자금 인 NIH 5R01CA183101에서 하위 계약 뿐만 아니라 보스톤 의료 센터에서 에반스 의료 재단 자금에서 부 CTSI 파일럿 1UL1TR001430, 부 Joslin 파일럿 프로그램, 및 부 CTSI KL2TR001411를 부여 합니다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) 보스턴 의료 센터에 의해 승인 되었습니다.
1. 시스템 설치
<ol><li>오슬로 시스템<ol>
<li>Supercontinuum 레이저 소스를 사용 하 여 시스템 레이저 소스.<ol>
<li>Dichroic 거울 (DM1)에 의해 더 높은 파장 범위 (650-2000 nm)에서 보이는 빛 범위 (450-650 nm)를 구분 합니다. 편광 빔 스플리터 (PBS)를 통과 하는 광선 후 흩어진 프리즘의 쌍으로 스펙트럼을 확장 합니다.</li>
			<li>여기 파장 범위 (475-495 nm)를 선택 하는 슬릿을 배치 합니다. 반사 거울을 사용 하 여 프리즘 쌍을 다시 필터링 된 광선을 반영 하 고 다음 단일 모드 광섬유 (SMF 1)으로 빛을 커플.</li>
			<li>분 광 계를 사용 하 여 단일 모드 광섬유의 출력에서 파장 선택 확인.</li>
		</ol>
</li>
		<li>그림 2와 같이 두 개의 캐스케이드 광섬유 커플러를 단일 모드 광섬유를 연결 합니다. 두 번째 섬유 커플러에서 섬유 출력 포트 중 하나는 오슬로 시스템에 빛을 제공합니다.</li>
		<li>오슬로 시스템에서 먼저 레이저를 당기기.<ol>
<li>검 류 계 미러 (GM1)으로 레이저를 편향. 릴레이 1:1 망원경 시스템에 의해 두 번째 검 류 계 미러 (GM2) 레이저 그리고 3:1 망원경 시스템에 의해 눈의 눈동자를 더 릴레이.</li>
			<li>시스템 내에서 3:1 망원경 형광 신호에 맞게 dichroic 거울 (DM2)를 설치 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>광 축 오프셋을 간접 조명 그림 3에서 같이 검색을 만들 사용자 지정된 비둘기 꼬리 슬라이더에 3:1 망원경 시스템 및 dichroic 거울 (DM2)를 탑재 합니다. 캘리퍼스를 사용 하 여 정확 하 게 제어할 원하는 대로 오프셋된 길이.</li>
		<li>형광 이미징 광학 경로입니다.<ol>
<li>Dichroic 거울과 느린 스캔 스캔 드 3 검 류 계 미러 릴레이 의해 형광을 반영 합니다.</li>
			<li>또 다른 1:1 망원경 시스템 이미징 대물 렌즈에 빛을 릴레이 합니다. 번역 단계에서 위의 광학을 설치 합니다. 참고: 두 개의 추가 번역 단계 3 검 류 계 미러 (GM3)는 이미지를 최적화 하기 위한 자유도에 중복을 제공 하기에 설치 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3 자유도 (회전, 그리고 번역의 두 축)은 무대에서 최종 이미징 시스템을 탑재 합니다. 평면 카메라를 사용 하 여 횡단면 형광 이미지를 캡처합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>광학 일관성 단층 촬영 시스템<ol>
<li>동일한 supercontinuum 레이저 소스를 사용 하 여 시스템 레이저 소스.<ol>
<li>가까운 적외선 (NIR) 범위 (650-900 nm) 나머지 빛 (650-2000 nm)에서 다른 dichroic 거울 (DM3) 구분 합니다. 긴 패스 필터를 사용 하 여 800-900 nm 대역폭 제한에. 단일 모드 광섬유 (SMF 2)에 빔 커플.</li>
		</ol>
</li>
		<li>단일 모드 섬유 블루 오슬로 여기와 결합 하 여 두 개의 캐스케이드 광섬유 커플러의 다른 입력된 포트에 연결 합니다. 직접 변수 중립 밀도 필터 (VNDF), 분산 보상 접시와 반사 거울 OCT 참조 팔 두 번째 섬유 커플러의 두 번째 출력 포트에서 빛. 참고: 빛 참조 팔에서 반환 그리고 눈 두 번째 광섬유 커플러에서 recombines 신호를 수집 하는 OCT 분석기에 전달 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터 수집<ol>
<li>사용 데이터 수집 시스템 소프트웨어를 LabVIEW에서 그리고 OCTA7,8,,910의 검사 프로토콜에서 수정 합니다. 각 B-스캔에 대 한 80% 듀티 사이클 500 단계와 치아 x를 제어 하는 아날로그 출력 보드 (AO1)에 의해 출력은 본 ' 빠른 스캐닝 미러, GM2.</li>
		<li>OCT에 대 한 데이터를 얻기 위해 각 단계에서 라인 스캔 카메라를 트리거 거울은 검색 방향을 전달에서 하는 경우에. 라인 스캔 카메라 17 µs에 대 한 노출 시간을 설정 합니다.</li>
