Yazarlar hiçbir ilgili kaynaklar var.

İnsan matrisler ticari kaynaklardan onaylı onların kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) üzerinden satın alınan ama kadar potansiyel bulaşıcı değerlendirilmelidir. Kullanılan laboratuvar ortamı bir kültür Emanet12tutar emin olun.
1. tahlil başlamadan önce
<ol><li>ERT Birleşik streptavidin manyetik boncuklar üreticinin yönergeleri13göre hazırlayın.</li>
	<li>
Kalite kontrol örnekleri (QCs) hazırlamak: species-specific matris (Örneğin, havuza alınan CSF veya serum) olumlu denetim antikor (PC) (Örneğin, bir NAb) spike. Not: Bir yüksek ve düşük bir QC tahlil doğrulama ve1,14testi rutin için hazırlık FDA ve EMA Kılavuzu önerir.<ol>
<li>Örneğin, bir QC 10 µg/mL, elde etmek için toplam hacmi 1000 µL için (Örneğin, CSF) ilgili matris 990 µL 1 mg/mL stok pozitif kontrol 10 µL ekleyin.</li>
		<li>Aliquot QC örnekleri için tek bir uygun bir hacim içinde (Örneğin, 50 µL) kullanın ve aliquots-80 ° C1-60, Don.</li>
		<li>Aliquot bir kesme noktası-kontrol (CC), species-specific matris için tek bir test Makale (Örneğin, havuza alınan CSF veya serum) ile tedavi değil (Örneğin, 50 µL) kullanın ve aliquots-80 ° C1-60, Don.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fluorophore ve üreticinin iletişim kuralı15göre bir protein-etiketleme kit kullanarak ERT arasında konjugasyon tepki gerçekleştirin. Aliquot örnek için tek bir uygun bir hacim içinde (Örneğin, 50 µL) kullanın ve aliquots ile-80 ° c -60, dondurma</li>
</ol>2. gün 1: Hücre kaplama ve numune hazırlama
<ol><li>
Hücre plaka hazırlık
	<ol>
<li>Doku kültürü kukuIeta kullanın ve aşağıdaki adımları için aseptik bir ortam sağlamak. % 70 etanol ile örtünün yerleştirilir ve temiz çevre16,17,18korumak her nesne sprey.</li>
		<li>Hücre büyüme orta (Örneğin, RPMI-1640 ile % 10 fetal Sığır serum ve % 1 penisilin-streptomisin) 37 ° C19bir su veya boncuk banyoda sıcak.</li>
		<li>Hücre kültür plaka üzerinde bir plaka yükleyici ile donatılmış bir akış sitometresi kullanımına uygun sayımı insan T lenfositleri Jurkat hücre ve plaka 100 µL 7.5 x 105 hücre/mL içinde bir 96-şey yuvarlak-dip kuyuda başına.<ol>
<li>Örneğin, bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç hücreleri20,21saymak için kullanın.</li>
			<li>Hücreleri en az % 70 olması canlılığı deneme işlemine devam etmeden önce (Örneğin, trypan mavi boyama ile canlılık değerlendirmek)17.</li>
		</ol>
</li>
		<li>14-20 h için gecede bir 37 ° C kuluçka makinesi-%5 CO2 ve % 95 nem ile hücrelerde kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Numune hazırlama eleme
	<ol>
<li>Konuyu sulandırmak veya serum-ücretsiz medya (Örneğin, RPMI-1640) kullanarak denetim örnekleri tahlil. Örnek yönteminde buraya örnekleri 1:2.5 RPMI-1640 yılında örnek 60 µL serum-ücretsiz medya 90 µL için ekleyerek oranında seyreltin. (Örneğin, 8 şerit tüpler). Adım 3.1 fluorophore etiketli ERT hazırlamak tahlil yordamı için devam edin. Not: 1:2.5 seyreltme deneysel olarak belirlendi ve burada sunulan yöntemi için en uygunudur. En iyi örnek dilutions geliştirilen her yöntem için tespit edilmelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doğrulayıcı boncuk ve örnek hazırlama
	<ol>
<li>ERT Birleşik boncuk Doğrulayıcı örnekleri için gerekli sayısını hesaplayın.<ol>
<li>Örnek, 10 örnekleri için kullanmak için 10 örnekleri x 100 µL ERT Birleşik boncuk örnek + % 30 fazladan herhangi bir kayıp için yıkama adımında telafi etmek için 1.300 µL ERT Birleşik boncuk =.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Girdap boncuk iyice. Yıkama 15 mL konik tüp boncuk hesaplanan sayısını ekleyin.</li>
		<li>ERT Birleşik manyetik boncuklar 1.300 µL kaplin arabellek veya (Örneğin, % 0,1 polysorbate 20 serum fosfat tamponlu ile) üretici tarafından önerilen olarak ekleyerek yıkama tabi belgili tanımlık merdiven altında13.</li>
		<li>Girdap tüp iyice. Tüp bir manyetik tüp raf 2 min için yerleştirin. Boncuk bozmadan, dikkatle Aspire edin ve süpernatant. Not: Çözüm için mıknatıs boncuk çektiğimde temizlemek için koyu kahverengi dönecek.</li>
		<li>Boncuk arabellek kaplin 1.300 µL ile resuspend. Toplamda dört yıkama yıkama adımları yineleyin.</li>
		<li>Son yıkama sonra (daha önce adım 2.3.1.1 hesaplanır) arabellek kaplin 1.300 µL boncuk askıya. İyi bir 96-şey, beyaz, yuvarlak alt için bağlayıcı olmayan (Örneğin, bir de örnek veya QC başına doğrulama; ne zaman fluorophore etiketli ERT ile inkübe çoğaltmaları bölünmesi örnek olacak) levha haritaya göre Polipropilen plaka başına 100 µL ekleyin.</li>
		<li>Plaka bir 96-şey yan etekli mıknatıs yerleştirin ve boncuk bir Pelet oluşturmak sağlar. Dikkatle net süpernatant Aspire edin ve bunu. Not: Çözüm karanlıktan yan etekli mıknatıs üzerinde yaklaşık 1-2 dk sonra açık kahverengi için dönecek. Elde edilen boncuk boncuk "kuru" adı verilir.</li>
		<li>Örnekleri olumlu ekranlı ve teyit vardır, uygun/atanmış her örneğinin ve ERT Birleşik boncuk olmadan 100 µL de ekleyin. Bir plastik film ile plaka mühür ve en az 60 dk (RT) Oda sıcaklığında yaklaşık 800 rpm'de döner bir shaker tarih için salla. Not: Daha önce hazırlanan ve pozitif ve negatif donmuş QCs ve CC her plaka üzerinde bulunmalıdır.</li>
		<li>Kuluçka sonra 96-şey yan etekli mıknatıs üzerinde Doğrulayıcı tabak yerleştirin ve bir Pelet oluşturmak boncuk sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Titresi seyreltme serisi hazırlık
	<ol>
<li>Titresi serisi hazırlamak için seri olarak havuza alınan matris kez kesme noktası1önceden belirlenmiş titresi geçmeye yeterli sayıda örnek oranında seyreltin.</li>
		<li>Örneğin, örnek için havuza alınan Matrix 1:3 seyreltme Serisi 8 dilutions (Örneğin, 8 şerit tüpler) olmak üzere toplam 60 µL 30 µL karıştırın. Adım 3.1 fluorophore etiketli ERT hazırlamak tahlil yordamı için devam edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. gün 1: Tahlil yordamı
<ol><li>
Fluorophore etiketli ERT (Örneğin, iyi veya yaklaşık 6 mL/plaka başına 60 µL) serum-Alerjik orta hazırlayın.
	<ol>
<li>Örneğin, 10 mL 1 µg/ml hazırlamak için ERT, fluorophore etiketli olarak hisse senedi 1 mg/mL 10 µL eklemek fluorophore etiketli ERT 9,99 ml serum-ücretsiz medya (Örneğin, RPMI-1640).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yeni bir kuluçka plaka (Örneğin, 96-Peki, beyaz, yuvarlak-alt, bağlayıcı Polipropilen plaka), eklemek hazır örnekleri üzerinden adım 2.2, 2.3, veya 2.4 ve fluorophore etiketli ERT bir 1:1 karışımı yinelenen Wells (Örneğin, her transfer 60 µL hazırlanan örnek ve iyi ücret fluorophore etiketli ERT 60 µL ekleyin). Not: Bir örnek deneme plaka harita Şekil 1' de verilmiştir.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig1.jpg"> Şekil 1: örnek bir deney plaka düzeninin. Örnekleri ve fluorophore etiketli ERT gecede 2-8 ° C'de inkübe Yüksek kalite kontrolü (HQC), düşük kalite kontrol (LQC) ve negatif kalite kontrol (NQC) gibi denetimler ekranlı ve plaka benzerliği değerlendirmek için plaka ters köşelerinde doğruladı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="3"><li>Yukarı ve aşağı bir çok kanallı pipet ile birkaç kez pipetting tarafından mix örnekleri ve fluorophore etiketli ERT. Tabakları folyo sarın ve onları gece 14-20 h için 2-8 ° C'de kuluçkaya.</li>
</ol>4. gün 2: hazır örnekleri hücrelere ekleme
<ol><li>2-8 ° C'de kuluçka örnek kuluçka plate(s) kaldırmak ve boncuk banyo için 10-15 dk 37 ° C'de yerleştirerek tabak sıcak.</li>
	<li>Hücreleri CO2 kuluçka kaldırın. Kaplama hücre hücreleri sağlıklı ve düzgün dağıtılmış arasında wells17,19görüntülendiğinden emin olmak için ters bir mikroskop kullanarak görsel bir denetimi yapın.</li>
	<li>Daha önce karma örnekleri ve fluorophore etiketli ERT 100 µL deneysel plaka haritaya göre hücre plaka ekleyin.</li>
	<li>Hücre plaka eklenen örnekleri ile CO2 kuluçka 37 ° C'de geri yerleştirin 3 h ve ± plaka kuluçkaya 15dk. Not: Bu sefer laboratuvarda tahlil sinyal-gürültü yanıtta görüntülemek için kurulmuştur.</li>
	<li>6 dk. 14-18 ° C'de masa üstü bir santrifüj 320 x g de hücre plaka santrifüj kapasitesi Bir hücre Pelet plaka kuyu dibinde varlığını doğrulamak.</li>
	<li>Plaka bir 30-45 ° açıyla tut. Dikkatli bir şekilde süpernatant her kuyudan hücre Pelet bozmadan çıkarın. 1 x DPBS hücre Pelet üzerine 200 µL her kuyuya hücreleri resuspend ekleyin.</li>
	<li>Adımları toplam 3 yıkama yıkama hücre yineleyin. Hemen hücre canlılığı boyama için 5 adım devam edin.</li>
</ol>5. gün 2: Hücre canlılığı boyama
<ol><li>Bir çok kanallı pipet kullanarak, çalışan bir çözüm canlı/ölü leke x 1 100 µL her şey, bir emisyon dalga boyu fluorophore etiketli ERT farklı için seçilen ve üreticinin yönergeleri22göre hazırlanan ekleyin.</li>
	<li>RT, 15 dk karanlıkta plaka kuluçkaya. 6 dk. 14-18 ° C'de masa üstü bir santrifüj 320 x g de plaka santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde süpernatant her kuyudan hücre Pelet bozmadan çıkarın. Hücreleri 1 yıkama x 1 x DPBS ile.</li>
</ol>6. gün 2: %1 Paraformaldehyde hücrelerle sabitleme
<ol><li>Bir çok kanallı pipet kullanarak, soğutulmuş (2-8 ° C'de) %1 paraformaldehyde (PFA) 100 µL her kuyuya dağıtmak.</li>
	<li>Tabakalar ve yavaşça karıştırmak için nabız girdap kapatın. Plaka folyo sarma ve 2-8 ° C'de fiksasyon için izin vermek için en az 10 dakika yerleştirin. Not: plaka mühür sıçramasına önlemek dikkatli olun.</li>
	<li>Bir çok kanallı pipet, yukarı ve aşağı önce analiz kullanarak her kuyuya 1 x DPBS 50 µL ekleyin.</li>
</ol>7. akış sitometresi
<ol><li>Akış sitometresi ile plaka yüklü tabak yerleştirin ve onları çalıştırmak.</li>
	<li>Elde etmek ve akış sitometresi yazılım kullanarak ölçülen ortalama floresans yoğunluğu (MFI) kayıt ( Tablo malzemelerigörmek). Not: Önyükleyici ayarları için bir örnek Şekil 2 bakın. Örnek akış hızı, numune hacmi, cilt, karıştırma hızları ve karışımları sayısı karıştırma bu tahlil için optimize edilmiştir. Bu kriterlere bağlı olarak akış sitometresi edinme yazılım23her ölçütü için yanındaki "yukarı okları" veya "aşağı" düğmeleri kullanılarak ayarlanabilir.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig2.jpg"> Şekil 2: akış sitometresi yükleyici ayarları örneği. Önyükleyici ayarları geliştirilen her tahlil için optimize edilmelidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="3"><li>Bir Sitometresi Şekil 3' te gösterilen araziler oluşturun. Not: Kapı oluşturma ve uygulama için her akış sitometresi yazılım23farklı olabilir.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig3.jpg"> Şekil 3: akış sitometresi strateji geçişi. Jurkat hücreleri toplam olaylardan ayrılmış ve ileri-dağılım (FSC) vs yan-dağılım (SSC) kanalları plan ve hedef kitlenin çevresinde bir kapı çizim tarafından toplanan. Gömlek (tek hücreleri) birini ayrılmış veya daha büyük hücre toplar FSC alanını kullanma (FSC-A) ve FSC yükseklik (FSC-H) kanalları. Canlı hücreleri singlet hücrelerde bir canlılık leke için negatif çoğunluğuna tarafından seçilmiştir. Medyan floresan yoğunluğu (MFI) tek, canlı Jurkat hücrelerde ölçüldü ve bir çubuk grafik çizilir. İlaç alımı ile hücrelerin MFI değerleri bloke (Örneğin, HQC) ve hücre kontrolü ile Alım tutarlar gösterilir (kırmızı ve mavi, sırasıyla). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="4"><li>Ölü hücreleri çözümleme dışı bırakmak ve yaklaşık 10,000 olayları23kayıt.</li>
</ol>8. veri analizi
<ol><li>(Ham MFI) analiz yazılımı için verileri ( Tablo malzemelerigörmek). Not: gerekli bağlı olarak, aşağıdaki veri analizi analiz yazılımı kullanarak çözümlemenin.</li>
	<li>MFI yinelenen Wells (QCs ve örnekleri) ortalama ve ortalama yinelenen yayılmış değişkenliği değerlendirmek için (% CV) varyasyon katsayısı hesaplayın. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq1v2.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq2v2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq3v2.jpg">
</li>
	<li>Örnekleri ve assay olarak gösterildi QCs hesaplamak için tamamlanma yüzdesi inhibisyon (% SI) göre ortalama MFI sinyal QCs havuza alınan matris CC için. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq4v2.jpg">
</li>
	<li>Gerekirse, teyit QCs ve karşılık gelen ekran değerlere göre değişir örnekleri için kurtarma oranları (RR) hesaplar. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57777/57777eq5v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>CDER. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assay Development and Validation for Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products (Draft). , (2016).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+design,+optimization,+and+qualification+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+responses+elicited+to+biological+therapeutics.">Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics.</a> Journal of Immunological Methods. 321, 1-18 (2007).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+validation+of+cell-based+assays+used+for+the+detection+of+neutralizing+antibody+immune+responses+elicited+against+biological+therapeutics.">Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55, 878-888 (2011).</li><li>Pedras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAb+me+well-+FDA+Regulatory+Perspectives+on+Neutralizing+Antibody+Assays.">NAb me well- FDA Regulatory Perspectives on Neutralizing Antibody Assays.</a> BEBPA Forum. , (2015).</li><li>Stovold, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAB+Assay+Development+and+Validation+Immunogencity+Workflow.">NAB Assay Development and Validation Immunogencity Workflow.</a> Annual BEBPA Bioassay Meeting. , (2013).</li><li>Kromminga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neutralizing anti-drug antibodies Emerging Trends and Clinical Impact. Symposium. , (2013).</li><li>Davis, R. S., Wang, Y. H., Kubagawa, H., Cooper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+family+of+Fc+receptor+homologs+with+preferential+B+cell+expression.">Identification of a family of Fc receptor homologs with preferential B cell expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 9772-9777 (2001).</li><li>Melton, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+neutralize+cellular+uptake+of+elosulfase+alfa+are+not+associated+with+reduced+efficacy+or+pharmacodynamic+effect+in+individuals+with+Morquio+A+syndrome.">Antibodies that neutralize cellular uptake of elosulfase alfa are not associated with reduced efficacy or pharmacodynamic effect in individuals with Morquio A syndrome.</a> Journal of Immunological Methods. 440, 41-51 (2017).</li><li>U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidance for Industry. S6 Addendum to Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals. , (2012).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+and+pharmacological+comparison+of+enzyme+replacement+therapies+for+the+glycolipid+storage+disorder+Fabry+disease.">A biochemical and pharmacological comparison of enzyme replacement therapies for the glycolipid storage disorder Fabry disease.</a> Glycobiology. 13, 305-313 (2003).</li><li>Kirkegaard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapies+and+therapeutic+concepts+for+lysosomal+storage+diseases.">Emerging therapies and therapeutic concepts for lysosomal storage diseases.</a> Expert Opinion on Orphan Drugs. 1, 385-404 (2013).</li><li>Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. Morbidity and Mortality Weekly Report Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm">https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1.htm</a> (2012)</li><li>Invitrogen by ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DynabeadsTM M-270 Streptavidin. , (2015).</li><li>European Medicines Agency. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guideline on Immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins. , (2017).</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular ProbesTM Alexa FluorTM 647 Protein Labeling Kit (A20173). , (2004).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Working+in+the+Hood.">An Introduction to Working in the Hood.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>Invitrogen and Gibco. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Culture Basics Handbook. , (2010).</li><li>Coecke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+on+Good+Cell+Culture+Practice.">Guidance on Good Cell Culture Practice.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 33, 261-287 (2005).</li><li>. Introduction to Cell Culture Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/introduction-to-cell-culture.html</a> (2018)</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li><li>. Counting Cells with Bio-Rad&#39;s TC20(TM) Automated Cell Counter Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M">https://www.youtube.com/watch?v=sDHOL7UEL1M</a> (2012)</li><li>ThermoFisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> User Guide LIVE / DEADTM Fixable Dead Cell Stain Kits. , (2016).</li><li>Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting Started with BD FACSDiva Software. , (2007).</li><li>Biosciences. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BD FACS Canto II Instructions For Use. , (2007).</li><li>Quirke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Flow+Cytometry:+A+Learning+Guide.">Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide.</a> Journal of Clinical Pathology. 45 (3), (2002).</li><li>. A guide to gating in flow cytometry Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/blog/a-guide-to-gating-in-flow-cytometry.html</a> (2016)</li><li>Minor, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Assay Development in Drug Discovery. , (2006).</li><li>Desilva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+Bioanalytical+Method+Validation+of+Ligand-binding+Assays+to+Support+Pharmacokinetic+Assessments+of+Macromolecules.">Recommendations for the Bioanalytical Method Validation of Ligand-binding Assays to Support Pharmacokinetic Assessments of Macromolecules.</a> Pharmaceutical Research. 20, (2003).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell-based+and+non-cell-based+assay+platforms+for+the+detection+of+clinically+relevant+anti-drug+neutralizing+antibodies+for+immunogenicity+assessment+of+therapeutic+proteins.">Comparison of cell-based and non-cell-based assay platforms for the detection of clinically relevant anti-drug neutralizing antibodies for immunogenicity assessment of therapeutic proteins.</a> Journal of Immunological Methods. 419, 1-8 (2015).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+neutralizing+assay+for+antibodies+and+sera+against+hepatitis+E+virus.">A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Charles River. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Flow+Cytometric+Method+to+Assess+Neutralizing+Antibodies+to+AAV+Gene-Therapy+Vectors.">A Flow Cytometric Method to Assess Neutralizing Antibodies to AAV Gene-Therapy Vectors.</a> Charles River Researcher. , (2015).</li><li>Waritani, T., Chang, J., McKinney, B., Terato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ELISA+protocol+to+improve+the+accuracy+and+reliability+of+serological+antibody+assays.">An ELISA protocol to improve the accuracy and reliability of serological antibody assays.</a> MethodsX. 4, 153-165 (2017).</li><li>Iversen, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+Assay+Validation.">HTS Assay Validation.</a> Assay Guidance Manual. , 1-30 (2004).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tech Tip #34. Binding characteristics of antibody-binding proteins: Protein A, Protein G, Protein A/G and Protein L. , (2013).</li><li>Long, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Immunogenicity+of+Elosulfase+Alfa+in+the+Treatment+of+Morquio+A+Syndrome:+Results+From+MOR-005,+a+Phase+III+Extension+Study.">Long-term Immunogenicity of Elosulfase Alfa in the Treatment of Morquio A Syndrome: Results From MOR-005, a Phase III Extension Study.</a> Clinical Therapeutics. 39, (2017).</li><li>Schweighardt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+Elosulfase+Alfa,+an+Enzyme+Replacement+Therapy+in+Patients+with+Morquio+A+Syndrome:+Results+from+MOR-004,+a+Phase+III+Trial.">Immunogenicity of Elosulfase Alfa, an Enzyme Replacement Therapy in Patients with Morquio A Syndrome: Results from MOR-004, a Phase III Trial.</a> Clinical Therapeutics. 37, (2015).</li><li>Mellman, I. R. A., Plutner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+and+Degradation+of+Macrophage+Fc+Receptors+Bound+to+Polyvalent+Immune+Complexes.">Internalization and Degradation of Macrophage Fc Receptors Bound to Polyvalent Immune Complexes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1170-1177 (1984).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralizing+antibodies+to+the+therapeutic+enzymes:+considerations+for+testing,+prevention+and+treatment.">Neutralizing antibodies to the therapeutic enzymes: considerations for testing, prevention and treatment.</a> Nature Biotechnology. 26, 901-908 (2008).</li></ol>

Çalışanları ve hissedarları BioMarin Pharmaceutical Inc. yazarlar vardır

Nötralize antikorlar veya CI-M6PR aracılığıyla ERT alımını önlemek diğer faktörler ERT Emanet veya etkinlik1etki potansiyeline sahip. Bu nedenle, İlacın etki mekanizmaları için ilgili güçlü bir modeli kullanarak konu örnekleri yakalar değerlendirmek önemlidir. Biz ve diğer bazı bioassay biçimleri (Örneğin, reseptör dimerization, luciferase ifade, vb) performansını tahlil hassas, tekrarlanabilirlik ve hassasiyet için sağlık yetkilisi öneriler hizalamıyor bulduk 29. burada açıklanan bioassay yönteminde endojen CI-M6PR hızlı Jurkat hücreleri yakalar lizozomal ERT alımı için belirli izlemek için istihdam edilmektedir. Bir akış sitometresi okuma ile birlikte, bu tahlil uygun tahlil hassas, duyarlı, tekrarlanabilirlik ve yüksek örnek işlem hacmi ile bir fizyolojik hücre modeli kullanır. Algılama nAb ile bir akış sitometresi okuma aynı zamanda diğer göstergeler için uygulanmıştır. Örneğin, Hepatit E ve adeno ilişkili virüs (AAV)30,31karşı önceden varolan antikor algılamak için yöntemleri geliştirilmiştir.
Monitörler hücre canlılığı yeterli bir düzeyde sağlanması ve kuluçka kez sıkı bağlılık Bakımı duyarlılık, tahlil bir LQC birleştiren bir uygun fluorophore seçerek iletişim kuralındaki kritik adımlar içerir. Burada gösterilen örnekte, fluorophores (Örneğin, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 ve CypHer 5e), yaygın olarak performansları çeşitli lizozomal ERT, Birleşik. Alexa Fluor 647, aynı zamanda en parlak fluorophore test32tahlil geliştirilmesi için seçildi. Biz birkaç fluorophores erken iyi duyarlılık ve dinamik alan sağlamak için tahlil gelişiminde değerlendirilecek öneririz. Örneğin test edilmesi sırasında tahlil duyarlılık test çalıştırır%11'başarısız olur duyarlılık sınırlamak için yeterince yakın bir LQC dahil ederek izlenmelidir. HQC ile birlikte LQC bir sistem uygunluğu tahlil drift süresi3izlemek için QC olarak da davranır. Optimum hücre canlılığı ve performans tek kullanımlık aliquots bir hücre Bankası hazırlama ve karşılaştırılabilir QC sonuçları3,18tarihinde dayalı yeni hücre bankalarda eleme tarafından sağlanır. İlaç hücreleri ile inkübe süreyi ile ilaç alımını artırır beri hücre ve uyuşturucu fluorophore Birleşik kuluçka süreleri de tutarlı tahlil performans merkezi vardır. Günlük değişkenlik ilaç alımını en aza indirmek için örnek verileri havuza alınan matris kontrol örnekleri her tabakta (e.g., belgili tanımlık yöntem yukarıda kesme noktası denetim örnekleri) için normalleştirilmiş. Plaka tekdüzelik izlemek ve olası kenar etkileri en aza indirmek için bu yöntemi ile tutarlı veri üreten bir başka önemli faktör olduğunu. İlk deney daha sağlam deneyler tahlil doğrulama (Örneğin, hassasiyet ve doğruluk)1sırasında gerçekleştirilebilir bütün plaka üzerinde tek bir QC kullanarak tahlil performans içerebilir. Bu plaka harita düzeni33önemini göstermektedir. Plaka harita örnekte gösterildiği gibi kalite kontrol örnekleri Levey-Jennings grafikler34ile zaman içinde izlenen bir tekdüzelik plaka ekranın her iki tarafında yer.
Bu tahlil yakalar ve lizozomal ERT alımını inhibe diğer faktörler izler iken, bir alımı inhibisyon antikorlar nedeniyle onaylamak için ek deneyler yaptı. Örnekleri A/G/özel olarak sigara bağlayan immünglobulin35M, protein ile tedavi etmek için bir seçenektir. Protein A/G/L tükenmesi sonra pozitif test etmek örnekleri devam ederseniz, bir sigara-antikor inhibitör faktör ilaç alımını engelleme için sorumlu olabilir. Burada açıklanan yöntemi antikor aracılıklı alımını inhibisyon ve pozitif kontrol ve konu örnekleri sigara-antikor inhibitör faktörleri ile yüksek oranda bulunursa parametreleri değerlendirilmesi diğer tahlil ölçmek için tasarlanmıştır.
Tahlil de daha fazla fluorophore etiketli ilaç trafik ilacın etki mekanizmaları üzerinde dayalı uygun hücresel yuvası göstermek için karakterize edilebilir. Burada gösterilen örnekte, bir ERT CI-M6PR hücre yüzeyinde bağlamak ve lysosome için trafik için bekleniyor. Biz daha önce neredeyse tüm fluorophore etiketli ERT lysosome8' yöntemi sonuçları gözlemlenen floresan sinyal olduğunu belirten çeşitli deneylerin sonuçlarını bildirdi. Bulduğumuz fluorophore etiketli ERT sinyal cytochalasin içselleştirilmesi aktin reorganizasyon inhibisyonu yoluyla bozan B hücrelerle tedavi aşağıdaki elendi. Ayrıca, 4 ° C'de hücreler yerleştirerek dış fluorophore trypan mavi veya yavaşlatılmış içselleştirilmesi ile söndürülür deneyler fluorophore etiketli ERT hızla içselleştirilmiş ve hücre yüzeyine bağlı bir ERT çok az floresans kaynaklanmaktadır gösterir. Lizozomal hedefleme pH duyarlı lysotracker boya eş lokalizasyonu, fluorophore Birleşik uyuşturucu confocal mikroskobu kullanarak görselleştirme tarafından doğrulandı. Bir özgüllüğü CI-M6PR aracılığıyla alım için Ayrıca eksojen M6P reseptör bağlamak için etiketli uyuşturucu ile rekabet edebilmek için kullanarak doğrulanmadı. Benzer deneyler alımını kinetik ve diğer deneyleri içinde fluorophore Birleşik ilaçların hücrede yerleşimi doğrulamak için yapılmalıdır.
Bu tahlil hücre tabanlı platform yakalar CI-M6PR reseptör aracılı endositoz yararlanmak için tedavi edici ilaç çalışma kullanılmaya başlanmıştır. Biz son zamanlarda sonuçları bir NAb ve ilaç etkinliğini elosulfase alfa36,37için gelişimi arasında hiçbir bağlantı gösterdi bu tahlil platformu kullanarak rapor. Tahlil, tahlil duyarlılık, hassas, seçicilik, özgüllük, uyuşturucu dayanıklılık, sağlamlık, dahil olmak üzere parametreleri sınama klinik örnek için doğrulamak ve puan, kesmek için kurulan rehberlere3göre, değerlendirilmelidir 4. bu da, lizozomal ERTs için yakalar enzimin katalitik yakınlarında bağlama aracılığıyla uyuşturucu aktivite ile müdahale için potansiyeli geliştirmek unutulmamalıdır. Genel olarak, biz bu tür lysosome sert asidik ve proteolitik çevre antikor-ERT etkileşimleri2,39,40' a uygun olmadığına göre daha düşük bir öncelik olmak NAb izleme düşünün. Ancak, proteolitik dayanıklı yakalar biri yok ve bir uyuşturucu40katalitik kısmını inhibe mümkündür. Bu tahlil monitörler fluorophore etiketli ERT alımı lysosome ve tahlil sınırlamasından dayanıklı proteolitik yakalar izlemek için yetersizlik var. NAb bu tür Emanet veya etkinlik veri temel şüphesi varsa, ERT etkinliği izler bir tahlil geliştirilmiştir ve örnekleri sınamak için kullanılan gerekir.
İmmünojenisite değerlendirilmesi ilaç güvenliği ve etkinliği yakalar etkilerini anlamak önemlidir. Yakalar in vitro ilaç alımı yoluyla CI-M6PR inhibe yeteneğine sahip tanımlaması NAb etkinlik içinde vivoanlamak için bir fırsat sağlar. Burada sunulan Yöntem lizozomal ERT hücresel Alım fluorophore Birleşik girişim ölçmek için CI-M6PR ifade eder bir insan hücre satırı kullanır. Bu yöntem zaten yakalar lizozomal depo hastalıkları tedavi etmek amacıyla çeşitli ERTs için izlemek için kullanılır. Bu tahlil platform hücresel içselleştirilmesi için uygun işlevleri gerektirir yakalar etkilerini biyolojik tedavi üzerinde çalışmak için diğer yöntemleri için geçerli olabilir.

İmmünojenisite değerlendirme güvenliği ve etkinliği izleme programı ERTs dahil olmak üzere herhangi bir biyolojik tedavi ürün için önemli bir parçasıdır. Hastalar ilaç güvenliği, etkinlik ve farmakokinetik/Farmakodinamik profilleri doğrudan etkileyebilir bir bağışıklık yanıtı gelişebilir. Bir alt kümesini yakalar, denilen bu ADA, ERT etkinliği iki şekilde inhibe: hedef hücre içine veya ERT katalitik aktivitesi inhibe tarafından ERT alımını inhibisyonu yoluyla. Burada sunulan yöntemi ile ERT alımı hücrelere müdahale yakalar ölçmek için tasarlanmıştır. Tam güvenlik ve terapötik ERT etkinliğini izlemek için sürekli izlenmesi yakalar klinik sonuçlar veya Farmakodinamik etkileri1potansiyel herhangi bir korelasyon elucidating çok önemlidir.
Protein therapeutics karşı yakalar değerlendirmek için platformlar hücre tabanlı, enzimatik aktivite ve ligand taşıması-deneyleri1içerir. En iyi tahlil platformu dayalı çeşitli ölçütler seçilir: tedavi edici ürün, tahlil platformu duyarlılık, seçicilik, hassas ve önemlisi, inhibitör eylem taklit yeteneği onun etki mekanizması NAbs vivo içinde . Ligand taşıması deneyleri belirli durumlarda uygun olabilir (Örneğin, bir ilgili hücre satır tanımlanamaz veya uygun hassasiyet bir hücre tabanlı tahlil elde edilemez). Ancak, 2016 taslağında FDA rehberlik sanayi belge ve diğer sanayi kabul teknik incelemeler için hücre tabanlı NAb deneyleri tavsiye onlar daha iyi çünkü yansıtmak biyolojik mekanizma ilaç vivo içinde1,2 , 3.
Bir akış sitometresi hücre tabanlı NAb tahlil geliştirmek için kritik bileşenleri için uyuşturucu stimülasyon, bir vekil pozitif-kontrol yanıt verir bir uygun hücre satırı ekleyin ERT, fluorophore Birleşik ERT ve test tür biyolojik nötralize NAb Matris4,5,6. Eylem ERT mekanizmasının hücre satırı seçimi bağlıdır ve birden çok hücre satırı sırasında tahlil geliştirme3değerlendirilmesi gerekir. Burada açıklanan yöntemde insan Jurkat T hücrelerinin hücre yüzeyine ve gelişigüzel bağlamak çoğu antikorlar7,8 Fc bölgenin antikor parçası reseptörleri (FcRs) eksikliği onların endojen CI-M6PR ifade seçildi . Tahlil geliştirme sırasında doğrulama çalışmaları ve test, test madde1ile tedavi değil bireylerin havuza alınmış serum gibi hasta örnek için bir negatif kontrol kurmak önemlidir. Hücre hatları da ilaç geliştirme1nonclinical, klinik ve sonrası pazarlama etap üzerinden izlenmek farklı türlerden ilgili matrisler tahammül. Başka bir bileşen tahlil'ın olumlu denetim seçimidir. ERT hücre alımı tahlil için pozitif kontrol dayalı tedavi bağlamak ve alımı ile CI-M6PR9,1etkisiz hale getirmek için onun yetenek olarak seçildi. Genellikle insan denekler bir tahlil denetiminde, özellikle nadir hastalık hasta nüfus2olarak kullanmak için yararlı veya sürdürülebilir nötralize antisera miktarda elde etmek zordur. Antisera hayvanlar bağışıklık hiper veya tahlil ilgili matris1içine çivili benzeşme saf poliklonal veya monoklonal antikorlar dahil alternatifler vardır. Species-specific matris kullanırken, bu antikorlar matris içinde mevcut dışında inhibitör faktörleri ERT alımını inhibe mümkündür. Başka bir önemli tahlil fluorophore Birleşik ERT bileşenidir. ERT konjugasyon için fluorophore seçimi için tahlil'ın ihtiyacını parlaklık, pH istikrar ve akış sitometresi diğer kanallarda halinde potansiyel spektral çakışma dayalı her ERT değerlendirilmelidir.
Burada açıklanan tahlil bir NAb için hücre ile CI-M6PR girer bir ERT gibi bir terapötik protein ölçmek için bir örnektir. Birkaç ERTs, lizozomal depo bozuklukları (LSDs) tedavi, elosulfase alfa Morquio A sendromu, cerliponase alfa CLN2 çıta hastalık için agalsidase alfa Fabry hastalığı için için de dahil olmak üzere hücre alımı ve lizozomal hedefleme, için bu yolu kullanmak için tasarlanmış ve alglucosidase alfa Pompe hastalığı10,11. Bu yöntemin amacı uyuşturucu bağlama ve içselleştirilmesi ile ile CI-M6PR müdahale göreli yakalar düzeylerini ölçmek etmektir. Bu katmanlı tarama, doğrulama ve titresi yapılır adım3. Örnekleri ilk NAb pozitifliği için ekranlı ve o zaman içinde belgili tanımlık doğrulayıcı adım olumlu doğruladı. Son olarak, ekran ve olumlu onaylamak örnekleri seri olarak bir antikor titresi1oluşturmak için seyreltilmiş. Bu hücre tabanlı akış sitometresi ilaç alımını tahlil bir ilacın farmakolojik profil etkileyebilir uyuşturucu özgü yakalar ölçme hassas ve mechanistically ilgili vitro yöntemi sağlar. Daha önce ve bu platform için uyuşturucu elosulfase alfa8kullanarak klinik örnekleri test yöntemi doğrulanmış. Burada diğer tedavi amaçlı proteinleri veya ERTs uygulanabilir ayrıntılı adım adım protokolü açıklar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter unit, 500 mL vacuum filter flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Bottom 96-well culture plates</td>
			<td>Thermo-Nunclon</td>
			<td>163320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile reagent reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well white round bottom polystyrene microplate plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead separator tube rack</td>
			<td>V&#38;P Scientific, Inc</td>
			<td>VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -2 Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag -96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD High Throughput Sampler (HTS)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galaxy MiniStar Microcentrifuge</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C1413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture CO2 incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>Purifier Cell Logic +</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jurkat Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB152&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A20173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M270 Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 1X Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10491-01-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (100X) liquid formulation</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X DPBS without calcium and magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Para-formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15735-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid)</td>
			<td>Bioreclamation IVT</td>
			<td>request a quote from website</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Polyester Plate Film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal &#38; Sample Aluminum Foil</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>538619</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of antibodies that neutralize the cellular uptake of enzyme replacement therapies with a cell-based assay

Enzim replasman tedavileri (ERTs) yönetim ve diğer biyolojik tedaviler hastalara bir uyuşturucu karşıtı bağışıklık yanıtı temin. Bu uyuşturucu karşıtı antikorlar (ADA), özellikle bu nötralize antikorlar (yakalar) olarak adlandırdığı ilacın biyolojik etkinliği nötralize karakterizasyonu ilacın bu antikorlar etkilerini anlamak önemlidir farmakolojik profil. Bu iletişim kuralı bir temsilcisi lizozomal ERT insan matris hücresel alımını nötralize faktörler algılamak için hücre tabanlı akış sitometresi yöntemi açıklanır. Protokol üç yordamdan oluşur: tarama, Doğrulayıcı bir adım ve titresi deneyleri algılamak için tanımlamak ve nötralize konu örneklerinde antikor titresi göreli düzeyini kurmak.
Bu yöntemde, örnekleri ilk fluorophore Birleşik ERT ürün ile karışık, o zaman bir hücre yüzeyine katyon bağımsız mannoz 6-fosfat reseptör (CI-M6PR), ifade [Örneğin, insan T lenfositler (Jurkat hücreleri)] hücrelerle inkübe ve son olarak, bir akış sitometresi ile analiz. İlaç bağlamak ve CI-M6PR bağlama ve alımı ile müdahale yakalar varlığı ise, bir örnek yakalar olmadan alımını fluorophore Birleşik ERT ürün üzerinden CI-M6PR, içinde neden olur. Jurkat hücreleri tarafından içselleştirilmiş fluorophore Birleşik ERT miktarı akış sitometresi tarafından ölçülen ve huzurunda bir temsilcisi uyuşturucu-saf matris elde edilen yanıt göre yüzde (%) sinyal inhibisyon olarak değerlendirilir. Doğrulayıcı adımda önceden (gibi yakalar) uyuşturucu bir kuluçka hücrelerle önce bağlamak uyuşturucu özgü faktörler tüketmek için ERT Birleşik manyetik boncuklar ile inkübe örneklerindendir. Ekran ve uyuşturucu özgü yakalar tahlil için olumlu onaylamak örnekleri sonra seri olarak bir antikor titresi oluşturmak için seyreltilmiş. Yarı kantitatif antikor titreleri ilaç güvenliği ve etkinliği ölçümleri ile ilişkili.

Yöntemin ilk gününde, donmuş bir aliquot Jurkat hücre çözdürülen ve kaplama ve test örnekleri hazırlanmıştır. Şekil 1 bir örnek plaka harita gösterir. İkinci gün, örnekleri Jurkat hücreleri ile karışık ve yaklaşık 3 saat 15 dk için 37 ° C'de inkübe. Hücreleri sonra yıkanmış, PFA ile sabit ve bir akış sitometresi analiz. Şekil 2 örnek akış sitometresi ayarlarını gösterir.
Strateji çoğunluğuna akış sitometresi canlı tek Jurkat hücreleri24 (Şekil 3) fluorophore-Birleşik ilaç miktarını ölçmek için tasarlanmıştır. Hücreleri hücresel enkaz dışlayan bir kapı çizerek enkazı ayrıldık [genellikle, düşük ileri dağılım (FSC)] ve ölü hücreleri [genellikle, yüksek dağılım (SSC)], sadece canlı hücreler için analiz25bırakarak. Tek hücre sonra yüksek FSC alan ve düşük FSC yüksekliği26dışlayan bir kapı çizerek hücre kümelerden ayrı kaldık. Hücreleri herhangi bir ölü ya da sağlıksız hücreleri olmadan sağlam bir membran etiketli bir canlılık leke ile tedavi edildi ve ek bir kapı22ölü hücreleri dışlamak için oluşturuldu. MFI canlı tek hücre fluorophore Birleşik ERT alımı analizi için kullanıldı. Tahlil sonuçları tarama potansiyel bir örnek olarak, vekil uyuşturucu karşıtı antikor pozitif kontrol [Örneğin, yüksek-kalite kontrol (HQC)] yüksek bir miktar ile çivili matris düşük bir MFI kaynaklanan ERT alımı fluorophore Birleşik, inhibe. yaklaşık 300 (Şekil 3). Buna ek olarak, daha yüksek bir MFI hücreleri matrisin olumlu denetim antikor yokluğu ile inkübe olmalıdır (MFI Şekil3 37,830 =), fluorophore-Birleşik ERT alımını gösteren.
Pozitif kontrol antikor burada örnek için seçildi nötralize (yani, ERT alımını CI-M6PR yoluyla) İlacın etki mekanizmaları temel. Fluorophores bir panel de test ve en iyi tahlil duyarlılık ve dinamik alan1için karşılaştırılır. CypHer 5e nedeniyle artan onun floresan bir asidik ph, hangi-ebilmek var olmak ilgili bazı ERTs lizozomal uyuşturucu27hedefleme ek bir ölçüt olarak test edildi. Bir yeşil flüoresan boya (Örneğin, Alexa Fluor 488) ve bir far-red floresan boya (Örneğin, Alexa Fluor 647) da incelenmiş. Ne kadar farklı fluorophores örneği yerine getirmeyebilir Şekil 4a ve 4bsundu. Örneğin, Alexa Fluor 647 ERT (Örneğin, en düşük fiyat PC toplama, en yüksek % SI) üstün hassasiyet ve geniş dinamik Aralık (~ 3 büyüklük) nedeniyle en iyi performansı vardı.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig4v2.jpg"> Şekil 4: örnek sonuç farklı fluorophore-ERT conjugates. (A)tahlil geliştirme sırasında farklı fluorophore Birleşik ERTs kullanarak bir olumlu denetim (PC) seyreltme eğrisi değerlendirilmelidir. Burada, iki fluorophore Birleşik ERTs (Alexa Fluor 488 ve CypHer 5e) 6.25 µg/mL ve bir daha parlak fluorophore Birleşik ERT (Alexa Fluor 647) 1,56 µg/mL gösterilen örnekte pozitif kontrol yakalar konsantrasyonları artan varlığında test edildi. (B) Bu panel gösterir A panelinden eğrileri, önemli artış Alexa Fluor 647 Birleşik ERT kullanarak dinamik alanı göstermek için MFI kullanarak Grafiği çizilecek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Açıklanan yöntemi için hafiye, onaylayan ve yarı kantitatif düzeyi NAb titresi3enterpolasyonla katmanlı bir yaklaşım olacaktır. Tahlil için doğrulama, tahlil duyarlılık, hassas, seçicilik, özgüllük, uyuşturucu dayanıklılık, sağlamlık, dahil olmak üzere parametreleri hazırdır ve kesme noktaları göre değerlendirilmesi gerekir kurmak için bilgilendirme1,3 kurulan .
Tarama noktası (SCP) kesmek daha büyük % SI değerler elde edilmiştir örnekleri bu tahlil potansiyel olarak pozitif kabul edildi. SCP temsilcisi bir popülasyondan uyuşturucu-saf örnekleri test ve sinyal yoğunluğu (sı)3göreli bir azalma ölçerek istatistiksel olarak belirlendi. Rehberlik'ın (örneğin FDA) tavsiye SCP normal dağılım veri kümesi 95inci yüzdelik kurulur ve SCP hesaplama yöntemleri-si olmak be1başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Azalma (% SI artış olarak ölçülür) tahlil sinyal ya da SCP üzerinde herhangi bir örnek potansiyel olarak pozitif olarak tespit edilmiştir ve SCP yüksek sonuçlarla örnekleri (no ile değiştirmek veya % SI azaltmak) negatif olarak kabul edilir.
Pozitif (% SI SCP yukarıda) ekranlı örnekleri yakalar ERT için özgüllük belirlemek için doğrulama tahlil test edildi. Doğrulayıcı tahlil örnekleri ile uyuşturucu özel antikorlar veya inhibitör faktörleri kaldırmak için manyetik boncuklar ERT Birleşik ön kuluçka tarafından gerçekleştirildi. RR (MFI eleme için doğrulayıcı MFI oranı) yakalar sayısını örnek kaldırılması belirlemek için değerlendirilmiştir. Bir RR hesaplanan eşik olumluluk [yani, doğrulayıcı kesme noktası (CCP)] anti-uyuşturucu yakalar varlığı belirtilenden daha yüksek. Tarama yöntemi olduğu gibi ÇKP ilk tedavi-saf örnekleri Doğrulayıcı tahlil temsilcisi bir popülasyondan değerlendirerek kurulmalıdır. ÇKP bir istatistiksel olarak belirlenen % 1'yanlış-pozitif oranına göre ve eşik olumlu teyit edilen örnek (Şekil 5)3belirleme.
Ekranlı ve olumlu doğruladı örnekleri seri olarak seyreltilmiş ve titresi tahlil göreli düzeyine veya yakalar titresi her örnek içinde belirlemek için test edildi. [Örneğin, kesme noktası (TCP) titresi] belirlenen eşik geçtiğim zaman, bir örnek pozitif testler en yüksek seyreltme örnek titresi (Şekil 5)1,3' tür.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig5.jpg"> Şekil 5: örnek örnek sonuçları test. Bu paneller test örnekleri tarama üstünde veya altında bir SCP %17.51 tarafından olumlu ya da olumsuz örnekler SI. Olumlu örnekler sonra uyuşturucu özgü antikor örneklerinden tahlil test önce tüketmek için manyetik boncuklar uyuşturucu Birleşik kullanarak doğrulama tahlil test edildi. Örnekleri ile bir kurtarma oranı (RR) Doğrulayıcı kesme noktasından daha büyük (yani, RR 1.315 =) onaylanması pozitif kabul edildi. İşaret noktası (TCP) hangi titresi örnek sonuç eşittir titresi (seyreltme faktörü) kesme noktası kurmak için kesmek titresi geçti kadar pozitif doğruladı örnekleri seyreltilmiş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tahlil tekrarlanabilirlik ve değişkenlik birkaç gün ve birden fazla analisti ile test edildi. QCs başlangıçta tek bir toplu hazırlanan ve alt-bölünmemeli 1 x kullanmak için. 3 d boyunca, iki analistler tahlil birçok tahlil duyarlığını göstermek için QCs kümesi ile gerçekleştirilen. Gösterilen örnek verilerde QCs için Inter ve içi tahlil duyarlık % CV % CV < %20 (Şekil 6)1FDA rehberlik'ın önerisi daha az bulunmaktadır.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57777/57777fig6.jpg"> Şekil 6: üç gün içinde iki analistler ile oluşturulan QC hassas veri örneği. Kesinlik verilerinin bir DeSilva vd. sunulan formülü kullanarak varyans analizi (ANOVA) tarafından hesaplanan 28. içi-toplu (içinde çalışır) ve (çalıştırma arasında) arası toplu istatistikleri % CV. rapor edilen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57777/57777fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay at JoVE.com

Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

Burada nötralize antikorlar veya enzim replasman terapiler beyin omurilik sıvısı (BOS) veya insan serumu gibi insan bir matris hücresel alımını müdahale diğer faktörler tespit etmek için bir hücre tabanlı akış sitometresi Yöntem mevcut.

Enzim replasman terapileri ile hücre tabanlı tahlil hücresel alımını nötralize antikorların tespiti

The administration of enzyme replacement therapies (ERTs) and other biologic therapies to patients may elicit an anti-drug immune response. The ...

detection-antibodies-that-neutralize-cellular-uptake-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.7K Görüntüleme.  BioMarin Pharmaceutical Inc. Burada nötralize antikorlar veya enzim replasman terapiler beyin omurilik sıvısı (BOS) veya insan serumu gibi insan bir matris hücresel alımını müdahale diğer faktörler tespit etmek için bir hücre tabanlı akış sitometresi Yöntem mevcut.

Video: Detection of Antibodies That Neutralize the Cellular Uptake of Enzyme Replacement Therapies with a Cell-based Assay

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzim-linked immünospot Testi (ELISPOT): Th-1 Mikrobiyal antijenlere karşı hücresel immün cevaplar Kantitasyonu

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

Entamoeba histolytica DNA ve tRNA Metiltransferaz Dnmt2 (Ehmeth) Enzim ile in vitro tRNA Metilasyon Testi

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Hepatit C Virüsü Karşı İnsan laktoferrinin Hücresel Alımı ve İlişkili Antiviral Aktivite Monitör İmmünofloresan

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Timus bağlı ve timus bağımsız immünglobulin izotip yanıt Immunosorbent Assay enzim bağlı kullanarak farelerde karakterizasyonu

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully investigate MCPyV molecular biology and oncogenic mechanisms have been hampered by a lack of adequate cell culture models. Here, we describe a set of protocols for performing and detecting MCPyV infection of primary human skin cells. The protocols describe the isolation of human dermal fibroblasts, preparation of recombinant MCPyV virions, and detection of virus infection by both immunofluorescent (IF) staining and in situ DNA-hybridization chain reaction (HCR), which is a highly sensitive fluorescence in situ hybridization (FISH) approach. The protocols herein can be adapted by interested researchers to identify other cell types or cell lines that support MCPyV infection. The described FISH approach could also be adapted for detecting low levels of viral DNAs present in the infected human skin.

Here, we present a protocol to infect primary human dermal fibroblast with MCPyV. The protocol includes isolation of dermal fibroblasts, preparation of MCPyV virions, virus infection, immunofluorescence staining, and fluorescence in situ hybridization. This protocol can be extended for characterizing MCPyV-host interactions and discovering other cell types infectable by MCPyV.

Merkel Hücresi Polyomavirus enfeksiyon ve algılama

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...