Name: in vitro rearing of solitary bees: a tool for assessing larval risk factors
Uploaded: 2018-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
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著者に感謝キンボール クラークとティム クローツツハナバチネスト葦を提供するため、メレディス ・ ネスビットとモリー Bidwell ラボ、夫妻のカメロン Currie、クリステル Guédot テリー ・ グリスウォルド、マイケル ・ Branstetter の 3 つの匿名のレビューについて原稿を改善した、有用なコメント。この作品は、米国農務省農業研究サービス充当資金 (現在研究情報システム #3655-21220-001)、ウィスコンシン州農務省、貿易、および消費者保護 (#197199)、(の下で全米科学財団によって支えられました。グラント号DEB-1442148)、DOE グレイト レイクス バイオ エネルギー研究センター (科学 BER ・ デ ・ FC02-07ER64494 の DOE のオフィス)。

1. 殺菌剤曝露実験のための Propiconazole ソリューション
<ol><li>実験の日滅菌水で商業的に購入した propiconazole 14.3% の適切なボリュームを溶解することにより 0.1 x 殺菌剤液を準備します。すべての治療に唯一の作りたて殺菌ソリューションを使用することを確認します。</li>
	<li>23 x 花粉花粉蜂収集24 (0.361 PPM または花粉の有効成分 g-1 μ g) 以前報告された propiconazole の最大濃度を取得提供のグラム当たりの殺菌剤液 0.1 μ L を追加します。</li>
</ol>2. 卵とツツハナバチ葦からホスト花粉規定を収穫します。
<ol><li>滅菌メスを使用して、分析するたてツツハナバチの葦を入れ子にし、個々 の部屋を公開するリードの長さに沿って 2 つの部分に分割を接続します。 注: 各巣は 8 に 14 室と部屋の内の 1 つの卵の間にあります。</li>
	<li>以前に発行されたガイドライン77に基づいて男性の卵を含む部屋を識別するために視覚的にリードを確認します。入れ子のリードから関連付けられた卵と一緒に各花粉の規定を削除し、きれいな配置滅菌曲がった針の使用ボートの重量を量る。</li>
	<li>優しくきれいな細かいペイント ブラシを使用してくださいプロビジョニングから黄身花粉提供の新鮮重を記録し、卵の規格研究所バランスを使用してください。男性花粉規定の平均体重を計算します。</li>
	<li>温度上昇と脱水への暴露から卵に損傷のチャンスを減らすために最小の遅延で後続の手順を実行します。</li>
</ol>3. ホスト植物花粉規定を準備しなさい
<ol><li>寄生虫には現在78がないを確認する入れ子の部屋から発掘された母性集められたホスト植物花粉を目視で確認します。任意の潜在的な母性のバイアスを減らすために滅菌シャーレで単一のマスに花粉規定を組み合わせるし、滅菌針でよく混ぜ。</li>
	<li>合計の質量を分ける新しい花粉規定、各再構成された規定の重量が自然に割り当てられた男性規定の平均体重にほぼ等しい (意味 ± 0.35 ± 0.01 g SE N = 42)。 注: ためツツハナバチ sp。男性の子孫、女性77に比べてオス幼虫の低体重で、この結果に小さい花粉規定を割り当てます。いずれかにセックス固有の相違から生じるこのような偏りを避けるため、実験では男性の卵のみを使用します。</li>
</ol>4. 非宿主植物花粉提供を準備します。
<ol><li>標準研究所のボールミルを用いた微粉末に市販購入した蜂蜜蜂収集した花粉を粉砕します。</li>
	<li>母性収集ホスト花粉規定 (~ 20%) の含水率に基づき、水和物の生地のような一貫性を形成するため徹底的に滅菌 40% 砂糖ソリューション79とミックスの適切なボリュームを使用して花粉粉末。</li>
	<li>個々 の花粉の固まり、自然に割り当てられた男性規定の平均体重と同じ重さ約それぞれに分割します。 注: 水分母性収集されたホスト花粉花粉規定 30 のランダムに選択された男性室80からの新鮮な乾燥重量を比較することによって前の規定を標準化できます。乾燥重量を得るためには、花粉の規定は、エアカーテンで凍結乾燥する必要があります (1.5 72 h の Pa)。</li>
</ol>5. 汚損細胞培養皿を準備しなさい
<ol><li>ライン オートクレーブ錫カップ (5 × 9 cm) 48 ウェル培養プレートの個々 の井戸。滅菌鉗子、カプセルの上部の縁を軽くフレアを使用して花粉規定を収容します。</li>
	<li>治療群に基づく滅菌ツールを使用してブリキのカップ内単一ホストまたは非ホストの花粉規定量を配置します。 注: 交差汚染を避けるためには、するには、処置および制御グループの個別の刷版を使用します。</li>
</ol>6. 殺菌剤を追加します。
<ol><li>滅菌木製の棒を使用して花粉塊内の中央に配置されてうつ病を作る。各花粉の準備のための新しいスティックを使用します。</li>
	<li>うつ病 (治療) のための殺菌剤のソリューションまたは (コントロール) の滅菌水の適切なボリュームに追加します。ピンチ殺菌剤間の表面接触を最小限に抑えるため滅菌の鉗子を用いたうつ病のオープニング ・滅菌水と卵。</li>
	<li>実験的なデザインの階乗のセットアップが配置されていることを確認、模式図 (図 4) に描かれています。</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig4.jpg"> 図 4。実験装置の概略図。実験は、完全に交差 2 × 2 因子の設定を表します。因子 1 殺菌剤暴露を表し、2 つのレベルから成っている: (i) 殺菌剤 (N = 10)、および (ii) 殺菌剤 (N = 10)。要因 2 花粉源を表し、2 つのレベルから成っている: (i) ホストの花粉 (N = 8)、および (ii) 非宿主花粉 (N = 8)。<a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
7. リアし、幼虫を観察
<ol><li>きれいな細かいペイント ブラシを使用して花粉規定の上面にランダムに選ばれた男性の卵を配置します。一度卵は、すべての規定に置かれている、角のテープにラベル付けを確保する細胞培養プレートの蓋を取り付けます。</li>
	<li>きれいなトレイにウェルのプレートを置き、直接光との接触を妨害する暗い布でカバーします。場所 6 ウェル プレート含む 30 mL の滅菌水の乾燥を防ぐためにトレイ内の。室温で孵化盆インキュベーター中邪魔を残します。</li>
	<li>ウェル プレートの蓋を削除せず解剖顕微鏡の下で毎日の健康な版を観察します。動きをチェックして、幼虫が生きていることを確認します。動きが検出されない場合は、死んだ幼虫と残りの花粉規定を含む錫のカップを破棄します。前の段階に達するまでウェル プレート内で妨げられていない開発するすべての存続の幼虫を許可します。</li>
	<li>41前段階に達すれば、ブリキのカップから幼虫を削除します。いずれかをきれいにするブラシの使用は、シルクの繭から排便します。慎重に解剖顕微鏡を用いた絹の繭を切って、ゴム鉗子でイラガ前蛹を抽出します。</li>
	<li>ツールが柔らかい体を刺さないでように優しくイラガ前蛹を処理します。イラガ前蛹 (前バイオマス) および前の段階 (幼虫の発生時間) に卵から発達の時間の新鮮重を記録します。 注: 任意の死んだ幼虫は、死体と残った花粉規定上望ましくない微生物の増殖を防ぐために直ちに破棄する必要があります。これは、残りの健康な幼虫を感染症の危険を減らします。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

その自然営巣葦、研究室の条件の下で外の蜂を飼育幼虫フィットネスに係る複数の仮説のテストが可能します。正体不明の要因は蜂の死亡率を引き起こすリスク評価に関する研究継続する生体外で実験助けることができる潜在的な脅威を特定し、野生花粉12 のこの種豊富なグループの経営慣行を通知 ,38,49,<s...

訪花昆虫群集の1の支配的なグループとしての役割を与え、ミツバチの人口世界的な損失は、食料安全保障と生態系の安定性2,3,4,5,6 に脅威を与える ,7。両方の管理と野生のミツバチの人口の減少傾向は、生息地の断片化、新興寄生虫および病原体、遺伝的多様性の損失、外来種3 の導入を含むいくつかの共有リスク要因に起因しています。 ,4,7,8,9,10、11,12。特に、殺虫剤、(例えば、ネオニコチノイド) の使用の劇的な増加は、蜂13,14,15間の有害な影響に直接リンクされています。いくつかの研究は、ネオニコチノイドとエルゴステ ロール生合成阻害 (EBI) 殺菌剤との相乗効果が複数の蜂種16,17,18の間で高い死亡率につながることを示しています。,19,20,21,22. それにもかかわらず、防かび剤、長い ' 蜂-、安全であると考え続ける多くの精査23なしブルームの作物に噴霧します。採餌蜂は、定期的に殺菌剤の残留24,25,26で汚染された花粉荷を戻すために記載されています。このような殺菌剤 ladenpollen の消費が幼虫蜂27,28,29,30と大人の蜂16間で致死性効果のスイートの中で高い死亡率を引き起こす可能性,31,32,33,34. 最近の研究提案する殺菌剤が蜂と花粉媒介微生物35間重要な共生をそれにより中断ハイブに格納されている花粉内の微生物群集を変えることによってミツバチの損失を引き起こす可能性があります。
孤独な蜂はいくつか野生および農業植物36,37,の受粉のために不可欠ですが38、花粉媒介者のこの多様なグループは農薬モニタリング調査であまり注目を受けています。大人の孤独な女性の巣 5 10 密閉育児室、母性収集した花粉や蜜、単一卵39の有限質量とそれぞれ貯蔵します。孵化後、幼虫は割り当てられた花粉提供と十分な栄養40,41を取得する関連付けられている花粉媒介微生物叢に依存します。社会のライフ スタイルの利点がない、ために、孤独な蜂は農薬暴露42より傷つきやすいかもしれません。社会蜂スプレー、次に赤字中が補償する例えば、いくつかの労働者によって拡張し、新興国ひな、単一の大人の孤独な女性の死終了すべての繁殖活動43。感受性のような差異は、マネージ コードと野生の蜂同様の十分な保護を確保するための生態毒物学的研究の多様な蜂イチイを組み込む必要のあるを強調表示します。ただし、研究の一握り、脇から殺菌剤曝露の影響の調査主に当てている社会蜂18,23,32,44,45 ,46,47,48,49。
孤独な蜂属ツツハナバチ(図 1) はいくつかの重要な果物とナット作物39,50,51,53,の効率的な花粉媒介者として世界的に使用されています。53他のマネージの送粉者と24,54,55,56,,5758のグループ、、成人のツツハナバチ蜂が日常的に。ブルームの作物44に噴霧殺菌剤にさらされます。最近散布作物の成人女性が収集し、殺菌剤を含んだ花粉の後で開発の幼虫の唯一の食事療法を形作る彼らのひな部屋を買いだめ。汚染された花粉規定を消費してその後殺菌剤の残留42幼虫を公開できます。暴露のリスクはいくつか密接に関連ホスト植物59,60,61上だけ飼料 oligolectic 種以上あります。特定の野生のミツバチは、たとえば、優先的に寄生62の減少の手段として低品質キク科花粉用飼料に表示されます。しかし、殺菌剤影響 oligolectic 孤独な蜂の幼虫のフィットネスを与える程度は経験的定量化されていません。本研究の目的は、メインをテストするためのプロトコルを開発する、対話型生体外でのフィットネスに及ぼす殺菌剤の露出と花粉のソースは孤独な蜂を飼育しました。調べるために、 O. ribifloris sensu lato (s. l.) の卵を商業的に得ることができる (材料表)。この人口はネイティブの粉と地域53,報63,64 内花蜜豊富なヒイラギナンテン aquifolium (オレゴンブドウ) のの強い好みとしてその重要性のため理想的です(図 2)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig1.jpg"> 図 1。大人のツツハナバチ ribiflorisの高解像度写真。写真クレジット研究昆虫博士ジム杖 USDA-ARS<a href="/files/ftp_upload/57876/Figure_1.pdf" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig2.jpg"> 図 2。.フォア グラウンドでネスト女性ツツハナバチ ribifloris (s. l.)の葦をネスト Phragmite商工会議所パーティションと葦の端子のプラグは、練りの葉から構成されます。写真クレジット キンボール クラーク氏 NativeBees.com<a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
本研究の第一の目的は消費する (開発時間と前バイオマスの面で測定される) 幼虫のフィットネスで花粉を殺菌剤処理の効果を評価します。広く用いられている殺菌剤 propiconazole への露出は、いくつか種23,24,32,44,45、間大人のミツバチの間で死亡率の増加にリンクされている中 54,55,56,57,58,65,66,67, 幼虫蜂への影響が小さい知られています。本研究の第二の目的は、幼虫フィットネスで非ホスト花粉を消費の影響を評価することです。以前の研究では、oligolectic 蜂の幼虫が非ホスト花粉68消費を強制する場合の開発に失敗することを示します。このような結果は、蜂生理学69、花粉生化学70、および関連付けられている天然の花粉規定71有益マイクロバイ変化に起因する可能性があります。本研究の第 3 の目的は、幼虫のフィットネスに殺菌剤治療と食事花粉のインタラクティブな効果を評価することです。
母体サイズなど多数の生物学的特徴、準備率、採餌戦略と花粉量72,73,74,75知られている孤独な蜂の幼虫のフィットネスに影響を与えます。これらの要因は、葦、幼虫の健康を評価するとき防御実験デザインの開発に挑戦をもたらすとの間の有意な変動を導入できます。また、密封された入れ子葦中幼生が発生すると、子孫にそのような変動の影響が視覚化することは困難と定量化された非殺傷技術 (図 3) を使用してせず。このような課題を克服するために本研究の内ですべての仮説は、その入れ子の葦の外飼育幼虫を用いたテストされます。実験的なデザインを完全に交差 2 × 2 因子のセットアップ、2 レベルから成る各因子とを表します因子 1: 殺菌剤暴露 (殺菌剤;ない殺菌剤);要因 2: 花粉の源 (ホスト花粉、非ホスト花粉)。蜂は、卵から管理された実験室の条件下で無菌 multiwell 細胞培養皿の中で前の段階に発生します。それぞれはよく花粉規定と 1 つの卵の標準化された量の貯蔵は個別に。孵化後、幼虫が井戸の内で割り当てられている花粉のフィードし、幼虫の発育が完了すると蛹化を開始します。過去の研究では、原因不明の死亡が野生49,76で遭遇よりもこの人工飼育環境内で発生したミツバチの間で低いことを示しています。生体外での使用-飼育ミツバチ フィールド ベースの研究上のいくつかの利点がある: 1) 自然変動とフィールド ベースの研究に通常関連付けられているコントロール不良要因の交絡影響を最小限に抑える2) ことができます;、試験治療グループ間で同時にテストに関心の各因子の操作の複数のレベル3) 複製の数があらかじめ決められた、することができ、各複製の実験的要因を個別に操作できます。4) 幼虫応答変数が簡単に可視化し、不穏な隣接する幼虫; せず個別に記録されました。5) プロトコルは、複数の要因と応答の変数を含むより複雑な実験的デザインに合わせて変更できます。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig3.jpg"> 図 3。自然営巣リード内の内容ツツハナバチ ribifloris (s. l.). (A)たて個々 の室、花粉規定とパーティション、および(B)を示す解剖葦収穫花粉規定と関連付けられた卵 (黒い丸で示されます) のクローズ アップ。<a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>eggs of &lt;em&gt;O. ribifloris&lt;/em&gt; sensu lato (s.l.)</td><td></td><td></td><td>Kaysville, Davis County, Utah, USA</td></tr><tr><td>Osmia reeds</td><td>Nativebees.com</td><td>NA</td><td>Freshly plugged reeds</td></tr><tr><td>Dissection set</td><td>VWR</td><td>89259-964</td><td>Sterilize before use</td></tr><tr><td>Long Nose Pliers</td><td>Husky</td><td>1006</td><td></td></tr><tr><td>6 well culture plates</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>Sterile sealed</td></tr><tr><td>48 well culture plates</td><td>VWR</td><td>10062-898</td><td>Sterile sealed</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25373100</td><td>Sterile sealed</td></tr><tr><td>Square Weighing Boats</td><td>VWR</td><td>10770-448</td><td></td></tr><tr><td>Camel Hair Brush</td><td>Bioquip</td><td>1153A</td><td></td></tr><tr><td>Tin capsules</td><td>EA Consumables</td><td>D1021</td><td>Sterilize before use</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>470302-808</td><td></td></tr><tr><td>Propiconazole 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazole 14.3%</td></tr><tr><td>Honey bee pollen</td><td>Bee energised</td><td>897098001244</td><td>Untreated, natural, raw pollen</td></tr><tr><td>Microbalance</td><td>VWR</td><td>10204-990</td><td></td></tr><tr><td>Pulverisette</td><td>LAB SYNERGY INC.</td><td>30334913</td><td></td></tr><tr><td>Wooden sticks</td><td>VWR</td><td>470146908</td><td>Sterilize before use</td></tr><tr><td>Sealing tape</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>VWR</td><td>89403-384</td><td></td></tr><tr><td>Planting tray</td><td>VWR</td><td>470150-632</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>BDH1158-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube</td><td>VWR</td><td>21008936</td><td></td></tr><tr><td>Microsyringe</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-07940-07</td><td></td></tr><tr><td>Rubber tweezer</td><td>Amazon</td><td>B0135HWPN4</td><td></td></tr><tr><td>Syringe needles</td><td>VWR</td><td>89219-334</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drier</td><td>Labcono</td><td>LFZ-1L</td><td></td></tr><tr><td>Statistical software</td><td>SPSS</td><td>Version 21.0</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro rearing of solitary bees: a tool for assessing larval risk factors

孤独な蜂は、野生とマネージ作物の重要な受粉サービスを提供する、この種豊富なグループは、主として農薬規制研究に見過ごされています。殺菌剤残留物への暴露のリスクがスプレー蜂が巣を提供する花粉を収集しているときや、ホスト植物の近くが発生した場合に特に高する可能性があります。植物 (oligolecty) の選択グループから花粉を消費するツツハナバチの種、非ホストの植物からの花粉を使用することができないことは殺菌剤関連毒性の危険因子を増やすことができます。本稿では、正常に oligolectic オーチャードメイソン蜂、標準化された実験室条件下での細胞培養皿の中で前のステージに卵からのツツハナバチ ribifloris sensu lato をリアに使用されるプロトコルについて説明します。体外の飼育ミツバチ蜂フィットネスに及ぼす殺菌剤の露出と花粉のソースを調べるに使用されます。実験 2 × 2 完全に交差因子設計に基づき、前バイオマス、幼虫の発生時間生存し、定量化、幼虫のフィットネスに殺菌剤の露出と花粉の源のメインと対話型効果を調べます。この手法の主な利点は、体外を使用して-飼育ミツバチ自然背景変動を削減し、複数の実験的パラメーターの同時操作。記述されていたプロトコルは、ミツバチの健康に影響を与える要因のスイートを含むテストの仮説のための多目的なツールを示します。保全努力の重要な不変の成功で満たされる、生理学的および環境の蜂の減少要因の複雑な相互作用にこのような洞察力が重要なことを証明します。

幼虫フィットネスの 3 つのメトリック (i) 幼虫の発生時間、(ii) 前のバイオマスと (iii) パーセント生存を使用して定量化を行った。殺菌剤の露出を使用して双方向の分散分析を行った (2 つのレベル: ない殺菌剤、殺菌剤)、花粉源 (2 つのレベル: ホストの花粉、非ホスト花粉) 独立変数と従属変数として幼虫の発生時間。殺菌剤の露出のための主な効果 (F1,28 <...

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In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

体外孤独な蜂の飼育: 幼虫の危険因子を評価するためのツール

開花植物の殺菌剤散布が孤独な蜂花粉媒介殺菌剤残留物の高濃度にあります。生体外で実験室の実験を使用して-飼育ハチの幼虫、この研究調査ホストと非ホストの植物由来殺菌剤処理した花粉を消費のインタラクティブな効果。

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

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Research

JoVE Journal

Environment

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

8.1K ビュー.  University of Wisconsin-Madison. 開花植物の殺菌剤散布が孤独な蜂花粉媒介殺菌剤残留物の高濃度にあります。生体外で実験室の実験を使用して-飼育ハチの幼虫、この研究調査ホストと非ホストの植物由来殺菌剤処理した花粉を消費のインタラクティブな効果。

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Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

個々のコロニーレベルにミツバチ開発に関する環境化学物質の影響を評価します

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

環境学

Rearing and Long-Term Maintenance of Eristalis tenax Hoverflies for Research Studies

With an estimated 6000 species worldwide, hoverflies are ecologically important as alternative pollinators to domesticated honeybees. However, they are also a useful scientific model to study motion vision and flight dynamics in a controlled laboratory setting. As the larvae develop in organically polluted water, they are useful models for investigating investment in microbial immunity. While large scale commercial breeding for agriculture already occurs, there are no standardized protocols for maintaining captive populations for scientific studies. This is important as commercial captive breeding programs focusing on mass output during peak pollination periods may fail to provide a population that is consistent, stable and robust throughout the year, as is often needed for other research purposes. Therefore, a method to establish, maintain and refresh a captive research population is required. Here, we describe the utilization of an artificial hibernation cycle, in addition to the nutritional and housing requirements, for long term maintenance of Eristalis tenax. Using these methods, we have significantly increased the health and longevity of captive populations of E. tenax compared to previous reports. We furthermore discuss small scale rearing methods and options for optimizing yields and manipulating population demographics.

Rearing and Long-Term Maintenance of Eristalis tenax Hoverflies for Research Studies

The overall goal of these procedures is to establish, maintain and refresh a captive population of Eristalis tenax in a research setting.

子育てと研究のEristalis テナックスハナアブの長期メンテナンス

With an estimated 6000 species worldwide, hoverflies are ecologically important as alternative pollinators to domesticated honeybees. However, they are ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

昆虫に行動可塑性を調査するためのテングザルの拡張レスポンスプロトコル：基本、生物医学および農業研究への応用

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

神経科学

Evaluating the Effect of Pesticides on the Larvae of the Solitary Bees

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ingestion of provisions contaminated with pesticides may increase the mortality rate of the larvae, decrease the collection rate and the population of adult solitary bees in the next year from a demographic perspective. But there are limited studies on the effects of pesticides on the larvae of solitary bees. Therefore, understanding how pesticides influence the larvae of solitary bees should be considered an integral part of pesticide ecological risk assessment. This study presents a method to expose the larvae of solitary bee, Osmia excavata, to lethal or sublethal doses of pesticide, tracking larval weight gain, developmental duration, eclosion ability, and food consumption efficiency conversion of ingested food. To demonstrate the effectiveness of this method, the larvae of O. excavata were fed with provisions containing acute lethal and sublethal doses of chlorpyrifos. Then, the above indexes of the treated larvae were investigated. This technique helps to predict and mitigate the risk of pesticides to pollinators.

The present protocol explains a method to feed pesticide-contaminated provisions to the larvae of the solitary bees, Osmia excavata. The procedure examines the ecotoxicity of the pesticide to the larvae of the solitary bees.

孤独なミツバチの幼虫に対する農薬の効果の評価

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ...

生化学

Exploring Life History Choices: Using Temperature and Substrate Type as Interacting Factors for Blowfly Larval and Female Preferences

Blowflies (Diptera: Calliphoridae) present a wide range of larval lifestyles, typically classified as obligate parasitism, facultative parasitism, and complete sapro-necrophagy. Several parasitic species, both obligate and facultative, are considered to be of sanitary and economic importance, as their larvae can cause myiasis (maggot infestation in live tissue). However, it is noteworthy that the adult female plays a decisive role as she chooses the oviposition site, and, therefore, largely determines the feeding habit and developmental conditions of the larvae. In this study, two protocols are proposed to test larval feeding preference and female oviposition site preference considering two interacting factors: meat substrate type and temperature. The setups presented here allowed to test Lucilia cuprina larvae and gravid females in a four-choice assay with two temperatures (33 &plusmn; 2 &#176;C and 25 &plusmn; 2 &#176;C) and two types of meat substrates (fresh meat supplemented with blood and 5-day-old rotten meat). Larvae or gravid females can choose to burrow or lay their eggs, respectively, in either of the following: rotten meat at 25 &#176;C (simulating a necrophagous species condition), fresh meat supplemented with blood at 33 &#176;C (simulating a parasitic species condition), and two controls, rotten meat at 33 &#176;C, or fresh meat supplemented with blood at 25 &#176;C. The preference is assessed by counting the number of larvae or eggs laid in each option for each replicate. Comparing the observed results to a random distribution allowed for the estimation of the statistical significance of the preference. The results indicated that L. cuprina larvae have a strong preference for the rotten substrate at 25 &#176;C. Conversely, oviposition-site preference by females was more varied for the meat type. This methodology can be adapted to test the preference of other insect species of similar size. Other questions can also be explored by using alternative conditions.

Herein, two protocols for assessing food source and oviposition preferences in larvae and females of blowflies are detailed. These comprise four choices with two interacting factors: substrate type and temperature. The assays enable the determination of the food source preference of the larvae and the oviposition site preference for the females.

生活史選択の探索:温度と基質の種類をフバエの幼虫と雌の嗜好の相互作用因子として用いる

Blowflies (Diptera: Calliphoridae) present a wide range of larval lifestyles, typically classified as obligate parasitism, facultative parasitism, and ...

行動学

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best established model to study how plasticity in lifespan and aging is explained by social factors.
The worker caste of honey bees includes nurse bees, which tend the brood, and forager bees, which collect nectar and pollen. Previous work has shown that brain functions and flight performance senesce more rapidly in foragers than in nurses. However, brain functions can recover, when foragers revert back to nursing tasks. Such patterns of accelerated and reversed functional senescence are linked to changed metabolic resource levels, to alterations in protein abundance and to immune function. Vitellogenin, a yolk protein with adapted functions in hormonal control and cellular defense, may serve as a major regulatory element in a network that controls the different aging dynamics in workers.
Here we describe how the emergence of nurses and foragers can be monitored, and manipulated, including the reversal from typically short-lived foragers into longer-lived nurses. Our representative results show how individuals with similar chronological age differentiate into foragers and nurse bees under experimental conditions. We exemplify how behavioral reversal from foragers back to nurses can be validated. Last, we show how different cellular senescence can be assessed by measuring the accumulation of lipofuscin, a universal biomarker of senescence.
For studying mechanisms that may link social influences and aging plasticity, this protocol provides a standardized tool set to acquire relevant sample material, and to improve data comparability among future studies.

In honey bee workers, aging depends on social behaviors rather than on chronological age. Here we show how worker-types with very different aging patterns can be obtained and analyzed for cellular senescence.

ハニービーモデルの老化、減速し加速し、逆に試験片を得た

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

生物学

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

致死の農薬暴露の蜂蜜の蜂のコロニー レベルの効果を監視

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

At-Risk Butterfly Captive Propagation Programs to Enhance Life History Knowledge and Effective Ex Situ Conservation Techniques

Improving knowledge of ex situ best practices for at-risk butterflies is important for generating successful conservation and recovery program outcomes. Research on such captive populations can also yield valuable data to address key information gaps about the behavior, life history, and ecology of the target taxa. We describe a protocol for captive propagation of the federally endangered Cyclargus thomasi bethunebakeri that can be used as a model for other at-risk butterfly ex situ programs, especially those in the family Lycaenidae. We further provide a simple and straightforward protocol for recording various life history metrics that can be useful for informing ex situ methodologies as well as adapted for laboratory studies of other lepidoptera.

Here, we present protocols for 1) the laboratory captive propagation of the federally endangered Miami blue butterfly (Cyclargus thomasi bethunebakeri), and 2) assessing basic life history information such as immature development time and number of larval stadia. Both methods can be adapted for use with other ex situ conservation programs.

生命史知識と効果的な元現場保全技術を強化するための危険な蝶捕虜伝播プログラム

Improving knowledge of ex situ best practices for at-risk butterflies is important for generating successful conservation and recovery program outcomes. ...

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee health, including exposure to viral pathogens. Such viruses can cause a wide variety of devastating effects and can often be challenging to study due to multiple factors that make it difficult to separate the effects of experimental treatments from preexisting background infection. Here we present a method to mass produce large quantities of virus particles along with a high throughput bioassay to test viral infection and effects. Necessitated by the current lack of a continuous, virus-free honey bee cell line, viral particles are amplified in vivo using honey bee pupae, which are extracted from the hive in large volumes using minimally stressful methodology. These virus particles can then be used in honey bee cage bioassays to test inocula viability, as well as various other virus infection dynamics, including interactions with nutrition, pesticides, and other pathogens. A major advantage of using such particles is that it greatly reduces the chances of introducing unknown variables in subsequent experimentation when compared to current alternatives, such as infection via infected bee hemolymph or homogenate, though care should still be taken when sourcing the bees, to minimize background virus contamination. The cage assays are not a substitute for large-scale, field-realistic experiments testing virus infection effects at a colony level, but instead function as a method to establish baseline viral responses that, in combination with the semi-pure virus particles, can serve as important tools to examine various dimensions of honey bee-virus physiological interactions.

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Here we describe two protocols: first to propagate, extract, purify, and quantify large quantities of honey bee non-enveloped virus particles, including a method for removing honey bee pupae and second to test the effects of viral infection using a highly repeatable, high-throughput cage bioassay.

ミツバチの経口感染のためのウイルス富化接種剤の調製(Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

交配ミツバチクイーンズへの農薬リスクの評価

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

体外孤独な蜂の飼育: 幼虫の危険因子を評価するためのツール

要約

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個々のコロニーレベルにミツバチ開発に関する環境化学物質の影響を評価します

子育てと研究のEristalis テナックスハナアブの長期メンテナンス

昆虫に行動可塑性を調査するためのテングザルの拡張レスポンスプロトコル：基本、生物医学および農業研究への応用

孤独なミツバチの幼虫に対する農薬の効果の評価

生活史選択の探索:温度と基質の種類をフバエの幼虫と雌の嗜好の相互作用因子として用いる

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