우리는 그녀의 지적 입력 및 도움이 의견에 대 한 아미 Pugh-버나드를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 Boettcher 재단 웹 Waring 생명 의학 연구 상 및 수상 수 K23 1K23AR070897는 NIH에서 엘레나 W.Y. 셰에 의해 지원 되었다. 그녀는 또한 어린이 건강, 스탠포드 CTSA UL1 TR001085, 및 아동 건강 연구를 위한 아동 건강 및 인간 개발 및 루 패 커드 재단의 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소에서 보너스 번호 K12-HD000850에 의해 지원 되었다 연구소의 스탠포드 대학입니다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 여는 콜로라도 여러 기관 검토 위원회 (COMIRB)의 콜로라도의 대학 승인 되었습니다. 필터링 된 피 펫 팁, 명시 되지 않는 한 아래의 모든 설명된 절차 무 균 조직 문화 후드에서 수행 해야 하 고 모든 시 약 필터링.
1. 주변 전체 혈액 처리용 시 약의 준비
<ol><li>준비 ruxolitinib 재고 aliquots (10-15 μ/단일 사용에 대 한 유리병) 10 m m (-80 ° C에 게) 제조업체의 지침에 따라 DMSO에 동결 건조 된 시 약을 diluting 하 여. 0.2% (vol/vol) unstimulated 컨트롤을 포함 하 여 분석 하는 모든 실험에서 DMSO 농도 유지.</li>
	<li>R848 준비 (resiquimod) 재고 aliquots (10-15 μ/단일 사용에 대 한 유리병)로 살 균 물에서 동결 건조 된 시 약을 희석 하 여 1 μ g/μ에는 제조업체의 지시 당. -80 ° c.에 게</li>
	<li>제조업체 지침에 따라 살 균 물에서 동결 건조 된 시 약을 diluting 하 여 lipopolysaccharide 1 μ g/μ에서 (LPS) 재고 aliquots (한 시간 전용 유리병 당 5 μ)을 준비 합니다. -80 ° c.에 게</li>
	<li>셀 얼룩 미디어 (CSM) PBS, 0.5% BSA 0.02% 할머니3를 사용 하 여 준비 합니다.</li>
	<li>취득 하 고 유지 준비 단백질 수송 억제제 (PTI) 칵테일 (자료 테이블).</li>
	<li>해 동 하 고 메 마른 PBS (1mm)에 ruxolitinib 재고 유리병 (10mm) 1시 10분 희석. 실내 온도 조직 문화 후드에 따로 설정 합니다.</li>
	<li>해 동 하 고 희석 R848 재고 유리병 (1 μ g / µ L) 살 균 PBS에서 1시 10분 (0.1 μ g / µ L). 실내 온도 조직 문화 후드에 따로 설정 합니다.</li>
	<li>해 동 고는 LPS 재고 유리병 (1 μ g / µ L) 1: 100 살 균 PBS에 희석 (0.01 μ g / µ L). 실내 온도 조직 문화 후드에 따로 설정 합니다.</li>
	<li>미리 살 균 RPMI (없음 L-글루타민) (적어도 10 분)에 대 한 표준 37 ° C 물 욕조에 따뜻한.</li>
	<li>1:5 필터링된 ddH2O (작업 농도)는 벤치탑 (살 균 될 필요 하지 않습니다)에 lyse/수정 버퍼를 희석. 참고: 전체 혈액의 1 mL 20 mL lyse/수정 버퍼의 작업의 필요합니다.<ol>
<li>전 혈 각 (적어도 100 mL)의 1 mL의 5 조건 lyse/수정 버퍼를 확인 합니다. Aliquot 20 mL 전 혈 (계속 필요할 때까지 37 ° C에서 lyse/수정 솔루션)의 밀리 리터 당 50 mL 원뿔 튜브에 lyse/수정 버퍼의 작업 농도의. 라벨을 lyse/수정 버퍼를 포함 하는 것은 다음과 같이 원뿔 관에 조건: T0 (시간 제로), T6 + 5R (시간 6 h 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (1 μ g/mL R848 가진 6 h 시간), T6 + LPS (0.1 μ g/mL LPS와 시간 6 h)에 게, T6 (6 h 시간).</li>
	</ol>
</li>
	<li>레이블은 아래쪽 모자 살 균 폴리스 티 렌 튜브 1 mL microcentrifuge 튜브 단계 1.10에서 동일한 명명법 라운드.</li>
</ol>2. 자극과 주변 전 혈 (그림 1)의 처리
<ol><li>하단 폴리스 티 렌 튜브 단계의 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) 선반에 라운드는 레이블이 배치 합니다. 참고: 다음 단계를 모두 수행 됩니다 튜브의이 종류에서 달리 지정 하지 않는 한. 조직 문화 후드와 불 임을 유지 하기 위해 인큐베이터 간에 전송할 때 튜브를 모자.</li>
	<li>각 튜브 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) 37 ° C RPMI (없음 L-글루타민)의 1 mL를 추가 합니다. 반전 혈액 컬렉션 튜브 여러 번, 전체 혈액의 1 mL 각 튜브를 더하고 RPMI 철저 하 게 혼합을 여러 번 위아래 플라스틱 (RPMI와 희석 6 h 잠복기 동안 혈액의 응집 방지).</li>
	<li>추가 1시 10분의 10 μ T6 + 5R ruxolitinib. P1000 피펫은 철저 하 게 믹스. 37 ° c 배양 기에서 튜브의 랙을 놓고 시작 시기는 부 화 (T = 0).</li>
	<li>T0 샘플을 다음과 같이 처리 합니다.<ol>
<li>T0 튜브의 전체 내용을 포함 하는 37 ° C 작업 농도 lyse/수정 버퍼의 20 mL 레이블이 원뿔 관으로 플라스틱. 최적화 하려면 세포 복구, 작업 농도 lyse/수정 버퍼 튜브를 헹 구 십시오. 원뿔 튜브를 거꾸로 하 여 혼합.</li>
		<li>세포의 용 해 및 고정 수 있도록 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 고정, 다음 벤치탑에서 모든 후속 단계를 수행 합니다. 실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심</li>
		<li>상쾌한을 가만히 따르다. Resuspend 셀 헤어 펠 릿, 얼음 차가운 PBS의 1 mL에 다음 PBS에 채워 볼륨 15 mL 원뿔.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심 상쾌한을 가만히 따르다. 펠 릿은 빨간색 경우 PBS 세척 (단계 2.4.3–2.4.4)를 반복 합니다. CSM는 펠 릿 헤어 다음 항 체 얼룩이 지기에 대 한 레이블된 microcentrifuge 튜브 (1.11 단계)에 전송의 1 mL에 셀 resuspend 자동된 셀 카운터 또는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 10 µ L의 샘플을 가져가 라. 참고: 모든 셀이 시점에서 고정 되어, 이후 아니에요 생존 얼룩을 포함 하는 데 필요한.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심 잔여 볼륨의 ~ 60 µ L에 펠 릿을 떠나 상쾌한 발음 다른 조건에서 샘플 처리 완료 때까지 얼음에이 펠 릿을 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>T = 30 분, 조직 문화 후드에 튜브 랙 (2.3 단계)를 이동 하 고 다음을 수행.<ol>
<li>0.1 μ g/μ의 10 μ 추가 T6 + R848 R848. P1000 피펫은 철저 하 게 믹스.</li>
		<li>T6 + LPS를 0.01 μ g/μ LPS의 10 μ를 추가 합니다. P1000 피펫은 철저 하 게 믹스.</li>
		<li>T6, T6 + 5R, 그리고 T6 + LPS (하지만 하지 T6 + R848)의 단백질 수송 억제제 (500 X 주식) 4 μ를 추가 하 고 T까지 인큐베이터에 샘플 반환 = 6 h. P1000 피 펫 마다 2 h와 철저 하 게 혼합. 참고: R848 endoplasmic TLR 길 항 제 이며, 따라서 그 대상 수용 체에 대 한 액세스 수 있도록 단백질 수송 억제제 이외에 일시적인 지연 필요.</li>
	</ol>
</li>
	<li>T = 2 h, T6 + R848 단백질 수송 억제 물 칵테일 (500 X 주식)의 4 μ 추가 튜브. 모든 샘플 P1000 피 펫 혼합 및 T까지 인큐베이터에 선반을 반환 = 6 h.</li>
	<li>T에서 한 번 더 한 P1000 샘플 혼합 4 h =.</li>
	<li>T = 6 h 처리 T6, T6 + LPS, T6 + R848, 그리고 T6 + 5R 혈액 샘플 튜브에 설명 된 대로 단계 T0 샘플에 대 한 2.4.</li>
	<li>미래의 날짜에 처리-80 ° C에서 잔여 CSM 볼륨에 셀 펠 릿을 저장 합니다. 또는, 바코드 및 저장 하지 않고 얼룩이 지는 항 체를 진행 합니다.</li>
</ol>3. 바코드 Lysed/고정 혈액 세포의
<ol><li>얼음;에 천천히-80 ° C 저장에서 lysed/고정 셀 샘플을 녹여 20 샘플의 최대 고유 바코드와 함께 표시 될 수 있습니다 그리고이 시스템을 사용 하 여 풀링된. 10 X barcoding 페름 버퍼 PBS; 1시 10분으로 희석 샘플 당 ~ 3 mL에 대 한 충분 한 버퍼를 확인 합니다.</li>
	<li>업체인 CSM와 1 X barcoding 페름 버퍼 하나 한 비 살 균 여 물통을 채우십시오. 얼음의 1 mL을 추가 갓 해 동 샘플, 차가운 CSM 피 펫, 철저 하 게 혼합 하 고 각각 미리 레이블이 지정 된 폴 리 프로필 렌 클러스터 관에 전송.</li>
	<li>자동된 셀 카운터 또는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수는 10 μ 샘플을 가져가 라. 각 클러스터 튜브에서 샘플 당 106 셀 x 1.5-2 셀 카운트 정상화: 제거 하 고 2 x 106 셀 이상 초과 셀의 볼륨을 삭제.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 셀 원심 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기와 멀티 채널 피 펫 1 X barcoding 페름 버퍼의 1 mL에 셀 resuspend 상쾌한에서 발음.</li>
	<li>정렬 순서에 있는 선반에 클러스터 튜브 샘플의 바코드와 일치 하도록 바코드 키에 표시 된 대로. 피 펫 팁 (아무 혼합) 셀 손실을 줄이기 위해 셀 펠 릿을 건드리지 않고 멀티 채널 피 펫에 의해 클러스터 튜브에서 모든 샘플 바코드 페름 버퍼 X 800 μ 1을 추가 합니다. 랙 클러스터 튜브와 함께 따로 설정 합니다.</li>
	<li>-20 ° C와 실 온에서 해 동에서 20-플렉스 Pd Barcoding 키트 튜브 스트립을 제거 합니다. 1 X barcoding 페름 버퍼의 100 μ를 추가 하 고, 철저 하 게 혼합 클러스터 튜브에 해당 셀 샘플으로 resuspended 바코드 믹스의 120 μ를 전송.</li>
	<li>개별적으로 바코드 샘플 사이의 교차 오염 없이 되도록 멀티 채널 피 펫에 의해 철저 하 게 혼합. 셀 라벨 바코드 수 있도록 실 온에서 30 분 동안 클러스터 튜브를 품 어.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 원심. 상쾌한, 발음 다음 CSM의 1 mL에 resuspend.</li>
	<li>원심 및 단계 3.8에서 다시 업체인 CSM에 resuspend. 참고: 각 샘플은 이제 고유 바코드 표시 및 샘플 풀링 될 준비가.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. 단일 피 펫과 같은 팁을 사용 하 여, 전송 ~ 70-80에서 모든 셀 펠 릿 한 폴리스 티 렌 튜브에 μ 잔여 볼륨. 피 펫 팁;을 추출 하지 마십시오 단일 피 펫이 팁을 따로 설정 합니다.</li>
	<li>멀티 채널 피 펫과 새로운 팁, 셀 복구를 최대화 하기 위해 각 원래 클러스터 튜브를 ~ 100 μ CSM을 추가 합니다. 팁을 따로 설정 된 단일 피펫으로 ~ 100 μ 잔여 볼륨에서 모든 셀 쥐 똥 같은 폴리스 티 렌 튜브에 전송할.</li>
	<li>폴리스 티 렌 튜브 (~ 3 mL)을 가기에 CSM를 추가 합니다. 수와 기록 풀링된 바코드의 셀 번호 설정합니다. 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. 같은 날에 바코드 샘플을 얼룩이 지기를 진행 합니다. 참고: ~ 20-30% 셀 손실 barcoding 프로세스에서 기대 하는 정상입니다.</li>
</ol>4. 바코드의 얼룩 Lysed/혈액 세포와 분석에 대 한 준비에 고정 대량 Cytometry 악기
참고: 각 1 X titer의 항 체 얼룩이 지기 (100 당 항 체의 1 μ μ 반응 얼룩), 일반적으로 3-4 x 106 세포를 얼룩이 질 수 있다. 따라서, 모든 바코드 샘플 1 개의 관으로 풀링되지 때 항 체의 양은 조절 해야 합니다. 30 x 106 셀, 고 각 1 X titer 20 바코드 샘플 금액 3-4x 106 세포를 얼룩이 질 수 있다, 바코드 샘플만 필요 합니다는 10 X titer를, 각 샘플을 개별적으로 얼룩이 반대로 요구 하는 것의 항 체 (1 X 20 X 금액 개별 튜브)입니다. 휴대폰 번호에 항 체의 농도 각 개별 항 체 칵테일 (여기 설명)에 대 한 신중 하 게 적정 수 한다.
<ol><li>표면 얼룩 및 cytokine 유도 대 한 항 체 (테이블의 재료)를 사용 하 여 셀을 얼룩.<ol>
<li>확인 표면 얼룩 칵테일 추가 및 회계 pipetting 오류 수 금액을 계산 하 여 (즉, 각 샘플에 2 x 106 셀의 20 바코드 샘플 얼룩 titer 얼룩 X 10이 필요, 최종 볼륨 계산 보완할 pipetting 오류에 대 한 최종 솔루션 얼룩 10.5 X를 만들기).</li>
		<li>추가 표면 얼룩 볼륨 바코드 셀 펠 릿을의 가치가 10 배. 같은 팁과 세포 손실을 줄이기 위해 혼합 하 고 표면 얼룩과 셀 펠 릿의 볼륨을 측정 합니다.</li>
		<li>셀과 칵테일 얼룩의 볼륨에 따라 달라 집니다, 셀 샘플 (즉, 20 샘플, 20 = 1 mL X 50 μ의 집합을 실행 하는 경우) 수 당 50 μ의 최종 착 볼륨에 CSM를 추가 합니다. 4 ° c.에 30 분 동안 품 어 얼룩도 홍보 샘플 매 15 분 교 반 하십시오.</li>
		<li>표면 얼룩 인큐베이션 기간 동안 파 마/워시 버퍼 (자료 테이블)에 의해 준비 diluting 1:10 필터링된 ddH2수술 준비 및 볼륨을 permeabilization, 2 mL에 5 mL. 4 ° C에 또는 얼음에 계속.</li>
		<li>얼룩이 CSM, 튜브 표면에서 탑 그리고 5 분에 4 ° C에서 600 x g에서 원심 분리기는 상쾌한 발음. 4 ° C, 1시 10분의 2 mL에 바코드 샘플 resuspend 희석 파 마/워시 버퍼. 20-30 분 완전 세포를 permeabilize 4 ° C에서 품 어.</li>
		<li>5 분 동안 4 ° C에서 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.</li>
		<li>세포내 얼룩 비슷한 얼룩 단계 (표면 얼룩) 따릅니다. 그러나, 4 ° C, 1시 10분을 사용 하 여 셀에 얼룩이 지는 세포내에 걸쳐 permeabilizing 환경에서 계속 볼륨 얼룩 총 수 있도록 CSM 대신 희석 파 마/워시 버퍼.</li>
		<li>세포내 항 체 칵테일 표면에 얼룩이 지 고 셀 펠 릿 (단계 4.1.2–4.1.17) permeabilized를 추가 합니다. 볼륨 셀 샘플 수 당 50 μ를 얼룩이 지는 총을 가져와. 4 ° c.에 60 분 동안 품 어 얼룩도 되도록 샘플 매 15 분 교 반 하십시오.</li>
		<li>세포내 얼룩 동안 준비 intercalator 솔루션: 필터링 된 PBS + 필터링 된 16%의 100 μ의 900 μ PFA (1.6%의 최종 농도 PFA) + 0.2 μ uM intercalator 염료 (자료 테이블)의 500의.</li>
		<li>파 마/워시 버퍼 셀 펠 릿 + 세포내 항 체 칵테일 찬 1:10에서 최고.</li>
		<li>5 분, 4 ° C에서 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. CSM와 얼룩 튜브 떨어져 가기. 계산 하 고 휴대폰 번호를 기록 합니다. 5 분, 4 ° C에서 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. 단계 4.9에서에서 intercalator 솔루션의 1 mL에 셀 resuspend 완전 윤에 대 한 실 온에서 20 분 이상 incubate 또는 (샘플 intercalator 솔루션에 머물 수 있습니다 4 ° C에서 질량 cytometry 악기에 그들을 실행 하기 전에 최대 1 주) 4 ° C에서 하룻밤.</li>
	</ol>
</li>
	<li>대량 cytometry 악기에 대 한 셀을 준비 합니다.<ol>
<li>필터링 된 ddH2O 3 mL와 4 ° c.에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기 튜브 끝 잠재적으로 대량 cytometry 악기를 방해할 수 있는 집계 또는 어떤 파편 든 지 제거를 100 μ m 필터를 통해 필터링 된 ddH2O. 전달의 3 mL에 셀이이 정지를 resuspend.</li>
		<li>계산 하 고 셀 번호 후 여과 기록 합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기</li>
	</ol>
</li>
	<li>1:10 필터링된 ddH2o.에에서 그것을 diluting 하 여 교정 비드 솔루션 (테이블의 자료) 준비</li>
	<li>Resuspend는 스테인드 셀 1시 10분의 필요한 볼륨에 희석 교정 비드 솔루션 1 ~6 셀/10ml x의 세포 농도 달성 하기 위해. 참고: 45 µ L/분에 CyTOF1에 대 한 권장된 최적은 5 x 105 셀/mL; 헬 리오스에서 30 µ L/분, 7.5 105 셀/mL x에 대 한.</li>
	<li>대량 cytometry 악기9에 샘플을 실행 하려면 이동 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).</li><li>Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+identification+of+stratifying+signatures+in+cellular+subpopulations.">Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).</li><li>Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-Driven+Phenotypic+Dissection+of+AML+Reveals+Progenitor-like+Cells+that+Correlate+with+Prognosis.">Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).</li><li>Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IMMUNOLOGY.+An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system.">IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425 (2015).</li><li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry.">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).</li><li>Jansen, K., Blimkie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+flow+cytometric+high-throughput+assay+to+analyze+the+innate+immune+response+to+Toll-like+receptor+stimulation.">Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).</li><li>Zunder, E. R., Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+(CyTOF).">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry Part A. , (2015).</li><li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).</li><li>Finck, R., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry+panel+optimization+through+the+designed+distribution+of+signal+interference.">Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기 소설, 단일 셀, proteomic 접근 방식은 동시에 여러 면역 세포 유형을 평가 하 고 환자 특정 "병원 성" 주변 혈액 플라스마 순환 요인의 주위에 그들의 다양 한 cytokine 물결을 감지 하 여 설명 합니다. 이 방법은 분석 차량과 면역 세포 phenotypic와 기능 이상의 평가 위한 도구로 대량 cytometry로 주변 전 혈을 사용합니다. 메서드는 인간과 쥐 연구21, 쉽게 적용 하 고 다른 면역 기능 분...

자가 면역 질환의 병 적 상태와 사망률 3-8%의 인구에 영향을 미치는 주요 원인입니다. 미국에서는, 자가 면역 질환에서는 젊은이 중 년 여성 사이에서 죽음의 주요 원인 중 (세 < 65 세)1,2. 자가 면역 질환 임상 유형이 다른 프레 젠 테이 션 및 다양 한 기본 면역 프로세스 특징입니다. 이 성분의 스펙트럼은 류 마티스 관절염 (RA) 공동 참여 및 다 발성 경화 증 (MS)에 신경 질환 등 다른 질환에서 잘 표현 된다. 그러나,이의이 수준은 또한 반성 루 푸 스 (SLE) 등 단일 장애 내 궁 행: 다른 혈액 또는 공동 참여3에서 고통을 하는 동안 일부 환자 신장 병 리, 현재 수 있습니다.
자가 면역 질환에 기본 immunopathogenesis 자동 및 하이퍼-활성화의 여러 하위 집합 타고 난 및 적응형 면역 세포, 및 부수적인 dysregulated cytokine 생산을 포함 하는 임상이 거울. Cytokines은 면역 질환의 병 인에서 중추적인 역할을, 하는 동안 질병의 기계 장치에 그들의 특정 역할을 이해 했다 입증 도전. Cytokines는 pleiotropy 특징 이다 (한 cytokine 다른 세포 유형에 여러 효과 가질 수 있습니다), 중복 (여러 cytokines 동일한 효과 가질 수 있습니다), 이중성 (한 cytokine 다른 조건 하에서 프로 또는 안티 inflammatory 효과 가질 수 있습니다), 고 소성 (cytokines에서 그것의 "원래", 환경에 따라 서로 다른 역할에 주조 될 수 있다)4,,56. 따라서, 인구 수준 방법 다른 유형의 세포 응답 같은 "사이토카인 환경"을 구분할 수 없습니다. 마찬가지로, 연구 설계는 단일 셀 형식 (cytokine), 면역 체계의 특정 한 측면에 집중 하는 복잡 한 면역 질환에 관련 된 모든 요소에 대 한 글로벌 평가가 제공 하지 않습니다. 환자 세라 기반 연구 자가 면역에 중요 한 통찰력 여유, 하는 동안 그들은 감지 dysregulated cytokines의 특정 세포 소스를 제공 하지 않습니다.
최근에, 우리는 동시에 여러 개의 면역 세포 유형, 평가 하 고 환자 특정 "병원 성" 주변 혈액 플라스마 순환 요인의 주위에 그들의 다양 한 cytokine 물결을 감지 하는 단일 셀 proteomic 접근 방식을 개발. 여기에 설명 된 워크플로 고립 된 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 반대로 그대로 주변 전체 혈액 샘플의 사용에 의해 특징입니다. 주변 기기 전체 혈액 나타냅니다 조직의 면역 중재 질환, 자가 면역 질환 (즉, 중 성구, 혈소판), 및 2) 플라즈마 1) 비-단 혈 자주 참여를 포함 하 여 공부를 가장 순수 관련 차량을 면역 활성화 역할 있다 핵 산, 면역성이 있는 복합물, 및 cytokines, 등의 요소를 순환. 캡처하는 "본질적인 병원 성" dysregulated cytokine 생산, 주변 혈액 샘플 그리고 37의 ° C (생리 적 체온) 단백질 수송에서 외피의 6 h 혈액 무승부 (T0, 시간 제로), 후 즉시 처리 됩니다 cytokine 생산 (축적, T6 T0) "내장" 질병 상태 (그림 1)을 나타내는 것을 검출 하기 위하여 어떤 exogenous 자극 조건 (T6, 시간 6 h), 없을 경우에 억제 물. Dysregulated 프로세스에 반영 하는 신호 경로, 질병에 관련 된 면역 반응에 관련 된 주변 혈액 샘플은 아래의 활성화를 공부 하는 외 인으로 (단백질 수송 억제제와 37 ℃에서 6 h 외피) 치료 cytokine 생산 핵 산에 대 한 응답을 나타내는 것을 감지 하 질병 병 인, SLE (T6 + R848, 1 µ g/mL R848와 h 시간 6)의 경우 수신자 같은 수용 체 (TLR) 촉진제 등을 반영 하는 조건 자극 (T6 대 T6 T0 대 비교 + R848, 그림 1)입니다. 공부 하 고 사용할 수 있는 치료제 비보 전,의 immunomodulatory 효과 특정 환자에 대 한 정확한 면역 dysregulated 프로세스에 관련 된으로, 말 초 혈액 샘플은 JAK 억제제에는 관련 치료와 함께 처리 됩니다. 농도 (여기, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, 시간 6 h 5 uM ruxolitinib), 약물 (T6 대 T6 T0 대 + 5R, 그림 1)에 대 한 응답에서 "내장" 질병 상태에서 변화를 감지 하. JAK 억제제 JAK 저 해제 라스 같은 자가 면역 질환의 치료에 성공 하려면 표시 되었습니다 때문에이 연구에 대 한 선정
동시에 여러 면역 세포의 하위 집합, SLE에서 주변 혈액 샘플에서에서 설명한 dysregulated 프로세스를 평가 하기 위해 환자와 건강 한 컨트롤 위에서 설명한 대로 되었고 대량 cytometry 분석. 대량 cytometry, 일컬어 Cytometry 시간-의-비행, 스펙트럼의 문제7,,89오버랩 없이 단일 세포 분석의 40 개 이상의 매개 변수를 제공 합니다. 이 기술은 항 체, 대신 fluorophores10에 바인딩된 태그로 녹는 금속 이온의 형태에서 희토류 금속 동위 원소를 활용 합니다. 전화 외 에 맥 카시 외. (즉, 튜닝 및 교정, 샘플 수집) 대량 cytometry 기술 플랫폼에 관한 추가 정보를 찾을 수 있습니다. 11 , 12 대량 cytometry의 높은 차원 단일 셀 세분성 (자료 테이블) 타고 난 및 적응형 면역 세포 하위 집합에 걸쳐 여러 cytokines의 동시 측정을 수 있습니다.
현재 기존의 임상 및 실험실 매개 변수는 종종 나 지속적인 질병 활동 또는 특정 immunomodulators13, 더 나은 기본 면역 윤곽을 그리 다 하는 필요를 반영에 대 한 응답을 탐지 하기 위한 구체적 플레어 드라이브를 변경 합니다. 항 체 또는 작은 분자 억제제 cytokines를 대상으로 또는 단백질 cytokine 생산의 규칙에 관련 된 신호를 사용 하는 치료 접근의 과다는 면역 질환에서 cytokine dysregulation의 보급을 감안할 때, 최근 나왔다. 기본 형식, 여기에 설명 된 주변 혈액 분석 접근 환자 전용 dysregulated 셀 하위 집합 및 그들의 비정상적인 cytokine 생산 조직 발현과 자가 면역 질환에 식별 하기 위해 플랫폼을 제공 합니다. 이 방법을 특정 dysregulated cytokines를 확인할 수 있습니다, 그리고 구체적인 치료 옵션 수 테스트 ex vivo immunomodulate에 그들의 능력을 평가 하기 위해 환자 특정 질병 치료 선택의 개인 설정에 대 한 허용 프로세스입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ruxolitinib</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-364729A</td>
			<td>Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R848</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-r848-5</td>
			<td>Stock Conc: 1 &#956;g/&#956;L; Final Conc: 1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EK</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>Stock Conc: 1 &#956;g/&#956;L; Final Conc: 0.1 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix Buffer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>558049</td>
			<td>Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;BD Phosflow perm/wash buffer I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>557885</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-8032</td>
			<td>Stock Conc: &#62;99.9%; Final Conc: 0.0002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Transport Inhibitor (PTI)</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>00-4980-93</td>
			<td>Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Intercalator</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201192B</td>
			<td>Stock Conc: 500 &#956;M; Final Conc: 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Media (CSM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxPar Barcode Perm Buffer</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201057</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-plex Pd Barcode Set</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>S0014</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ TM Four Element Calibration Beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% MeOH-free Formaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>28908</td>
			<td>Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile round bottom polystyrene tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60818-496</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene cluster tubes</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-9001</td>
			<td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helios CyTOF instrument</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>Helios</td>
			<td>All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 M&#937;.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies used for Mass Cytometry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L161</td>
			<td>Mass: 161</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>Mass: 144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SK3</td>
			<td>Mass: 174</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD7</td>
			<td>BD</td>
			<td>M-T701</td>
			<td>Mass: 149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>SK1</td>
			<td>Mass: 142</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>ICRF44</td>
			<td>Mass: 209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c</td>
			<td>BD</td>
			<td>B-ly6</td>
			<td>Mass: 152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD15</td>
			<td>BD</td>
			<td>HI98</td>
			<td>Mass: 115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>Mass: 154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16</td>
			<td>eBioscience/Thermo</td>
			<td>B73.1</td>
			<td>Mass: 165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SJ25C1</td>
			<td>Mass: 163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD21</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Bu32</td>
			<td>Mass: 141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD27</td>
			<td>BD</td>
			<td>L128</td>
			<td>Mass: 155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD38</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>HIT2</td>
			<td>Mass: 172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 total</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HI30</td>
			<td>Mass: 89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45RA</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>HI100</td>
			<td>Mass: 153</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>REA196</td>
			<td>Mass: 168</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66</td>
			<td>BD</td>
			<td>B1.1/CD66</td>
			<td>Mass: 113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>IT2.2</td>
			<td>Mass: 150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD123</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>6H6</td>
			<td>Mass: 143</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD278/ICOS</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>C398.4A</td>
			<td>Mass: 156</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD179/PD1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>EH12.2H7</td>
			<td>Mass: 162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgD</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>IA6-2</td>
			<td>Mass: 146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>MHM-88</td>
			<td>Mass: 151</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR5</td>
			<td>BD</td>
			<td>RF8B2</td>
			<td>Mass: 173</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLADR</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>L243</td>
			<td>Mass: 167</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>364-3B3-14</td>
			<td>Mass: 147</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#946;</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>H1b-98</td>
			<td>Mass: 169</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1RA</td>
			<td>Santa Cruz&#160;</td>
			<td>AS17</td>
			<td>Mass: 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>MQ2-13A5</td>
			<td>Mass: 164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-8</td>
			<td>BD</td>
			<td>E8N1</td>
			<td>Mass: 160</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-12/IL-23p40</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>C8.6</td>
			<td>Mass: 171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>Biolegend&#160;</td>
			<td>BL168</td>
			<td>Mass: 148</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL23p19</td>
			<td>eBioscience/Thermo</td>
			<td>23dcdp</td>
			<td>Mass: 176</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIP1&#946;</td>
			<td>BD</td>
			<td>D21-1351</td>
			<td>Mass: 158</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCP1</td>
			<td>BD</td>
			<td>5D3-F7</td>
			<td>Mass: 170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#945;</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>LT27:295</td>
			<td>Mass: 175</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN&#947;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>4S.B3</td>
			<td>Mass: 165</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTEN</td>
			<td>BD</td>
			<td>A2B1</td>
			<td>Mass: 159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>Mab11</td>
			<td>Mass: 166</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling&#160; Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell analysis of immunophenotype and cytokine production in peripheral whole blood via mass cytometry

Cytokines은 면역 질환의 병 인에서 중추적인 역할을 한다. 따라서, cytokine 레벨의 측정 self-tolerance 및 후속 면역의 붕괴에 지도 하는 정확한 메커니즘을 이해 하기 위해에서 여러 연구의 초점 되었습니다. 접근은 지금까지 단일 또는 몇 종류 (cytokines), 면역 체계의 특정 한 측면의 연구에 기초를 둔 하 고 복잡 한 자기 면역 질병의 세계적인 평가 제공 하지 않습니다. 환자 세라 기반 연구 자가 면역에 중요 한 통찰력 여유, 하는 동안 그들은 감지 dysregulated cytokines의 특정 세포 소스를 제공 하지 않습니다. Cytokine 생산 요인, 순환 하는 "본질적인" 환자 전용 플라즈마의 컨텍스트 내에서 여러 면역 세포 하위 집합에서 평가 하는 포괄적인 단일 셀 접근 방식은 여기에 설명 되어 있습니다. 이 방법은 환자 특정 면역 표현 형 (표면 마커)의 모니터링 가능 및 기능 (cytokines), 그것의 기본에서 "본질적인 병원 성" 질병 상태, 또는 치료제에비보 ( ex vivo)의 존재에.

그림 1 자극에 대 한 워크플로 보여 줍니다 및 혈액 샘플 aliquots의 할당을 포함 한 주변 혈액 샘플의 처리 자극 에이전트, 단백질의 추가의 타이밍 수송 억제 물 칵테일, 그리고 보육 적혈구 (RBC) 세포 및 고정까지 시간. 자극 제의 선택은 평가 대상 신호 및 cytokine 경로에 따라 달라 집니다. 예를 들어 여기에 설명 된 프로토콜 TLR 촉진제 여러 셀 종류에?...

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Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Immunophenotype 및 Cytokine 생산 대량 Cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석

여기 우리 면역 phenotypic와 기능 (세포내 cytokine 유도)를 평가 하는 단일 셀 proteomic 접근 방식을 설명 주변 전체 혈액 샘플, 대량 cytometry 통해 분석으로 변경.

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

single-cell-analysis-immunophenotype-cytokine-production-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K 조회수.  University of Colorado School of Medicine. 여기 우리 면역 phenotypic와 기능 (세포내 cytokine 유도)를 평가 하는 단일 셀 proteomic 접근 방식을 설명 주변 전체 혈액 샘플, 대량 cytometry 통해 분석으로 변경.

비디오: Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

연구

면역학 및 감염병학

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Glycosphingolipid 항원의 대량 Spectrometric 분석

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

전체 혈액 Phenotyping 분석을 사용하여 Multicenter 임상 시험을위한 주요 말초 혈 백혈구 인구의 열거

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

사람 말초 혈액의 Immunophenotypic 분석에 대한 항체 칵테일을 준비하는 반 자동화 된 접근

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...