		<li>OCTA 신호를 획득, 5 번 같은 B-스캔 위치에서 측정을 반복 합니다.</li>
		<li>50 kHz에서 100 khz, AO 출력 속도 10 월 라인 속도 설정 합니다. Y 제어 ' 느린 스캔 거울, GM1, 램프 파형에 의해. GM1 드 느린 스캔 스캔 스캔 드 미러, GM3, 동기화.</li>
		<li>다른 아날로그 출력 보드 (AO2) 한 형광 이미지 각 y에 의해 평면 카메라를 트리거 ' 위치. 이미지 크기 자르기 또는 증가 속도 감도 원하는 대로 이웃 픽셀을 빈.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 시스템 맞춤
<ol><li>블루 여기 파장 선택 오슬로 광원에서 슬릿을 조정 합니다. 주위에 스펙트럼 범위를 모니터링 하는 분석기를 사용 하 여 475-490 nm.</li>
	<li>비둘기 꼬리 마운트 슬라이더 ~ 5 m m에 의해 광 축 변화를 조정 합니다. 이 쥐 눈동자에 오프셋 ~1.7 m m, 결과 망막에 ~ 15 °의 경사 각도에 의해 발생 합니다.</li>
	<li>같은 5 m m 형광 검출 광학의 번역 단계를 조정 합니다.</li>
	<li>최종 형광 이미징 시스템 ~ 30 ° 되도록 조정 합니다.</li>
	<li>전력 측정기를 사용 하 여 광 출력을 측정 합니다. 블루는 오슬로 전원을 ≤0.2 mW 및 OCT 레이저 전원 ≤0.8 mW는 망막 손상을 일으키지 것입니다 있는지 확인 합니다. 참고: ANSI 표준에 따라, 망막에 최대 허용 노출 (MPE)의 수준 이다 ~ 2mW7,8 빛 보이는 범위에서. Delori 그 외 여러분 에 의해 수식에 따라 9, MPE 근처 적외선 빛은 가시 광선 보다 약 2 배 높은 약 4 mW.</li>
</ol>3. Vivo에서 동물 실험
<ol><li>12 주 남성 긴 에반스 쥐 유도 챔버로 전송 합니다. Isoflurane 기화에 의해 2 L/min의 유량과 10 분 동안 산소에 4.5 %isoflurane 쥐를 anesthetize.<ol>
<li>인터 핀치 동안 철수 반사의 부족에 의해 결정 된 마 취의 깊이 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유도, 후 5-축 (x, y, z 번역, yaw 및 피치) 보유자에 쥐를 놓습니다. 열띤된 무대, 순환 온수 담요 또는 장기간된 실험에 적합 한 다른 방법을 사용 하 여 추가 열을 제공 합니다. 실험의 나머지 부분 동안 2 리터/분의 유량과 isofluorane의 1.5%에서 마 취를 유지 합니다. 액티브 배기 유도 챔버를 사용 하지 않는 때 유도 챔버 청소 isoflurane에 스노 클 또는 backdraft 또는 하강 기류 테이블에 배치 되어야 합니다.</li>
	<li>2 분 동안 1 %Tropicamide 안과 솔루션 눈동자 같은데요. 필요한 경우 추가 취에 대 한 쥐의 눈에 0.5% Tetracaine HCl 안과 솔루션을 적용 합니다. 실험 기간 동안 적어도 한 번 모든 분 상용 인공 눈물 moisturized 눈을 유지.</li>
	<li>Fluorescein 소금 (10 %w / w) 또는 FITC 주입 (10 %w / w) 멸 균 식 염 수에 희석 (0.1-0.3 mL) 1 mL를 꼬리 정 맥을 통해 주사기와 29 G 바늘.</li>
	<li>레이저 소스를 켭니다. 장소는 중립 밀도 필터 정렬 하는 동안 블루 빛 자극을 감소. ~0.8 mW 수 10 월 빛과 푸른 빛의 전력을 측정 < 0.01 mW 백 내장의 형성을 피하기 위해.</li>
	<li>검 류 계 스캐닝 및 맞춤 모드를 시작 합니다. 고정 된 레이저 각 막에 자리 만들려고 눈 볼의 높이 조정 합니다. 레이저에 대략 수직 눈동자의 테두리를 만들 수 쥐 눈 위치를 조정 하 고 오프셋 ~1.5 m m에 대 한 눈을의 꼭대기 센터 레이저.</li>
	<li>10 월 이미지 최적의 품질에 도달할 때까지 더 동물 홀더를 조정 합니다. X에서 ' 단면 B-스캔 이미지 평면 나타나는지 확인 빠른 스캔 방향. Y을 전환할 때 ' 느린 스캔 방향, 단면 B-스캔 이미지 표시 기울어진, 비스듬한 검색으로 확인.</li>
	<li>블루 라이트 여기에 중립 밀도 필터를 제거 하 고 실시간으로 카메라에서 피드를 모니터링 합니다. 교차 단면 형광 이미지 보여주는 혈관 다른 깊이에 나타나는 나타납니다.<ol>
<li>최종 형광 이미징 최적의 초점을 도달 하는 시스템의 초점을 조정 합니다. 미세 조정 최적의 오슬로 이미지 품질에 도달 하는 측면 평면에서 눈 위치를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>맞춤, 후 동시 OCTA와 체적 fluorescein angiography (vFA)를 시작 합니다.</li>
