋白分解環境は抗体専門家の相互作用2,39,40に有利ではないので、優先順位の低いする NAb のこのタイプの監視と考えています。ただし、プロテアーゼ耐性 NAbs 存在、薬40の触媒の部分を抑制することが可能です。このアッセイ モニター蛍光ラベル ERT への取り込み、リソソームとアッセイの限界はプロテアーゼ耐性 NAbs を監視することができません。NAb のこのタイプが安全性や有効性のデータに基づいて疑われる専門家レビュー チームの活動を監視するアッセイを開発し、サンプルをテストするために使用ください。
免疫原性の評価は、NAbs の薬の安全性と有効性に及ぼす影響を理解する上で重要です。NAbsの in vitro薬物吸収経由CI M6PR を阻害できるの同定は、民放連の活動で生体を理解するための機会を提供します。ここで紹介した方法は、ERT のリソゾーム細胞取り込みの fluorophore 共役の干渉を測定する CI M6PR を表現するひと細胞ラインを利用しています。このメソッドは、ライソゾーム病の治療に意図したいくつかのアーツ NAbs を監視する既に使用されています。このアッセイプラット フォーム可能性があります勉強 NAbs に及ぼす生物学的治療の適切な関数の細胞の内面化を必要とするその他のメソッドに適用されます。

免疫原性評価は、安全性と効果監視 ERTs を含むすべての生物学的治療製品のプログラムの重要な部分です。患者は、薬の安全性、有効性、および薬物動態/薬力学プロファイルに直接影響を与えることができます免疫応答を開発可能性があります。NAbs と呼ばれるこれらの ADA のサブセットは 2 つの方法で専門家レビュー チームの有効性を阻害する可能性が: 標的細胞または専門家の触媒活性を阻害することによって専門家の取り込みの阻害を介して。ここで紹介した方法は、セルに ERT 吸収を妨げる NAbs を測定する設計されています。治療専門家の安全性を完全に監視、NAbs の継続的な監視が臨床転帰と1の薬力学的影響の潜在的な相関の解明に不可欠です。
セルベース、酵素活性やリガンド結合アッセイ1NAbs タンパク質医薬品に対して評価を行うためのプラットフォームが含まれます。最適な分析プラットフォームは、さまざまな条件に基づいて選択されます: 治療製品、アッセイ プラットフォーム感度、選択性、精度、および重要なは、その能力の抑制の作用を模倣するの作用機序は、生体内でNAbs.リガンド結合法は、特定のケースで適切な可能性があります (例えば、該当のセルの行を識別できない場合、または細胞ベースのアッセイで適切な感度を達成することはできません)。しかし、業界の文書および他の業界標準のホワイト ペーパーの 2016年ドラフト FDA ガイダンス、セルベースの NAb の試金、彼らはより良いことがありますのでお勧め反映1,2 体内薬物の生物学的メカニズム,3。
Cytometry 流れセルベースの NAb アッセイを開発するための重要なコンポーネントは、薬物刺激、サロゲートの肯定的な制御に対応する適切なセルライン専門家、fluorophore 共役の専門家、生物学的テスト種を中和する NAbマトリックス4,5,6。セル行の選択範囲はアクションの ERT のメカニズムに依存して、アッセイ開発3段階複数細胞で評価します。ここで説明したメソッド、Jurkat T 細胞は細胞表面でほとんど抗体7,8 の Fc 領域を無差別に結合する抗体フラグメント受容体 (FcRs) の欠如、内因性 CI M6PR 式の選ばれました。.アッセイ開発中に検証研究と患者検体検査、血清テスト記事1と扱われていない個人からプールなどの否定的な制御を確立することが重要です。細胞は、薬品開発1の非臨床試験、臨床試験、および市販の段階で継続性のための異なる種から関連する行列を耐える必要がありますも。別のコンポーネント試験の陽性対照の選択であります。ERT セル吸収試金のための肯定的な制御は、治療にバインドし、CI M6PR9,1を取り込みを中和する能力に基づいて選ばれました。特に稀な疾患の患者集団2でのアッセイ コントロールとして使用するための被験者から中和抗血清の役に立つか持続可能な量を得ることが困難が多い。選択肢には、ハイパー免疫動物、またはアフィニ ティー精製ポリクローナル、モノクローナル抗体アッセイ関連行列1にスパイクから血清が含まれます。種特異的なマトリックスを使用している間抑制因子抗体マトリックスの存在以外は ERT の取り込みを阻害することが可能です。アッセイのもう一つの重要なコンポーネントは、fluorophore 共役専門家です。明るさ、pH 安定性、流れの cytometer に他のチャンネルに潜在的なスペクトル重複の分析の必要性に基づいて、各専門家の専門家活用の fluorophore の選択を評価します。
ここで説明アッセイは、携帯経由でCI M6PR に入るの専門家などの治療用タンパク質に NAb の測定例です。いくつか ERTs、ライソゾーム疾患 (Lsd) の治療、Morquio A 症候群、cerliponase アルファ CLN2 ばってん病、ファブリー病のためアガルシダーゼ アルファ elosulfase アルファを含むセル吸収およびリソソームをターゲットに、この経路を利用するためのものとポンペ病10、11alglucosidase アルファロメオ。このメソッドの目的は、薬物結合と内面化経由CI M6PR を妨げる NAbs の相対的なレベルを測定することです。これは階層型のスクリーニング、検証と力価で実行されます手順3。サンプルは最初 NAb 陽性上映され、検証手順で肯定的な入力し、確認します。最後に、抗体価1を生成する連続画面し、肯定的な確認のサンプルを希釈する可能性があります。フローサイトメトリー薬物吸収に位置するこのセルベースの流れの試金は、薬物の薬理学的プロファイルに影響を与える薬剤特異 NAbs を測定の敏感で、機械論的に関連する生体外でメソッドを提供します。以前、メソッドを検証し、このプラットフォームを用いた薬物 elosulfase アルファ8臨床サンプルをテストします。ここで他の治療用タンパク質または ERTs に適用できる詳細なステップバイ ステップ プロトコルについて述べる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter unit, 500 mL vacuum filter flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom 96-well culture plates</td>
			<td>Thermo-Nunclon</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reagent reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white round bottom polystyrene microplate plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator tube rack</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc</td>
			<td>VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD High Throughput Sampler (HTS)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar Microcentrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C1413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture CO2 incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>Purifier Cell Logic +</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB152&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M270 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 1X Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10491-01-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (100X) liquid formulation</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Para-formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15735-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid)</td>
			<td>Bioreclamation IVT</td>
			<td>request a quote from website</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Polyester Plate Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal &#38; Sample Aluminum Foil</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>538619</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay

酵素補充療法 (ERTs) の管理および他の生物学的治療法の患者は、麻薬免疫反応を引き出すことがあります。特にその中和抗体 (NAbs) と呼ばれる薬の生物学的活性を中和する可能性がありますこれらの反薬物抗体 (ADA) の特性はこれらの抗体の医薬品の影響を理解する上で重要です薬理学的プロフィール。このプロトコルでは、行列の人間の代表のライソゾーム ERT の細胞内取り込みを中和する要因を検出する細胞ベースのフロー フローサイトメトリー法について説明します。プロトコルは 3 つの手順で構成されています: スクリーニング、検証手順、および検出するため抗体アッセイの識別、および対象試料中の抗体を中和の相対的なレベルを確立します。
このメソッドのサンプル、fluorophore 共役 ERT 製品と混合まず [例えば、ヒト T リンパ球 (Jurkat 細胞)] 細胞表面カチオン依存しないマンノース 6-リン酸受容体 (CI M6PR) を表現する細胞を培養し、最後に、流れの cytometer で解析。一方、NAbs の存在は薬にバインドし、CI M6PR バインディングと吸収を妨げる NAbs なしサンプルは、fluorophore 共役 ERT 製品を介して、CI M6PR の取り込みになります。Jurkat 細胞によって内面の fluorophore 共役 ERT 量フローサイトメトリーを用いて、代表的な薬物純真なマトリックスの存在下で取得した応答と比較して割合 (%) の信号抑制として評価。検証の手順でサンプルが細胞培養 (NAbs) など薬に結合する薬物固有の要因を使い果たす ERT 共役磁気ビーズで。サンプル画面、アッセイの薬剤特異 NAbs の肯定的な確認は、抗体を生成するは連続希釈します。半定量的な抗体薬の安全性と有効性の測定と相関しています。

メソッドの最初の日、Jurkat 細胞の冷凍因数は解凍され、メッキとテスト サンプルを作製しました。プレート マップの例を図 1に示します。2 日目、サンプルは Jurkat 細胞と混合され、約 3 時間 15 分の 37 ° C で培養したことができます。セルされた洗浄、PFA と固定し、流れの cytometer で分析します。図 2は、例の流れの cytometer 設定を示します。
戦略をゲーティング フローサイトメトリーはライブ シングル Jurkat 細胞24 (図 3) の fluorophore 共役薬物の量を測定する設計されました。細胞の残骸を除外ゲートを描画することによって細胞の破片から分離 [通常、低い前方散乱 (FSC)] と死んだ細胞 [通常、ハイサイド散布 (SSC)]、分析25生きているセルだけを残してします。単一のセルは、FSC の高域および低 FSC 高さ26を除く、ゲートを描画することによって細胞塊から分かれていた。そのままな膜なし、死亡または不健康な細胞生存率汚れと扱われた細胞・付加ゲート22死んだ細胞を除外します。生きている単一セルの MFI は、fluorophore 共役 ERT 吸収の解析に使われました。スクリーニング アッセイ結果の可能性の例として行列のサロゲート抗薬物抗体陽性対照 [例えば、高品質管理 (HQC)] の高量のスパイク抑制 fluorophore 共役 ERT の取り込み、低 MFI の結果約 300 (図 3)。対照的に、肯定的な制御の抗体の不在でマトリックスと培養細胞より高い MFI が必要 (MFI =図3 37,830)、fluorophore 共役 ERT の吸収を示します。
中和のポジティブ コントロール抗体例えばここが選ばれた (すなわち、CI M6PR を通じて専門家レビューチー ム吸収) 薬の作用メカニズムに基づいています。Fluorophores のパネルもテストされ最適なアッセイの感度とダイナミック レンジ1の比較します。サイファー 5 e は、薬27のライソゾーム ターゲットの追加策としていくつかのアーツに関連する可能性もある酸性 pH でその増加の蛍光によりテストされました。緑色の蛍光染料 (例えば、 Alexa Fluor 488) と遠赤色蛍光色素 (例えば、Alexa Fluor 647) を調べた。どのように異なる蛍光物質の例を実行可能性があります図 4 aおよび4 bで提示されます。例では、Alexa Fluor 647 ERT は (例えばPC の最低濃度の高い %si) 優れた感度、広いダイナミック レンジ (~ 3 桁) による最高のパフォーマンスをしていた。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig4v2.jpg"> 図 4: 異なる fluorophore ERT 抱合体結果の例です。(A) アッセイ開発中に肯定的な制御 (PC) 希釈曲線は異なる蛍光体共役のアーツを使用して評価すべき。6.25 μ g/mL で 2 つの fluorophore 共役 ERTs (Alexa Fluor 488 とサイファー 5 e) と明るい蛍光体共役 ERT (Alexa Fluor 647) 1.56 μ G/ml でここに示す例では陽性コントロール NAbs 濃度の増加の存在下でテストされました。Alexa Fluor 647 共役 ERT を使用してダイナミック レンジの大幅な増加を見るに MFI を使用してこのパネル (B) ショー Aのパネルから曲線がグラフ化されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
記載されているメソッドは、検出、確認および準定量的レベル NAb 価3の補間の階層型アプローチです。アッセイは、アッセイの感度、精度、選択性、特異性、薬物耐性、堅牢性を含むパラメーターの検証の準備ができてによるとカット点を評価すべきを確立するには、設立ガイダンス1,3.
スクリーニング カット ポイント (SCP) より大きい値は %si が得られたとき、サンプルをこのアッセイで肯定的な潜在的と考えられていた。SCP は、代表的な人口から薬物純真なサンプルをテストし、測定信号強度 (SI)3の相対的な減少によって統計的に決定されました。ガイダンス (FDA) のインスタンスの推奨する SCP は正規分布のデータ セットの 95 パーセンタイルで確立され、SCP の計算方法がされている1で詳しく別の場所で説明します。SCP の以上のアッセイの信号 (%si の増加として測定) が低下するサンプルは潜在的に陽性であることを決意したと SCP より高い結果とサンプル (なしで変更または SI % の減少) 負の値と見なされます。
スクリーニング陽性 (SCP 上 %si) サンプルは、ERT に NAbs の特異性を決定する検証的試験でテストされました。検証的試験は、あらかじめ薬剤特異抗体または抑制因子を削除する ERT 共役磁気ビーズのサンプルをインキュベートによって行われました。RR (MFI をスクリーニングする確証の MFI の比) をサンプルから除外して NAbs の数を決定する評価しました。RR 陽性 [すなわち、確証のカット点 (CCP)] の計算されたしきい値を上回るには、麻薬 NAbs の存在が示されました。スクリーニング アッセイのように CCP が最初確証試験で代表的な人口からの未治療のサンプルを評価することによって確立されます。CCP は統計的に決定された 1% の偽陽性率に基づき、しきい値は積極的に確認された例 (図 5)3を指定します。
上映し、肯定的な確認サンプル連続希釈され相対レベルまたは NAbs の各サンプルの抗体価を決定する力価試験でテストします。それは [例えば、カット ポイント (TCP) 価] 指定のしきい値を超えたとき、サンプル テスト肯定的な最高の希釈は、サンプル価 (図 5)1,3です。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig5.jpg"> 図 5: テスト結果例サンプル。これらのパネル表示テスト サンプルの例正または負 17.51% の SCP の上下いずれかのスクリーニングによって SI。肯定的なサンプル、試金テスト前にサンプルから薬剤特異抗体を破壊する薬物共役磁気ビーズを用いた確証試験でテストされました。験のカット ポイントを超える回収率 (RR) とサンプル (すなわちRR = 1.315) 肯定的な確認が考えられていた。肯定的な確認を希釈した信号交差価点のサンプルの結果に等しい価価 (希釈倍率) カット ポイントを確立する (TCP) をカットするまで。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
1 つ以上のアナリストと数日間測定再現性と可変性がテストされました。QCs が当初 1 つのバッチで準備し、1 x 用サブ避けよう。3 d のコースで、2 人のアナリストの QCs アッセイの精度を示すためのいくつかのセットの試金実行。表示例データの QCs の間、イントラ検定精度の CV % は CV % < 20% (図 6)1の FDA ガイダンスの勧告よりも少ないです。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig6.jpg"> 図 6: 2 人のアナリストの 3 日間を生成された QC 精度データの例です。高精度データの分散分析 (ANOVA) ダイニングらで提示される式を使用してによって計算しました。28. 内-バッチ (内) および (実行) との間の間のバッチ統計 % 品種として報告されます<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

中和抗体や血清や脳脊髄液 (CSF) など、行列の人間の酵素補充療法の細胞内取り込みを妨げるその他の要因を検出する細胞ベースのフロー フローサイトメトリー法をご紹介します。

細胞に基づく試金の酵素補充療法の細胞内取り込みを中和する抗体の検出

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

detection-antibodies-that-neutralize-cellular-uptake-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.7K ビュー.  BioMarin Pharmaceutical Inc. 中和抗体や血清や脳脊髄液 (CSF) など、行列の人間の酵素補充療法の細胞内取り込みを妨げるその他の要因を検出する細胞ベースのフロー フローサイトメトリー法をご紹介します。

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Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

酵素結合Immunospotアッセイ（ELISPOT）：微生物の抗原に対してのTh - 1細胞​​性免疫応答の定量化

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

免疫・感染学

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

赤痢アメーバのDNAとtRNAメチルトランスフェラーゼDnmt2（Ehmeth）酵素を用いたin vitro tRNAのメチル化アッセイに

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

C型肝炎ウイルスに対するヒトラクトフェリンの細胞取り込みおよびそれに関連する抗ウイルス活性を監視するために、免疫蛍光

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

レポーター酵素蛍光を用いたマウスにおける結核菌をイメージング

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリン アイソタイプ反応の評価

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully investigate MCPyV molecular biology and oncogenic mechanisms have been hampered by a lack of adequate cell culture models. Here, we describe a set of protocols for performing and detecting MCPyV infection of primary human skin cells. The protocols describe the isolation of human dermal fibroblasts, preparation of recombinant MCPyV virions, and detection of virus infection by both immunofluorescent (IF) staining and in situ DNA-hybridization chain reaction (HCR), which is a highly sensitive fluorescence in situ hybridization (FISH) approach. The protocols herein can be adapted by interested researchers to identify other cell types or cell lines that support MCPyV infection. The described FISH approach could also be adapted for detecting low levels of viral DNAs present in the infected human skin.

Here, we present a protocol to infect primary human dermal fibroblast with MCPyV. The protocol includes isolation of dermal fibroblasts, preparation of MCPyV virions, virus infection, immunofluorescence staining, and fluorescence in situ hybridization. This protocol can be extended for characterizing MCPyV-host interactions and discovering other cell types infectable by MCPyV.

メルケル細胞ポリオーマ ウイルス感染と検出

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...