彼女の知的入力と有用なコメントがエイミー ピュー-ベルナールに感謝したいと思います。この作品は、生物医学研究賞のベッチャー財団ウェッブ waring 氏と番号 K23 1K23AR070897 NIH からエレナ大学院謝によって支えられました。彼女はまた子供の健康、スタンフォード CTSA UL1 TR001085 と子供の健康の研究のため受賞番号 K12 HD000850ユーニス · ケネディ · シュライバー国立研究所からの母子保健と人間開発とルシル Packard 財団によって支えられました。スタンフォード大学の研究所の大学。

ここで説明したすべてのメソッドで、コロラド州複数制度レビュー ボード (COMIRB) のコロラド州の大学を承認されています。フィルター処理されたピペット チップで、特記しない限り、滅菌のティッシュ文化フードの下すべての記載されている手順を実行すべき、すべて試薬フィルターします。
1. 末梢全血処理試薬の調製
<ol><li>準備 ruxolitinib ストック因数 (10-15 μ L/バイアルのシングルユース) 10 mM で製造元の指示に従って (-80 ° C で保存) DMSO で凍結乾燥試薬を希釈します。DMSO 濃度を 0.2% (巻/巻) 下処理コントロールを含むすべてのアッセイにおいて。</li>
	<li>R848 を準備 (resiquimod) 在庫因数 (10-15 μ L/バイアルのシングルユース) として滅菌水の凍結乾燥試薬を希釈して 1 μ g/μ L で、製造元の指示に従って。-80 ° C でストア</li>
	<li>製造元の指示に従って滅菌水の凍結乾燥試薬を希釈してリポ多糖 (LPS) ストック因数 (1 回のみ使用のバイアルあたり 5 μ L) 1 μ g/μ L でを準備します。-80 ° C でストア</li>
	<li>0.02% ナン30.5 %bsa、PBS を使用して細胞染色メディア (CSM) を準備します。</li>
	<li>取得し、タンパク質輸送阻害剤 (PTI) カクテル (資材表) を準備してください。</li>
	<li>解凍し、ruxolitinib ストック バイアル (10 mM) 1:10 滅菌 PBS (1 mM) で希釈します。ティッシュ文化フードの室温で置いておきます。</li>
	<li>解凍し、R848 株式バイアル (1 μ g/μ L) を 1:10 滅菌 PBS で希釈 (0.1 μ g/μ L)。ティッシュ文化フードの室温で置いておきます。</li>
	<li>解凍し、滅菌 PBS 中に組合ストック バイアル (1 μ g/μ L) の 1: 100 希釈 (0.01 μ g/μ L)。ティッシュ文化フードの室温で置いておきます。</li>
	<li>あらかじめ滅菌 RPMI (L-グルタミン) (少なくとも 10 分) の標準の 37 ° C の水浴中を温めます。</li>
	<li>1:5 でフィルター処理された ddH2O (作業濃度) (滅菌する必要はありません) または卓上 lyse/修正プログラム バッファーを希釈します。 注: 全血 1 mL 20 mL の溶解/修正プログラム バッファーの使用濃度が必要です。<ol>
<li>全血各 (少なくとも 100 mL) 1 mL の 5 条件の溶解/修正プログラム バッファーを作る。全血 (37 ° c まで必要な lyse/修正プログラム ソリューションを維持) の 1 ミリリットルあたり 50 mL の円錐管に lyse/修正プログラム バッファーの作業濃度の分注 20 mL。ラベルを次のように溶解/修正プログラム バッファーを含む円錐管の条件: T0 (時間 0) T6 + 5R (時間 6 h 5 uM ruxolitinib)、T6 + R848 (1 μ g/ml の R848 6 h を時間)、T6 + LP (0.1 μ g/mL lps 時間 6 h) T6 (時間 6 h)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ラベルの下部キャップ滅菌ポリスチレン管とステップは 1.10 と同じ名目で 1 mL 遠心チューブをラウンドします。</li>
</ol>2. 刺激し末梢全血 (図 1) の処理
<ol><li>ラウンド下ポリスチレン チューブ ステップ 1.11 から (T0、T6 + 5R、T6 + R848、T6 + LP、T6) ラックにラベルを配置します。 注: 次のすべての手順を行った管のこのタイプの指定がない限りティッシュ文化フードと無菌性を維持するためにインキュベータ間転送するときチューブをキャップします。</li>
	<li>チューブ (T0、T6 + 5R、T6 + R848、T6 + LP、T6) のそれぞれに 37 ° C RPMI (L-グルタミン) の 1 つの mL を追加します。数回、採血管を反転、各管に全血 1 mL を追加し、上下に数回 RPMI で徹底的にミックスするピペット、(RPMI で希釈は、6 時間の潜伏期間中に血液の凝集を防ぐ)。</li>
	<li>1:10 の 10 μ L を追加 T6 + 5R ruxolitinib。P1000 ピペットを徹底的にミックスします。37 ° C でインキュベーターでチューブのラックを置き、孵化のタイミングを開始 (T = 0)。</li>
	<li>T0 サンプルのように処理します。<ol>
<li>20 mL の 37 ° C 作業濃度溶解/修正プログラム バッファーを含むラベルの付いた円錐管にピペットの T0 管の全体の内容。細胞回復を最適化するためには、濃度溶解/修正プログラム バッファー管をすすいでください。円錐形の管を反転でミックスします。</li>
		<li>換散の固定できるように 15 分の 37 ° C で孵化させなさい。次の固定、ベンチトップでのすべての後続の手順を実行します。室温で 5 分間 500 x g で細胞を遠心します。</li>
		<li>上清をデカントします。1 mL の氷冷 PBS、ペレットを分割するのに細胞を再懸濁します、PBS で 15 mL のボリュームに円錐形を埋めます。</li>
		<li>室温で 5 分間 500 x g で細胞を遠心します。上清をデカントします。ペレットが赤い場合は、PBS 洗浄 (手順 2.4.3–2.4.4) を繰り返します。ペレットを分割し、抗体の汚損のためのラベル付き遠心管 (ステップ 1.11) に転送する CSM の 1 mL の細胞を再懸濁します。自動化された細胞カウンターまたは検定を使用してセルをカウントする 10 μ L のサンプルを取る。 注: すべてのセルがこの時点で固定されているため、性染色を含める必要はありません。</li>
		<li>室温で 5 分間 500 x g で細胞を遠心します。残気量の ~ 60 μ L のペレットを残して上清を吸引します。その他の条件からのサンプルは、処理が完了するまでは、このペレット氷の上を保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>T = 30 分管ラック (ステップ 2.3) をティッシュ文化フードに移動し、以下を実行します。<ol>
<li>0.1 μ g/μ L の 10 μ L を追加 T6 + R848 R848。P1000 ピペットを徹底的にミックスします。</li>
		<li>T6 + LP に 0.01 μ g/μ LPS の 10 μ L を追加します。P1000 ピペットを徹底的にミックスします。</li>
		<li>T6、T6 と 5 r、T6 + (しかしないT6 + R848) LPS に蛋白質輸送阻害剤 (500 X の株式) の 4 μ L を追加し、インキュベーターに T までサンプルを返す = 6 h ミックス P1000 ピペットすべて 2 h で徹底的に。 注: R848 小 TLR アゴニストは、したがってその標的受容体へのアクセスを許可する蛋白質輸送阻害剤の添加で一時的な遅れが必要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>T = 2 h タンパク質輸送阻害剤カクテル (500 X の株式) の 4 μ L を加える T6 + R848 チューブ。すべてのサンプルを混ぜて P1000 ピペットと T までインキュベーターにラックを返す = 6 h。</li>
	<li>T で 1 つのより多くの時間、P1000 でサンプルをミックス = 4 h。</li>
	<li>T = 6 h を T6、T6 + LP、T6 + R848、T6 処理 + 5R 血液サンプル チューブに記載手順 T0 サンプルの 2.4。</li>
	<li>細胞ペレットを将来の日付で処理する-80 ° C で残留の CSM のボリュームに格納します。また、バーコードと抗体染色を格納せずに進みます。</li>
</ol>3. バーコードの血液細胞の分離・固定
<ol><li>ゆっくりと氷上;-80 ° C のストレージから分離固定細胞サンプルを解凍します。最大 20 個のサンプルのユニークなバーコードでラベル付けできますが、このシステムを使用してプールします。1:10 と PBS; によって 10 の X barcoding パーマ バッファーを希釈します。サンプル 1 〜 3 mL の十分なバッファーを作る。</li>
	<li>CSM と 1 X barcoding パーマ バッファー 1 つ 1 つの非滅菌トラフを入力します。氷の 1 mL を追加し、新鮮なマスクのサンプルの冷たい CSM ピペット、徹底的に混ぜてし、それぞれ事前ラベルの付いたポリプロピレン クラスター チューブに転送。</li>
	<li>自動化された細胞カウンターまたは検定を使用してセルをカウントする 10 μ L のサンプルを取る。1.5-2 各クラスター チューブのサンプルあたり 10 の6セル × セル数を正規化: 削除し、余分な細胞は 2 x 10 の6セル上のボリュームを破棄します。</li>
	<li>室温で 5 分間 600 x g で細胞を遠心します。マルチ チャンネル ピペットと 600 x g で室温で 5 分間遠心 1 X barcoding パーマ バッファーの 1 mL の細胞を再懸濁します。上清を離れて吸い出しなさい。</li>
	<li>サンプルのバーコードと一致するようにバーコード キーに記載されている同じ順序でラックにクラスター チューブのラインアップします。マルチ チャンネル ピペットで 800 μ L 1 バーコード パーマ バッファー X を追加すると、セル損失を低減するピペット チップ (ない混合) と細胞ペレットに触れることがなくクラスター チューブのすべてのサンプル。クラスター チューブをラック置いておきます。</li>
	<li>-20 ° C と室温で融解から 20-プレックス Pd バーコード キット チューブ ストリップを削除します。1 X barcoding パーマ バッファーの 100 μ L を加えて混和、クラスター チューブ内の対応するセルのサンプル再懸濁バーコード ミックス 120 μ に転送。</li>
	<li>個別にバーコード サンプル間交差汚染がないように、マルチ チャンネル ピペットによって徹底的にミックスします。クラスター用セルのラベルにバーコードを許可する部屋の温度で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>室温で 5 分間 600 × g で遠心分離機します。、上清を吸引し、CSM の 1 mL で再懸濁します。</li>
	<li>遠心分離機し、ステップ 3.8 のように再び CSM で再懸濁します。 注: 各サンプルに一意のバーコード ラベルが作成されました、サンプルはプールする準備ができています。</li>
	<li>室温で 5 分間 600 × g で遠心し、上清を吸引します。シングル ピペットと同じチップを使用して、転送 〜 70-80 のすべての細胞のペレット 1 ポリスチレン管 μ L 残気量。ピペットの先端をイジェクトしません。このヒントでシングル ピペット置いておきます。</li>
	<li>マルチ チャンネル ピペットと新しいヒント、細胞回復を最大化する各元のクラスター チューブに 〜 100 μ L CSM を追加します。脇に設定された先端の単一のピペットと同じポリスチレン管に 〜 100 μ L 残留量のすべての細胞のペレットを転送します。</li>
	<li>CSM をポリスチレン管 (〜 3 mL) を先頭に追加します。数とレコード プールされたバーコードのセルの数を設定します。室温で 5 分間 600 × g で遠心し、上清を吸引します。同じ日にバーコード サンプルを染色に進みます。 メモ: バーコード処理に 〜 20-30% のセル損失を期待することは正常です。</li>
</ol>4. バーコードの染色によって/血液細胞と分析のための準備に固定質量フローサイトメトリー装置
注: 各 1 X 抗体抗体の汚損 (1 μ L あたり 100 抗体の μ L 反応染色)、通常 3-4 x 10 の6セルを汚すことができます。したがって、すべてのバーコードのサンプルは 1 つの管にプールされるとき抗体の量をスケール アップする必要があります。バーコード サンプルがのみ、10 X 抗体価、各サンプルを個別に、染色ではなく抗体 (1 X あたりの 20 倍量を必要とするを必要がある場合は 30 x 106セル、および各 1 X 価 20 バーコード サンプル量は、3-4 x 10 の6セルを汚すことができる、個々 の管)。セル番号に抗体の濃度は、それぞれ個々 の抗体のカクテルの (ここでは説明しません) 慎重に滴定する必要があります。
<ol><li>表面の染色とサイトカイン誘導抗体 (資材表) を用いて細胞を染色します。<ol>
<li>カクテルを作る表面の汚損に追加と会計のピペッティング エラー量を計算することによって (すなわち、各サンプルの 2 x 10 の6セルの 20 のバーコード サンプルを汚す場合価染色 × 10 が必要です; 最終巻計算のため誤差を補正ピペッティング 10.5 X 最終的なソリューションを染色することによって)。</li>
		<li>バーコード細胞ペレットにボリュームを染色表面の価値がある 10 X を追加します。同じチップでのセル損失を減らすためにミックスし、表面の汚れと細胞ペレットの量を測定します。</li>
		<li>細胞と染色カクテルの量に基づいて、最終的な染色細胞サンプル (すなわち、20 サンプル、20 = 1 mL × 50 μ L のセットを実行している場合) 数あたり 50 μ L 量に CSM を追加します。4 ° C で 30 分間インキュベートします。染色を促進するサンプル 15 分毎を揺り動かしなさい。</li>
		<li>表面の汚れ、インキュベーション中に希釈 1:10 フィルター ddH2によって透過性、2 mL と 5 mL の洗浄のための o. 準備ボリューム パーマ/洗浄バッファー (材料表) を準備します。4 ° c または氷の上に保ちます。</li>
		<li>染色の CSM は、管表面の締めくくり、4 ° C で 600 x g で 5 分間遠心上清を吸引します。4 ° C、1:10 の 2 mL でバーコード サンプルを再懸濁します希釈パーマ/洗浄バッファー。完全にセルを permeabilize 20-30 分のための 4 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>4 ° C、5 分で 600 × g で遠心し、上清を吸引します。</li>
		<li>細胞内染色 (表面の汚損) に関しては同様の染色手順に従います。ただし、4 ° C、1:10 を使用して合計のセルの細胞内染色を通して permeabilizing の環境のまま、ボリュームを染色する CSM ではなく希釈パーマ/洗浄バッファー。</li>
		<li>細胞表面にカクテルの抗体染色と細胞ペレット (手順 4.1.2–4.1.17) グリセリンを追加します。携帯サンプル数あたり 50 μ L にボリュームを染色の合計をもたらします。4 ° C で 60 分間インキュベートします。染色できるようにサンプル 15 分毎を揺り動かしなさい。</li>
		<li>細胞内染色中インターカレーター ソリューションの準備: 900 μ L フィルター処理された PBS + フィルター 16% の 100 μ L の PFA (1.6% の最終的な集中 PFA) + 500 uM のインターカレーター色素 (材料表) の 0.2 μ L。</li>
		<li>パーマ/洗浄バッファー細胞ペレット + 細胞抗体カクテル冷たい 1:10 トップします。</li>
		<li>4 ° C、5 分で 600 × g で遠心し、上清を吸引します。CSM と染色したチューブの締めくくり。カウントし、細胞の数を記録します。4 ° C、5 分で 600 × g で遠心し、上清を吸引します。ステップ 4.9 からインターカレーター溶液 1 mL の細胞を再懸濁します。室温におけるインターカレーションで少なくとも 20 分間インキュベートまたは 4 ° C (インターカレーター ソリューションのサンプルが 4 ° C で最大 1 週間滞在質量フローサイトメトリー装置にそれらを実行する前に) で一晩します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>質量フローサイトメトリー装置のセルを準備します。<ol>
<li>フィルター処理された ddH2O、3 mL と 600 x g で 4 ° C で 5 分間遠心管の締めくくりこの懸濁液は破片や質量フローサイトメトリー装置を詰まらせる可能性があります可能性のある集計をすべて削除する 100 μ m フィルターを通過フィルター ddH2o. を渡す 3 mL のセルを再停止しなさい。</li>
		<li>カウントし、セルの番号後ろ過を記録します。600 x g で 4 ° C で 5 分間遠心</li>
	</ol>
</li>
	<li>1:10 フィルター ddH2o. でそれを希釈することによってビードのキャリブレーションソリューション (材料表) の準備します。</li>
	<li>ステンド グラス、再懸濁します 1:10 の必要なボリュームのセル希釈キャリブレーションソリューション ビーズ 〜 106セル/mL x 1 の細胞濃度を達成するために。 注: 45 μ L/分 CyTOF1、推奨される最適なは 5 x 10 の5セル/mL;30 μ L/分、7.5 x 105セル/mL でヘリオスの</li>
	<li>質量フローサイトメトリー装置9サンプルで実行に進みます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Walsh, S. J., Rau, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+diseases:+a+leading+cause+of+death+among+young+and+middle-aged+women+in+the+United+States.">Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States.</a> American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).</li><li>Mak, A., Cheung, M. W. -. L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+trend+of+survival+and+damage+of+systemic+lupus+erythematosus:+meta-analysis+and+meta-regression+of+observational+studies+from+the+1950s+to+2000s.">Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s.</a> Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).</li><li>Kaul, A., Gordon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.">Systemic lupus erythematosus.</a> Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).</li><li>Annunziato, F., Romagnani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+effector+CD4++T+cells.">Heterogeneity of human effector CD4+ T cells.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 11 (6), 257 (2009).</li><li>Peck, A., Mellins, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+T-cell+phenotype+and+function:+the+T+helper+type+17+example.">Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example.</a> Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).</li><li>Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+stories+on+Th17+cells.">More stories on Th17 cells.</a> Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).</li><li>Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiparametric+analysis+by+mass+cytometry.">Highly multiparametric analysis by mass cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).</li><li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS.">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li><li>Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Mass+Cytometry+of+Differential+Immune+and+Drug+Responses+Across+a+Human+Hematopoietic+Continuum.">Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum.</a> Science. 332 (6030), 687-696 (2011).</li><li>Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Cytometry:+Technique+for+Real+Time+Single+Cell+Multitarget+Immunoassay+Based+on+Inductively+Coupled+Plasma+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry.">Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).</li><li>Rahman, A., Isenberg, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.">Systemic lupus erythematosus.</a> The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).</li><li>O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems-level+analysis+of+human+Toll-like+receptor+activation+defines+a+chemokine+signature+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus.">Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).</li><li>O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry+identifies+a+distinct+monocyte+cytokine+signature+shared+by+clinically+heterogeneous+pediatric+SLE+patients.">Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients.</a> Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).</li><li>Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).</li><li>Amir, E. -. A. D., Davis, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).</li><li>Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+identification+of+stratifying+signatures+in+cellular+subpopulations.">Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).</li><li>Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-Driven+Phenotypic+Dissection+of+AML+Reveals+Progenitor-like+Cells+that+Correlate+with+Prognosis.">Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).</li><li>Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMMUNOLOGY.+An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system.">IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425 (2015).</li><li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry.">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).</li><li>Jansen, K., Blimkie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+flow+cytometric+high-throughput+assay+to+analyze+the+innate+immune+response+to+Toll-like+receptor+stimulation.">Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).</li><li>Zunder, E. R., Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+(CyTOF).">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry Part A. , (2015).</li><li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).</li><li>Finck, R., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry+panel+optimization+through+the+designed+distribution+of+signal+interference.">Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで小説、単一セル、種類の免疫細胞を同時に評価し、患者の固有の"病原性「末梢血中循環要因環境の中で、さまざまなサイトカインの摂動を検出するプロテオミクスの手法について述べる。このメソッドでは、分析の車両と免疫細胞の表現型および機能異常の評価のためのツールとして質量フローサイトメトリー末梢全血を採用しています。メソッドは、人間およびマウス研究<sup class="...

自己免疫疾患は、罹患率と死亡率が人口の 3-8% に影響を与える主要な原因です。自己免疫疾患は若年・中年層の女性の間で死の主要な原因の中で、アメリカ合衆国 (年齢 < 65 歳)1,2。自己免疫疾患は、異機種混在の臨床プレゼンテーションと多様な基になる免疫学プロセスによって特徴付けられます。不均一性のスペクトルも共同参画慢性関節リウマチ (RA) と神経疾患多発性硬化症 (MS) などの別の疾患の間で表されます。ただし、このレベルの不均一性の全身性エリテマトーデス (SLE) など、単一の障害内例でも: 何人かの患者は腎病理呈することがある血液や共同関与3他の人苦しむ間。
自己免疫疾患の基になる回は自動とハイパー-アクティブ化の複数の自然免疫と適応免疫細胞サブセットおよびサイトカイン産生調節不全の合併を含む、臨床不均質をミラー化します。サイトカインは、自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たす、間は病気のメカニズムでの特定の役割を理解することに挑戦すると証明しました。サイトカインの発現によって特徴付けられる (1 つのサイトカインは、異なる種類の細胞に複数の効果を持つことができます)、(多数のサイトカインが同じ効果を持つことができます) の冗長性、二元性 (1 つのサイトカインは、異なる条件の下でプロや抗炎症効果を持つことができます)、可塑性 (サイトカインはその「オリジナル」の 1 つは、環境に応じて異なる役割に成形することができます)4,5,6。その結果、人口レベルのメソッドは、同じ「サイトカイン ・ ミリュー」レスポンスの異種細胞を区別できません。同様に、免疫システム (単一の細胞型またはサイトカイン) の 1 つの特定の側面に焦点を当てる研究デザインは、複雑な自己免疫疾患に関連するすべての要素のグローバル アセスメントを提供していません。患者血清を用いた研究では、自己免疫に重要な洞察を与えている、間、調節不全サイトカインの検出の特定の細胞源は提供しません。
最近では、同時に複数の免疫細胞の種類を評価し、患者の固有の"病原性「末梢血中循環要因環境の中で、さまざまなサイトカインの摂動を検出する単一細胞プロテオミクス手法を開発しました。ここで説明したワークフローは、孤立した末梢血単核球 (PBMCs) ではなく、そのまま末梢全血サンプルの使用が特徴です。末梢全血を表します (すなわち、好中球、血小板)、自己免疫疾患および 2) 血漿中しばしば関与 1) 非単核白血球細胞を含む、全身性の免疫疾患を勉強する最も生理学的関連車両核酸、免疫複合体、サイトカインなどの要因を循環免疫活性化の役割があります。キャプチャする、"本質的な病原性「サイトカイン産生調節不全、末梢血サンプル処理直後に血液 (T0、時間ゼロ) とタンパク質輸送の 37 ° c (生理的体温) 6 時間後「本質的な」病気の状態 (図 1) を反映するサイトカイン産生 (蓄積、T6 T0) を検出する外因性刺激条件 (T6、時間 6 h)、不在の阻害剤。外因性物質と扱われる (タンパク質輸送阻害剤と 37 ° C で 6 時間培養) を上反映調節不全プロセスやシグナル伝達経路、病気に関連する免疫応答に関与する末梢血サンプルの下活性化研究サイトカイン産生核酸への応答を反映するを検出する (T6 + R848、時間 6 h 1 μ g/ml の R848)、SLE の場合フリー ダイヤル様受容体 (TLR) アゴニストなどの病気の発症を反映する条件を刺激 (対 T0、T6 T6 対の比較 +R848、図 1)。特定の患者のための免疫調節不全の正確なプロセスに関連する利用できる治療前のヴィヴォの免疫調節効果を勉強するには、末梢血サンプルは治療に関連する JAK 阻害で扱われています。濃度 (ここでは、5 uM ruxolitinib;T6 + 5R、時間 6 h 5 uM ruxolitinib)、(対 T0、T6 T6 対 + 5R、図 1) 薬物への応答で「本質的な」病気の状態の変化を検出します。JAK 阻害剤がラーなど自己免疫疾患の治療に成功するために示されているために、この研究のため選ばれたの JAK 阻害剤
同時に複数の免疫細胞のサブセットは、sle 患者末梢血サンプルで説明した調節不全のプロセスを評価するには、患者と健常者だった前述の処理し、質量フローサイトメトリーで分析します。として知られているフローサイトメトリー-飛行時間型の質量フローサイトメトリーはスペクトルの問題7,8,9の重複なし 40 を超えるパラメーターの単一細胞解析を提供しています。この手法は、行きの抗体の同時10の代わりにタグとして水溶性の金属イオンの形で希土類金属の同位体を利用しています。リチャードライポルトらとマッカーシーらの (すなわち、チューニングし校正、サンプルの収集) 質量フローサイトメトリーの技術プラットフォームに関する詳細を見つけることができます。11,12質量フローサイトメトリーの高次元単一セルの粒度 (材料表) と自然免疫と適応免疫の細胞のサブセットの中で複数のサイトカインの同時測定が可能。 にします。
従来の臨床的および検査パラメーターを現在は多くの場合機密情報や継続的な疾患活動性または特定免疫13より根本的な免疫を線引きする必要性を反映する応答を検出するために十分に特定再燃をドライブの変更。自己免疫疾患におけるサイトカイン調節不全の普及を考えると、抗体または小分子阻害剤サイトカインをターゲットやサイトカイン産生の調節に関与するタンパク質のシグナルを使用する処置のアプローチの茄多があります。最近浮上しました。その基本的な形式では、ここで説明した末梢血分析アプローチは、患者固有の調節不全の細胞のサブセットと全身症状と自己免疫疾患での異常なサイトカイン生産を識別するためのプラットフォームを提供します。この方法により治療法の選択の個人用設定を特定の調節不全サイトカインを識別できるとオプションは、特定の治療法をテスト immunomodulate する能力を評価するためにex vivo患者特定疾患プロセス。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ruxolitinib</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-364729A</td>
			<td>Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R848</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-r848-5</td>
			<td>Stock Conc: 1 &#956;g/&#956;L; Final Conc: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EK</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>Stock Conc: 1 &#956;g/&#956;L; Final Conc: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix Buffer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>558049</td>
			<td>Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;BD Phosflow perm/wash buffer I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>557885</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Stock Conc: &#62;99.9%; Final Conc: 0.0002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (PTI)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>00-4980-93</td>
			<td>Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Intercalator</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192B</td>
			<td>Stock Conc: 500 &#956;M; Final Conc: 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Media (CSM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Barcode Perm Buffer</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201057</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-plex Pd Barcode Set</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>S0014</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ TM Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% MeOH-free Formaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28908</td>
			<td>Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-496</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cluster tubes</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-9001</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios CyTOF instrument</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Helios</td>
			<td>All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 M&#937;.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies used for Mass Cytometry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L161</td>
			<td>Mass: 161</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>Mass: 144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SK3</td>
			<td>Mass: 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD7</td>
			<td>BD</td>
			<td>M-T701</td>
			<td>Mass: 149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SK1</td>
			<td>Mass: 142</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>ICRF44</td>
			<td>Mass: 209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c</td>
			<td>BD</td>
			<td>B-ly6</td>
			<td>Mass: 152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD15</td>
			<td>BD</td>
			<td>HI98</td>
			<td>Mass: 115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>Mass: 154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>eBioscience/Thermo</td>
			<td>B73.1</td>
			<td>Mass: 165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SJ25C1</td>
			<td>Mass: 163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Bu32</td>
			<td>Mass: 141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>L128</td>
			<td>Mass: 155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>HIT2</td>
			<td>Mass: 172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 total</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HI30</td>
			<td>Mass: 89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HI100</td>
			<td>Mass: 153</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>REA196</td>
			<td>Mass: 168</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66</td>
			<td>BD</td>
			<td>B1.1/CD66</td>
			<td>Mass: 113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>IT2.2</td>
			<td>Mass: 150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>6H6</td>
			<td>Mass: 143</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD278/ICOS</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>C398.4A</td>
			<td>Mass: 156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD179/PD1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>EH12.2H7</td>
			<td>Mass: 162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>IA6-2</td>
			<td>Mass: 146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>MHM-88</td>
			<td>Mass: 151</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR5</td>
			<td>BD</td>
			<td>RF8B2</td>
			<td>Mass: 173</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLADR</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L243</td>
			<td>Mass: 167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>364-3B3-14</td>
			<td>Mass: 147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>H1b-98</td>
			<td>Mass: 169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1RA</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>AS17</td>
			<td>Mass: 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>MQ2-13A5</td>
			<td>Mass: 164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-8</td>
			<td>BD</td>
			<td>E8N1</td>
			<td>Mass: 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12/IL-23p40</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>C8.6</td>
			<td>Mass: 171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>BL168</td>
			<td>Mass: 148</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL23p19</td>
			<td>eBioscience/Thermo</td>
			<td>23dcdp</td>
			<td>Mass: 176</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP1&#946;</td>
			<td>BD</td>
			<td>D21-1351</td>
			<td>Mass: 158</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP1</td>
			<td>BD</td>
			<td>5D3-F7</td>
			<td>Mass: 170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#945;</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>LT27:295</td>
			<td>Mass: 175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>4S.B3</td>
			<td>Mass: 165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTEN</td>
			<td>BD</td>
			<td>A2B1</td>
			<td>Mass: 159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Mab11</td>
			<td>Mass: 166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling&#160; Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of immunophenotype and cytokine production in peripheral whole blood via mass cytometry

サイトカインは、自己免疫疾患の発症に重要な役割を果たします。したがって、サイトカインの測定以降自己免疫自己寛容の崩壊へとつながる正確なメカニズムを理解する試みの複数の研究の焦点となっています。アプローチはこれまで免疫システム (単一または少数細胞の種類またはサイトカイン) の 1 つの特定の側面に関する研究に基づいているし、複雑な自己免疫疾患の世界的な評価を提供していません。患者血清を用いた研究では、自己免疫に重要な洞察を与えている、間、調節不全サイトカインの検出の特定の細胞源は提供しません。循環要因、「本質的な」患者固有のプラズマのコンテキスト内で、複数の免疫細胞サブセットにおけるサイトカイン産生を評価する包括的な単一セルのアプローチを紹介します。このアプローチにより、患者固有の免疫表現型 (表面マーカー) の監視といずれかのネイティブ関数 (サイトカイン)"組み込み病原性」病状態、または治療薬 (in vivoまたは前のヴィヴォ) の存在。

図 1を示して刺激のためのワークフローと血液サンプル因数の配分などを含めた末梢血サンプルの処理刺激剤、タンパク質の添加のタイミング輸送阻害剤カクテル、およびインキュベーション赤血球 (RBC) 換散および固定までの時間。刺激的なエージェントの選択は、評価の対象となるシグナルとサイトカイン経路によって異なります。たとえば?...

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Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

イムノフェノ タイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

免疫表現型と機能 (細胞内サイトカイン誘導) を評価する単一細胞プロテオミクスの手法をここで述べる末梢全血サンプル、大量のフローサイトメトリーによる分析の変化。

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

single-cell-analysis-immunophenotype-cytokine-production-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K ビュー.  University of Colorado School of Medicine. 免疫表現型と機能 (細胞内サイトカイン誘導) を評価する単一細胞プロテオミクスの手法をここで述べる末梢全血サンプル、大量のフローサイトメトリーによる分析の変化。

ビデオ: Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

免疫・感染学

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

全血の表現型アッセイを用いて多施設臨床試験のための主要な末梢血白血球集団の列挙

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

末梢血からのヒトアロ抗原特異的T細胞の生成

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

ヒト末梢血の免疫表現型分析のための抗体のカクテルを準備する半自動のアプローチ

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

イムノフェノタイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

要約

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の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

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