	<li>OCTA를 Matlab으로 오슬로 체적 이미지를 생성 합니다. 세부10이전 알고리즘 설명 합니다. 이미지 세분화 하 여 깊이 해결 망막 vasculatures를 생성 합니다.</li>
	<li>완료 후는 이미징, 레이저 해제, 동물 하 고는 눈에 일부 안과 연 고를 적용 놓고 복구 상자에서 동물을 배치.</li>
	<li>두지 마십시오 동물 무인 또는 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 기관 정책에 당.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+scanning+laser+ophthalmoscope.">Confocal scanning laser ophthalmoscope.</a> Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).</li><li>Roorda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy.">Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography.">Optical coherence tomography.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li><li>de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+optical+coherence+tomography+angiography+(OCTA).">A review of optical coherence tomography angiography (OCTA).</a> International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Optical+Coherence+Tomography+Angiography+of+Choroidal+Neovascularization+in+Age-Related+Macular+Degeneration.">Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration.</a> Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).</li><li>Chen, C. -. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+based+angiography+[Invited].">Optical coherence tomography based angiography [Invited].</a> Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).</li><li>Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+retinal+imaging+using+visible-light+optical+coherence+tomography+guided+by+scanning+laser+ophthalmoscopy.">Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).</li><li>Zhang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-band+spectral-domain+optical+coherence+tomography+for+in+vivo+imaging+the+spectral+contrasts+of+the+retinal+nerve+fiber+layer.">Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer.</a> Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).</li><li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+(ANSI+2000),+with+emphasis+on+ophthalmic+devices.">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+fluorescence+retinal+imaging+in+vivo+over+a+30-degree+field+of+view+by+oblique+scanning+laser+ophthalmoscopy+(oSLO).">Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO).</a> Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).</li></ol>

지 이순신 오슬로 대 한 보류 중인 특허를 보유 하고있다. 다른 저자는 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

여기, 우리가 오슬로 vivo에서 체적 형광 망막 상상 이상 30 ° FOV와 기법을 설명 했습니다. 10 월, 관리 인, 방법 이미징의 현재 표준에 비해 오슬로 비슷한 3D 이미징 기능을 제공 합니다 아직 10 월에 과민 하지 않다 형광 대비 수 있습니다. 오슬로의 장점은 하나의 래스터 스캔을 요구 하 고 따라서 구조 및 형광 체적 영상에 대 한 두 개의 상호 보완적인 기법을 제공 하는 10 월의 완벽 한 결합 ?...

안과 및 비전 과학 크게 혜택을 현대 광학 이미징 기법에서 때문에 망막 빛으로 쉽게 액세스할 수 있습니다. 형광 망막 영상 진단 및 둘 다 미국에 있는 장 님의 원인 선도 chorioretinal 혈관 질병 연령 관련 황 반 변성 (AMD) 및 당뇨 망막 병 증 (DR) 등의 관리에 필수적인 도구입니다.
그러나, 그것은 여전히 큰 시야 (FOV), 3 차원 (3D) 망막 형광 이미징 사용 하 여 이미지를 얻으려고 도전. 저 사진 깊이 해결 기능이 없는 확산 빛을 거부 하지 않습니다. 그 결과, 다른 깊이에서 신호를 혼합 하 여 이미지 품질을 줄일 수 있습니다. 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (SLO)와 confocal 제어1를 사용 하 여 확산된 한 빛의 효과 감소 하는 confocal SLO (cSLO) 수 있습니다. 그러나, SLO 또는 cSLO 초점의 깊이의 제한으로 인해 3D 인간의 망막 이미지를 얻기 어렵습니다. 적응 광학 SLO (AOSLO)는 인간의 눈으로 도입 wavefront 착오에 대 한 수정 하 여 뛰어난 해상도 콘트라스트를 제공할 수 있습니다. 그러나, AOSLO는 여전히 필요 z 스태킹 체적 영상2. 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)3 및 10 월 제품은 (OCTA) 시스템 제공 하는 3 차원 (3D) 해 부 및 혈관 이미지4,,56, 하지만 염료 무료 자연 이러한 제한을 극복합니다 10 월의 누설 혈관 장애의 지표를 시각화 수 없습니다.
이 프로토콜 3D 체적 형광 망막 화상 진 찰, 즉 경사 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (오슬로)에 대 한 새로운 복합 플랫폼을 설명 합니다. 이 이미징 시스템에서 비둘기 꼬리 슬라이더에 의해 생성 되는 간접 검사 하 고 최종 이미징 시스템 단면 이미지 크로스 형광을 검출 하는 각도에 정렬 됩니다. 레이저 스캐닝 방법, 사용 하 고 이러한 기술을 보완 체적 구조 이미징 적임으로 oct 쉽게 설립 허용. 현재 깊이 해상도 쥐 망막에서 약 25 µ m 이며, 보기의 필드는 30 ° 이다. 기본적으로, 오슬로 형광 버전 10 월의 고 동시에 10 월 결합 될 수 있다 및 큰 FOV 동안 OCTA.
이 프로토콜에서 오슬로, 정렬 및 건설의 방법, vivo에서 쥐 망막의 이미징 방법 및 대표 결과의 설정을 설명 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supercontinuum Laser Source</td>
			<td>NKT Photonics</td>
			<td>SuperK EXTREME EXU-OCT6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror (DM1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP650R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror (DM2)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ZT514/1064rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror (DM3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP900R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Mode Fiber (SMF 1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P3-460B-FC-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Mode Fiber (SMF 2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P3-780A-FC-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic Fiber Coupler</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TW850R5A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:1 Telescope System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-100-A&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3:1 Telescope System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3:1 Telescope System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-50-A&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:1 Telescope System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-100-A&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvo Mirrors (GM1,GM2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS201&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-sacn Galvo Mirrors (GM3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UplanSApo 20&#215;/0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Final imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UplanFL N 10&#215;/0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Final imaging system</td>
			<td>Computar</td>
			<td>12-36mm/1:2.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>PCO</td>
			<td>Pco.pixelfly usb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Continuously Variable ND Filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NDC-50C-4M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line Scan Camera</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SPL2048-140K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Output Board (AO1)</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCI-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Output Board (AO2)</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0800</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal volumetric retinal imaging by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oslo) and optical coherence tomography (oct)

형광 이미징 안과에서 널리 이용 된다, 하는 동안 큰 시야 (FOV) 3 차원 (3D) 형광 망막 이미지는 여전히 그들을 z 스태킹 요구할 것 때문에 형식 이미징-의 상태--예술 망막으로 큰 도전 체적 데이터 집합을 컴파일하십시오. 새로운 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 및 10 월 제품은 (OCTA) 시스템 3 차원 (3D) 해 부 및 혈관 이미지를 제공 하기 위해 이러한 제한을 극복 하지만 10 월의 염료 무료 자연 누설 혈관의 지표를 시각화 수 없습니다. 부전입니다. 이 프로토콜 소설 간접을 스캐닝 3 차원 체적 형광 망막 영상 제공 하는 레이저 ophthalmoscopy (오슬로) 기술에 설명 합니다. 이미징 시스템의 설정을 간접 비둘기 꼬리 슬라이더에 의해 검사를 생성 하 고 형광 단면 이미지를 감지 하는 각도에서 최종 이미징 시스템을 정렬. 시스템 검색 방법, 레이저를 사용 하며 따라서, 10 월의 쉬운 법인은 보완 체적 구조 이미징 형식으로 Vivo에서 화상 진 찰 쥐 망막에는 여기에 보여 줍니다. Fluorescein 솔루션은 체적 fluorescein angiography (vFA) 생산 정 맥 주입 됩니다.

그림 4a 쥐 망막의 단면 OCT 이미지를 보여줍니다. 그림 4b -4 c 를 동시에 취득 하는 OCTA 및 오슬로 vFA의 동일한 망막 단면 이미지를 표시 합니다. 오슬로 횡단면 FA를 유사한 10 월 B-스캔 수 있습니다. OCTA, 비해 오슬로 vFA 단면 이미지는 신경 섬유 층 (NFL)와 신경 절 세포 층 (GCL), 혈관과 모세 혈관 외부 plexiform 레이어 (OP...

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Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

여기, 우리 소설 영상 복합 플랫폼을 사용 하 여 큰 시야 (FOV) 3 차원 (3D) 형광 및 10 월 망막 이미지를 얻을 프로토콜 제시. 시스템 설치 프로그램, 정렬 방법 및 운영 프로토콜을 소개 합니다. Vivo에서 화상 진 찰 설명 될 것입니다, 그리고 대표적인 결과 제공 됩니다.

복합 체적 망막 이미징 오블리크 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy (오슬로) 및 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

multimodal-volumetric-retinal-imaging-oblique-scanning-laser

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

8.4K 조회수.  Boston University School of Medicine. 여기, 우리 소설 영상 복합 플랫폼을 사용 하 여 큰 시야 (FOV) 3 차원 (3D) 형광 및 10 월 망막 이미지를 얻을 프로토콜 제시. 시스템 설치 프로그램, 정렬 방법 및 운영 프로토콜을 소개 합니다. Vivo에서 화상 진 찰 설명 될 것입니다, 그리고 대표적인 결과 제공 됩니다.

비디오: Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

연구

생체공학

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

통합 Photoacoustic Ophthalmoscopy 및 스펙트럼 도메인 광 결맞음 단층 촬영 장치

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

광대역 의료 이미징 애플리케이션을위한 초음파의 광 검출기

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

멀티 모달 분자 이미징 애플리케이션을위한 Biofunctionalized 프 러시안 블루 나노 입자

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 분해 비 계 기반 조직 설계 혈관 개발의 비파괴 모니터링

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

혈관 시각화를 위한 이중 래스터 스캐닝 광음향 소형 동물 이미지

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...

In vivo Structural Assessments of Ocular Disease in Rodent Models using Optical Coherence Tomography

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable tool to evaluate and characterize changes in a variety of retinal and ocular disease and injury models. In light induced retinal degeneration models, SD-OCT can be used to track thinning of the photoreceptor layer over time. In glaucoma models, SD-OCT can be used to monitor decreased retinal nerve fiber layer and total retinal thickness and to observe optic nerve cupping after inducing ocular hypertension. In diabetic rodents, SD-OCT has helped researchers observe decreased total retinal thickness as well as decreased thickness of specific retinal layers, particularly the retinal nerve fiber layer with disease progression. In mouse models of myopia, SD-OCT can be used to evaluate axial parameters, such as axial length changes. Advantages of SD-OCT include in vivo imaging of ocular structures, the ability to quantitatively track changes in ocular dimensions over time, and its rapid scanning speed and high resolution. Here, we detail the methods of SD-OCT and show examples of its use in our laboratory in models of retinal degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and myopia. Methods include anesthesia, SD-OCT imaging, and processing of the images for thickness measurements.

Here, we describe the use of spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) to visualize retinal and ocular structures in vivo in models of retinal degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and myopia.

광학 간섭 단층 촬영을 사용한 설치류 모델에서 안구 질환의 생체 내 구조 평가

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable ...