ボストン医療センターとして NIH の 5R01CA183101 からサブ契約から資金調達・ エバンス医療財団からの資金調達、1UL1TR001430、BU ジョスリン パイロット プログラムおよび BU CTSI KL2TR001411 を付与する BU CTSI パイロット。

ここで説明したすべてのメソッドは、動物のケアおよび使用委員会 (ACUC) ボストン医療センターによって承認されています。
1. システムのセットアップ
<ol><li>オスロ システム<ol>
<li>システムの光源としてスーパーコンティ ニウム光源を使用します。<ol>
<li>ダイクロイック ミラー (DM1) によって高い波長 (nm 650-2000) から可視光域 (450-650 nm) を分離します。ビーム偏光ビームスプリッター (PBS) 通過後分散プリズムのペアでスペクトルを展開します。</li>
			<li>励起波長範囲 (475 495 nm) を選択するスリットを配置します。プリズム対にフィルター処理されたビームを反映し、シングル モード光ファイバー (SMF 1) に光をカップルに反射ミラーを使用します。</li>
			<li>分光計を使用して、シングル モード光ファイバーの出力波長選択を確認します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>シングル モード光ファイバーを図 2に示すように、2 つのカスケード接続された光ファイバーのカプラーに接続します。第 2 繊維のカプラーからファイバー出力ポートの 1 つはオスロ システムに光を提供します。</li>
		<li>オスロのシステムでレーザーをまずコリメートします。<ol>
<li>ガルバノ メーター ミラー (GM1) によってレーザーを偏向させます。中継 1:1 望遠鏡システムで 2 番目のガルバノ メーター ミラー (GM2) にレーザーと 3:1 望遠鏡システムによる眼の瞳に更にリレーします。</li>
			<li>蛍光信号を反映する 3:1 望遠鏡システム内のダイクロイック ミラー (DM2) をインストールします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>光軸をオフセットし、図 3に示すように、照明をスキャン斜めにカスタマイズされた鳩の尾スライダーで 3:1 望遠鏡システムとダイクロイック ミラー (DM2) をマウントします。キャリパーを使用して、必要に応じてオフセットの長さを正確に制御します。</li>
		<li>蛍光イメージング光学パス。<ol>
<li>ダイクロイック ミラーと遅いスキャン スキャン解除する 3 番目のガルバノ メーター ミラーへの中継による蛍光を反映してください。</li>
			<li>別の 1:1 の望遠鏡システムで、イメージングの対物レンズに光を中継します。翻訳段階で上記の光学系をインストールします。 注: 3 番目のガルバノ メーター ミラー イメージングを最適化するための自由度の冗長性を提供する (GM3) 下 2 つの付加的な翻訳段階にインストールされます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>3 つの自由度 (回転および翻訳の 2 つの軸) は、ステージの最終的なイメージング システムをマウントします。平面のカメラを使用すると、断面の蛍光画像をキャプチャします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>光コヒーレンス断層撮影システム<ol>
<li>システムの光源として同じスーパーコンティ ニウム光源を使用します。<ol>
<li>残光 (650-2000 nm) から近い赤外線 (NIR) 範囲 (650 900 nm) を別のダイクロイック ミラー (DM3) によって区切ります。ロングパス フィルターを使用して、さらに 800 〜 900 nm に帯域幅を制限します。シングル モード光ファイバー (SMF 2) にビームをカップルします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>シングル モード光ファイバーを青いオスロ励起と結合する 2 つのカスケード接続された光ファイバーのカプラーの他の入力ポートに接続します。直接、変数減光フィルター (VNDF)、分散補償板と反射ミラーが 10 月参照アームに 2 つ目のファイバー結合器の 2 番目の出力ポートから光。 注: 参照の腕から返された光と目 2 番目の光カプラーで再結合され信号を収集する OCT 装置の開発。</li>
	</ol>
</li>
	<li>データ集録<ol>
<li>LabVIEW で作成、OCTA7,8,9,10のスキャンのプロトコルから変更データ集録システム ソフトウェアを使用します。各 B-スキャン 500 ステップで歯は x を制御するアナログ出力ボード (AO1) によって出力 80% のデューティ サイクルを見た ' 高速スキャン ミラー、GM2。</li>
		<li>OCT のデータを取得する各ステップでライン スキャン カメラをトリガー ミラー走査方向前方の場合にのみ。17 μ s にライン スキャン カメラの露光時間を設定します。</li>
		<li>OCTA 信号を取得するには、同じ B スキャン場所で 5 回測定を繰り返します。</li>
		<li>50 kHz では 100 kHz で AO 出力レートと 10 月、a ラインを設定します。Y を制御 ' 遅いスキャン ミラー、GM1、ランプ波形によって。解除遅いスキャンをスキャンする GM1 と重複スキャン ミラー、GM3 を同期します。</li>
		<li>他のアナログ出力ボード各 y で 1 つの蛍光イメージをキャプチャする (AO2) によって平面のカメラをトリガー ' の場所。イメージのサイズをトリミングまたは bin に速度と必要に応じて感度を高めるための隣人ピクセル。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. システムの配置
<ol><li>青色励起波長を選択するオスロ光源でスリットを調整します。分光計を使用して周りにスペクトルの範囲を監視する 475-490 nm。</li>
	<li>〜 5 mm で光軸をシフトする鳩尾山スライダー調整します。これは ~1.7 mm、網膜上 ~ 15 ° の傾斜角度で生じるラット瞳孔でオフセットになります。</li>
	<li>同じ 5 mm 蛍光検出光学系の翻訳段階を調整します。</li>
	<li>最終的な蛍光イメージング ~ 30 ° にするシステムを調整します。</li>
	<li>力計を用いた光パワーを測定します。青いオスロ励振電力が 0.2 mW と網膜の損傷を発生しません 10 月レーザー パワー 0.8 mW であることを確認します。 注: は、ANSI 規格に基づき、網膜に最大限の寛容な露出 (MPE) のレベルでは 〜 可視光域に 2 mw7,8 。Deloriらによる式によると9MPE の近赤外線は可視光に比べて約 2 倍約 4 mW。</li>
</ol>3生体内で動物実験。
<ol><li>誘導室に 12 週間長いエバンス ラットを転送します。イソフルラン気化器によって 2 L/分の流量で 10 分間の酸素で 4.5% イソフルランとラットを麻酔します。<ol>
<li>すだれのピンチの中に逃避反射の欠如によって決定される麻酔の深さを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>誘導した後に、5 軸 (x、y、z の翻訳、ヨーおよびピッチ) ホルダーにラットを配置します。加熱ステージ、循環温水毛布や長期にわたる実験で他の適切な方法の使用によって補足熱を提供します。実験の残りの部分の間に 2 リットル/分の流量で isofluorane の 1.5% で麻酔を維持します。アクティブ排気誘導室を使用していない、誘導室はバック ドラフトまたは下降テーブル上またはイソフルランを清掃するシュノーケルの下に配置必要があります。</li>
	<li>2 分の 1% トロピカミド点眼液で瞳孔を散大させます。必要な場合は、追加のローカル麻酔ラットの目に 0.5% テトラカイン塩酸点眼液を適用します。実験中に少なくとも一度毎分商業人工涙液による保湿を離さない。</li>
	<li>フルオレセイン塩 (10%/w) や FITC を挿入 (10%/w) は滅菌生理食塩水で希釈 (0.1 0.3 mL) 1 mL で尾静脈注射器と 29 G 針。</li>
	<li>レーザー ソースを入れます。配置の間に青い光励起を減衰する中立的な密度のフィルターを配置します。~0.8 mW になるのに 10 月光と青い光の力を測る < 0.01 mW の白内障の形成を避けるために。</li>
	<li>ガルバノ スキャンと位置合わせモードを開始します。固定レーザーを角膜にスポットする目のボールの高さを調整します。~1.5 mm 程度に目の頂中央にレーザーをオフセットし、瞳孔の縁をレーザーにほぼ垂直になるようにラットの目の位置を調整します。</li>
	<li>さらに OCT 画像最適な品質に到達するまで動物のホルダーを調整します。X の ' 高速走査方向、断面 B スキャン画像がフラットに表示されることを確認してください。Y に切り替えるとき ' 低速走査方向、斜めの走査のために断面 B スキャン画像が傾いていることを確認します。</li>
	<li>青い光励起に中立的な密度のフィルターを削除し、カメラからリアルタイムを監視します。蛍光断面画像を示す血管異なる深さで表示になります。<ol>
<li>蛍光イメージング システム最適な焦点に到達するための最後のフォーカスを調整します。オスロの最適なイメージ品質に到達する横の面の目の位置の微調整を許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>整列後同時オクタと体積フルオレセイン造影 (vFA) の取得を開始します。</li>
	<li>OCTA の Matlab によるオスロ体積のイメージを構築します。アルゴリズムは、以前詳細10で説明します。画像の領域分割による網膜血管の深さ分解を生成します。</li>
	<li>イメージングを完了するとレーザーをオフにする、動物の解放、目に眼軟膏を塗ると回復ボックスに動物を配置します。</li>
	<li>放置しないでください動物それは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまで、または施設の方針に従って。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+scanning+laser+ophthalmoscope.">Confocal scanning laser ophthalmoscope.</a> Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).</li><li>Roorda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy.">Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography.">Optical coherence tomography.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li><li>de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+optical+coherence+tomography+angiography+(OCTA).">A review of optical coherence tomography angiography (OCTA).</a> International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Optical+Coherence+Tomography+Angiography+of+Choroidal+Neovascularization+in+Age-Related+Macular+Degeneration.">Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration.</a> Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).</li><li>Chen, C. -. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+based+angiography+[Invited].">Optical coherence tomography based angiography [Invited].</a> Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).</li><li>Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+retinal+imaging+using+visible-light+optical+coherence+tomography+guided+by+scanning+laser+ophthalmoscopy.">Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).</li><li>Zhang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-band+spectral-domain+optical+coherence+tomography+for+in+vivo+imaging+the+spectral+contrasts+of+the+retinal+nerve+fiber+layer.">Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer.</a> Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).</li><li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+(ANSI+2000),+with+emphasis+on+ophthalmic+devices.">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+fluorescence+retinal+imaging+in+vivo+over+a+30-degree+field+of+view+by+oblique+scanning+laser+ophthalmoscopy+(oSLO).">Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO).</a> Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).</li></ol>

Ji 李は、オスロの保留中の特許を保持しています。他の著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

ここでは、オスロ、体内容積蛍光網膜視野 30 ° 以上でイメージングを説明しました。10 月、現在のイメージング法の眼科では、ケアの標準と比較してオスロ同様 3 D イメージング機能を提供しています、まだ蛍光コントラスト 10 月に敏感ではないことができます。オスロの利点はそれが 1 つだけラスター スキャンを必要とし、したがって構造と蛍光の体積イメージングの 2 つの相補?...

眼科・視覚科学コンピューターの近代的な光学イメージング技術網膜を光で簡単にアクセスできるので恩恵を大きく。蛍光眼底イメージングは診断とどちらの主要な米国の失明の原因糖尿病網膜症 (DR) など加齢に伴う黄斑変性症 (AMD)、網脈絡膜血管の疾患の管理に不可欠なツールです。
しかし、まだ大きな視野 (FOV)、三次元 (3 D) 網膜蛍光イメージングを用いたイメージングを取得に挑戦です。眼底写真は深さを解決する機能がないと拡散光を拒否しません。結果として、異なる深さからの信号の混合と、画質が低下します。走査レーザー眼底検査 (SLO) と共焦点ゲート1を使用して拡散した光の効果を減らす共焦点 SLO (cSLO) することができます。ただし、SLO や cSLO の焦点深度の制限のため 3 D 人間の網膜像を取得することは困難です。補償光学 SLO (AOSLO) は、人間の目によって導入された波面収差を補正することにより最高の解像度とコントラストを提供できます。ただし、AOSLO 必要があります z スタッキング体積画像2。光コヒーレンス断層法 (OCT)3と 10 月血管造影 (OCTA) システムは三次元 (3 D) 解剖学的血管画像4,5,6、色素フリー自然を提供するこれらの制限を克服します。10 月の漏出血管機能不全を示すものを視覚化できません。
このプロトコルでは、3 D 容積蛍光網膜イメージング、すなわち斜め走査レーザー眼底検査 (オスロ) の新しいマルチ モーダル プラットフォームについて説明します。イメージング システム、鳩の尾スライダーによって生成される斜めスキャンと最終的なイメージング システムは断面画像クロス蛍光を検出する角度に配置されます。システムは、スキャン方法、レーザーを使用して、これらの技術補完体積構造イメージング法として OCT を使用の容易な組み込みを許可します。現在の深さ分解能はラット網膜の約 25 μ m、ビューのフィールドは 30 °。基本的に、オスロ 10 月の蛍光バージョンができ、10 月と同時に組み合わせることができます、大きな視野でオクタ。
このプロトコルではオスロ、配置と施工法、ラット網膜の生体内イメージングの方法と代表的な結果の設定を説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supercontinuum Laser Source</td>
			<td>NKT Photonics</td>
			<td>SuperK EXTREME EXU-OCT6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror (DM1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP650R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror (DM2)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ZT514/1064rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror (DM3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP900R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Mode Fiber (SMF 1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P3-460B-FC-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Mode Fiber (SMF 2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P3-780A-FC-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic Fiber Coupler</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TW850R5A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:1 Telescope System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-100-A&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3:1 Telescope System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3:1 Telescope System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-50-A&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:1 Telescope System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-100-A&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvo Mirrors (GM1,GM2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS201&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-sacn Galvo Mirrors (GM3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UplanSApo 20&#215;/0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Final imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UplanFL N 10&#215;/0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Final imaging system</td>
			<td>Computar</td>
			<td>12-36mm/1:2.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>PCO</td>
			<td>Pco.pixelfly usb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Continuously Variable ND Filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NDC-50C-4M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line Scan Camera</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SPL2048-140K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Output Board (AO1)</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCI-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Output Board (AO2)</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0800</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal volumetric retinal imaging by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oslo) and optical coherence tomography (oct)

眼科では蛍光イメージングを用い、広い視野 (FOV) 三次元 (3 D) 蛍光網膜像はまだ z 積み重ねが必要になりますので、画像診断の最新網膜における最大の課題体積データセットをコンパイルします。新しい光コヒーレンストモグラフィ (OCT) と 10 月 (OCTA) 血管造影システム三次元 (3 D) 解剖学的血管画像を提供するためにこれらの制限を克服するが、10 月の色素フリー自然漏出血管を示すために視覚化できません。機能不全。このプロトコルでは、走査レーザー眼底検査 (オスロ) 3 D 容積蛍光眼底イメージングを提供する新しい斜めについて説明します。イメージング システムのセットアップは鳩の尾のスライダーによってスキャン斜めを生成し、蛍光断面画像を検出する角度で最終的なイメージング システムを配置します。スキャン方式、レーザーが使用され、したがって、相補的な体積構造イメージング法として 10 月の容易な組み込みを使用できます。ラット網膜のin vivoイメージングを次に紹介します。フルオレセインのソリューションは、容積血管造影 (vFA) を生成する静脈内注入されます。

図 4 aは、ラット網膜の断面の OCT 画像を示しています。図 4b-4 cは同時取得オクタとオスロの vFA の同じ網膜の断面の画像を表示します。オスロを有効断面 FA 10 月 B-スキャンに似ています。オクタと比較してオスロ vFA の断面画像を神経線維層 (NFL) の神経節細胞層 (GCL)、血管と毛細血管外網状層 (OPL) で明確に識...

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Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

ここでは、新規イメージングのマルチ モーダルなプラットフォームを使用して大規模な視野 (FOV) 三次元 (3 D) 蛍光と OCT 網膜像を取得するためのプロトコルを提案する.システム セットアップ、配置の方法と運用のプロトコルを紹介します。In vivoイメージングが実証されると代表の結果が提供されます。

斜め走査レーザー眼底 (オスロ) と光干渉断層計 (OCT) によるマルチモーダルインタ体積網膜イメージング

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

multimodal-volumetric-retinal-imaging-oblique-scanning-laser

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

8.4K ビュー.  Boston University School of Medicine. ここでは、新規イメージングのマルチ モーダルなプラットフォームを使用して大規模な視野 (FOV) 三次元 (3 D) 蛍光と OCT 網膜像を取得するためのプロトコルを提案する.システム セットアップ、配置の方法と運用のプロトコルを紹介します。In vivoイメージングが実証されると代表の結果が提供されます。

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

生物工学

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

統合された光音響眼底検査とスペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

医療画像処理アプリケーションのための超音波の広帯域光検出器

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

マルチモーダル分子イメージングアプリケーションのためのBiofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

コンピュータ断層撮影法と頭蓋骨自家移植と同種移植片の統合を評価するために、骨形成、血管新生のカップリングの光イメージング

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

光干渉断層計を用いた分解足場ベース組織設計血容器開発の非破壊モニタリング

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

単離マウス心室筋細胞の光学イメージング

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

ライブセル上の近くの同時レーザー走査共焦点と原子間力顕微鏡(コンポカル)

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

血管可視化のための二重ラスター走査光音響小動物イメージャー

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...

In vivo Structural Assessments of Ocular Disease in Rodent Models using Optical Coherence Tomography

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable tool to evaluate and characterize changes in a variety of retinal and ocular disease and injury models. In light induced retinal degeneration models, SD-OCT can be used to track thinning of the photoreceptor layer over time. In glaucoma models, SD-OCT can be used to monitor decreased retinal nerve fiber layer and total retinal thickness and to observe optic nerve cupping after inducing ocular hypertension. In diabetic rodents, SD-OCT has helped researchers observe decreased total retinal thickness as well as decreased thickness of specific retinal layers, particularly the retinal nerve fiber layer with disease progression. In mouse models of myopia, SD-OCT can be used to evaluate axial parameters, such as axial length changes. Advantages of SD-OCT include in vivo imaging of ocular structures, the ability to quantitatively track changes in ocular dimensions over time, and its rapid scanning speed and high resolution. Here, we detail the methods of SD-OCT and show examples of its use in our laboratory in models of retinal degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and myopia. Methods include anesthesia, SD-OCT imaging, and processing of the images for thickness measurements.

Here, we describe the use of spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) to visualize retinal and ocular structures in vivo in models of retinal degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and myopia.

光コヒーレンストモグラフィーを用いたげっ歯類モデルにおける眼疾患のin vivo構造評価

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable ...