Name: in vitro rearing of solitary bees: a tool for assessing larval risk factors
Uploaded: 2018-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
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저자 감사 실험실 박사 카 메 론 커리, 크리스텔 Guédot, 테리 Griswold, 마이클 Branstetter,에 대 한 3 명의 익명 검토자에 몰리 Bidwell, 디스 네 스 빗 및 Osmia 중첩 갈 대를 제공 하기 위한 팀 Krogh, Kimball 클락 원고를 개선 하는 그들의 유용한 의견. 이 작품은 미국 농 무부 농업 연구 서비스 충당 자금 (현재 연구 정보 시스템 #3655-21220-001), 위스콘신 농업의, 무역 및 소비자 보호 (#197199), 국립 과학 재단 (에 의해 지원 되었다 부여 번호 DEB-1442148), 미상 그레이트 호수 Bioenergy 연구 센터 (과학 BER 드-FC02-07ER64494의 암컷 사무실).

1. 살 균 제 노출 실험을 위한 Propiconazole 솔루션 준비
<ol><li>실험의 하루 살 균 물에 상업적으로 구입한 propiconazole 14.3%의 적절 한 볼륨을 용 해 하 여 균 솔루션 x 0.1을 준비 합니다. 모든 치료에 대 한 유일한 갓된 균 솔루션 사용은 확인 합니다.</li>
	<li>꿀벌 수집 꽃가루24 (0.361 PPM 또는 꽃가루의 활성 성분 g-1 의 µ g)에서 이전에 보고 된 propiconazole의 최대 농도를 꽃가루의 그램 당 균 솔루션 x 0.1의 23 µ L를 추가 합니다.</li>
</ol>2. 계란과 호스트 Osmia 갈 대에서 꽃가루 규정을 수확
<ol><li>멸 균된 메스를 사용 하 여, 갓 갈 대 Osmia의 중첩, 개별 실 노출 리드의 길이 따라 두 부분으로 분할 연결 해 부. 참고: 각 둥지는 8 ~ 14 챔버와 챔버 내에서 단일 계란 사이 포함할 수 있습니다.</li>
	<li>이전에 게시 지침77에 따라 남성 계란을 포함 하는 실을 식별 하는 시각적으로 갈 대를 검사 합니다. 중첩 리드에서 관련된 달걀 함께 각 꽃가루 규정을 제거 하 고 깨끗 한 장소 소독된 구부러진된 바늘을 사용 하 여 보트 무게.</li>
	<li>부드럽게 깨끗 한 벌금 페인트 브러시를 사용 하 여 제공에서 계란을 분리 하 고 꽃가루 조항의 신선한 무게 기록 표준 실험실 균형을 사용 하 여 계란. 남성 꽃가루 규정의 평균 중량을 계산 합니다.</li>
	<li>초과 온도 탈수에 노출에서 계란에 손상의 기회를 줄이기 위해 최소 지연으로 다음 단계를 수행 합니다.</li>
</ol>3. 준비 호스트 식물 꽃가루 규정
<ol><li>없는 기생충 현재78되도록 중첩 챔버에서 발굴 임산부 수집된 호스트-식물 꽃가루를 않았는지 살펴보십시오. 어떤 잠재적인 모성 편견을 줄이기 위해 멸 균 페 트리 접시에 단일 대량으로 꽃가루 규정을 결합 하 고 멸 균된 바늘을 사용 하 여 잘 혼합 합니다.</li>
	<li>새로운 꽃가루 규정, 각 재구성의 무게는 자연스럽 게 할당 된 남성 규정의 평균 무게에 거의 같은 보장에 결합 된 질량을 분할 (의미 ± SE, 0.35 ± 0.01 g, N = 42). 참고: 때문에 Osmia sp. 작은 꽃가루 규정 남성 자손, 여성77에 비해 남성 애벌레의 낮은 몸 무게에이 결과에 할당 합니다. 어떤에 게 섹스의 차이점에서 발생 하는 이러한 바이어스를 방지 하려면 실험에서 남성 계란만 사용 합니다.</li>
</ol>4. 비 호스트 식물 꽃가루 제공 준비
<ol><li>표준 실험실 볼 밀을 사용 하 여 정밀한 분말에 상업적으로 구입한 꿀 꿀벌 수집 꽃가루 격파</li>
	<li>임산부 수집 호스트 꽃가루 규정 (~ 20%)의 함량에 따라 달라 집니다, 꽃가루 가루 반죽 같은 일관성을 형성 하기 위하여 철저 하 게 소독 40% 설탕 솔루션79 및 혼합의 적절 한 볼륨을 사용 하 여 하이드 레이트.</li>
	<li>개별 꽃가루 질량으로 분할 자연스럽 게 할당 된 남성 규정의 평균 무게와 같은 무게 약 각. 참고: 규정 30 무작위로 선택 된 남성 챔버80에서 꽃가루 규정의 신선 하 고 건조 중량을 비교 하 여 사전에 표준화 될 수 있다 임산부 수집된 호스트 꽃가루 수 분 콘텐츠입니다. 건조 중량을 얻으려면, 꽃가루 규정 한 lyophilizer에서 동결 해야 (1.5 72 h에 대 한 펜 실바 니 아).</li>
</ol>5. 준비 Multiwell 세포 배양 배지
<ol><li>압력가 주석 컵 (5 × 9 cm)와 살 균 48-잘 문화 판의 개별 웰 스 라인. 꽃가루 조항을 수용할 수 있도록 살 균 겸 부드럽게 캡슐의 위쪽 테두리 밖으로 감각을 사용 합니다.</li>
	<li>호스트 또는 호스트 비 꽃가루의 단일 대량 치료 그룹에 따라 살 균 도구를 사용 하 여 주석 컵 안에 배치 합니다. 참고: 교차 오염을 피하기 위해, 치료 및 제어 그룹에 대 한 별도 접시를 사용 합니다.</li>
</ol>6. Fungicides를 추가
<ol><li>메 마른 나무 막대기를 사용 하 여 꽃가루 질량 내의 중앙 배치 우울증을 확인 합니다. 새로운 막대기를 사용 하 여 각 꽃가루 조항에 대 한.</li>
	<li>우울증에 (치료)에 대 한 살 균 제 솔루션 또는 살 균 물 (컨트롤)에 대 한 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 핀치는 살 균 제 사이의 표면 접촉을 최소화 하기 위해 살 균 집게를 사용 하 여 우울증의 열기 / 살 균 물과 계란.</li>
	<li>실험적인 디자인의 계승 설정 그 일치 해야 도식 표현 (그림 4)에 묘사 된.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig4.jpg"> 그림 4입니다. 실험적인 체제의 도식 대표. 실험을 완전히 넘어 2 × 2 계승 설정을 나타냅니다. 1 살 균 제 노출 나타냅니다 비율과 2 레벨의 구성: (i) 균 (N = 10), 그리고 (ii) 균 (N = 10). 2 꽃가루 소스 나타냅니다 비율과 2 레벨의 구성: (i) 호스트 꽃가루 (N = 8), 그리고 (ii) 비-호스트 꽃가루 (N = 8). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
7. 후방 고 애벌레 관찰
<ol><li>장소 깨끗 한 벌금 페인트 브러시를 사용 하 여 꽃가루 규정의 위쪽 표면에 임의로 선택 된 남성 계란. 일단 계란 모든 규정에 배치 되었습니다, 그리고 라벨 모서리에 테이프와 보호 셀 문화 접시의 뚜껑을 대체.</li>
	<li>깨끗 한 쟁반에 잘 접시를 놓고 직접 빛과의 접촉을 방해 어두운 천으로 커버. 장소 6 잘 플레이트의 건조를 방지 하기 위해 트레이 내의 살 균 물 포함 30 mL. 실 온에서 부 화 쟁반 인큐베이터 안에 그대로 둡니다.</li>
	<li>잘 접시의 뚜껑을 제거 하지 않고 해 현미경 매일 잘 접시를 관찰 합니다. 애벌레는 살아 움직임을 확인 하 여 확인 합니다. 아무 움직임을 감지할 경우 죽은 애벌레와 나머지 꽃가루 규정을 포함 하는 주석 컵 폐기. 모든 살아남은 애벌레 prepupal 단계를 도달할 때까지 그대로 잘 플레이트 내에서 개발 하는 것을 허용 한다.</li>
	<li>Prepupal 단계41에 도달 하면 주석 컵에서 유 충을 제거 합니다. 어떤 청소 브러쉬를 사용 하 여 실크 누에고치에서 똥. 신중 하 게 해 현미경을 사용 하 여 실크 누에고치를 극복 하 고 고무 집게와는 prepupa를 추출 합니다.</li>
	<li>Prepupa 도구 소프트 바디 피어스 하지 할 수 있도록 부드럽게 처리 합니다. Prepupa (prepupal 바이오 매스)의 prepupal 단계 (애벌레 발달 시간)에 계란에서 개발 시간 신선한 무게를 기록 합니다. 참고: 모든 죽은 유 충 시신에 남은 꽃가루 조항 원치 않는 미생물 성장을 방지 하기 위해 즉시 삭제 됩니다 해야 합니다. 이 나머지 건강 한 애벌레를 감염의 위험을 줄여줍니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

그들의 자연적인 중첩 갈 대, 실험실 조건 하에서 외부 꿀벌을 양육 애벌레 피트 니스에 관한 여러 가설의 테스트 수 있습니다. 수 정체 불명된 요인 계속 비 사망 원인, 위험 평가 연구 생체 외에서 사용 하 여 실험 수 잠재적인 위협을 식별 하 고 야생 가루 12의이 종 부유한 그룹에 대 한 관리 사례를 알려 ,38,49,...

곤충 가루1의 지배적인 그룹으로 서의 역할을 감안할 때, 꿀벌 인구에 있는 글로벌 손실 위협이 식량 안보 및 생태계 안정성2,3,,45,6 ,7. 모두와 야생 꿀벌 인구에 있는 감소 추세 있다 서식 지 파편, 신흥 기생충 및 병원 균, 유전적 다양성의 손실 및 침입 종3의 도입을 포함 한 여러 공유 위험 요인에 기인 ,4,7,8,9,10,,1112. 특히, 증가 (예를 들어, neonicotinoids), 농약의 사용은 꿀벌13,,1415간의 해로운 효과에 직접 연결 되었다. 여러 연구 neonicotinoids 사이의 ergosterol 생 합성 억제 (비) 살 균 제 성분 여러 벌 종16,,1718 에서 높은 사망으로 이어질 수 있습니다. , 19 , 20 , 21 , 22. 그럼에도 불구 하 고, 살 균 제, 긴 ' 비 안전 '으로 간주 많은 감시23없이 꽃에서 작물에 살포 될 계속. 채집 자 벌 려 정기적으로 살 균 제 잔류물24,,2526으로 오염 하는 꽃가루 중 문서화 되었습니다. 같은 살 균 제 ladenpollen의 소비 애벌레 꿀벌27,,2829,30및 성인 꿀벌16 중 하위 치명적인 효과의 제품군 중 높은 사망을 일으킬 수 있습니다. , 31 , 32 , 33 , 34. 최근 연구 제안 fungicides 꿀벌 꽃가루 부담 미생물35사이 중요 한 공생을 방해 함으로써 하이브 저장 꽃가루 내 미생물 커뮤니티를 변경 하 여 비 손실을 발생할 수 있습니다.
고독한 꿀벌은 여러 야생 및 농업 식물36,37,의 수 분에 대 한 중요 한38, 가루의이 다양 한 그룹 연구를 모니터링 하는 농약에 훨씬 덜 관심을 받고 있다. 성인 고독한 여성의 둥지 5-10 봉인된 브루 드 챔버, 각 임산부 수집 꽃가루와 꿀, 그리고 단일 계란39의 유한 질량 갖춰져 있습니다. 후에 부 화, 애벌레 할당 된 꽃가루 규정 그리고 적절 한 영양40,41관련된 꽃가루 부담 microbiota에 의존 합니다. 사회 생활의 혜택, 부족 하기 때문에 고독한 꿀벌 농약 노출42에 더 취약 있을 수 있습니다. 예를 들어, 다음 스프레이 사회 꿀벌에 적자 동안 보상 수도를 일부 노동자에 의해 확장 하 고 새로 가만히 신흥, 단일 성인 고독한 여자의 죽음 끝 모든 생식 활동43. 민감성에 이러한 차이 ecotoxicological 연구와 야생 꿀벌 모두에 대 한 적절 한 보호를 보장 하기 위해 다양 한 비 taxa를 통합할 필요가 강조 표시 합니다. 그러나, 연구의 한 줌, 외 균 노출의 효과에 대 한 조사는 주로에 초점을 맞춘 사회적 꿀벌18,23,32,44,45 ,,4647,,4849.
고독한 꿀벌 속 Osmia (그림 1)에 속하는 몇 가지 중요 한 과일 및 견과 작물39,50,,5153, 의 효율적인 가루로 사용 되었습니다. 53. 다른 관리 pollinator 그룹24,54,,5556,,5758성인 Osmia 꿀벌은 정기적으로 44-꽃 작물 살포 하는 균에 노출. 최근 스프레이 작물에 식량 약탈을 배워 성인 여성 수집 하 고 재고 나중 발전 애벌레에 대 한 유일한 다이어트를 형성 하는 균 라덴 꽃가루와 그들의 브루 드 실 수 있습니다. 오염된 꽃가루 규정 사용 후 살 균 제 잔류물42애벌레를 노출할 수 있습니다. 노출의 위험 몇 가지 밀접 하 게 관련된 호스트 식물59,,6061에 사료 oligolectic 종 가운데 더 높은 수 있습니다. 예를 들어 특정 megachilid 꿀벌 우선적으로 기생62를 줄이는 수단으로 고품질 국화과 꽃가루에 대 한 마 초 나타납니다. 그러나,는 균 중 oligolectic 고독한 꿀벌 애벌레 피트 니스 영향 정도 하지 되었습니다 실험적으로 측정할. 이 연구의 목표 주요 테스트 프로토콜을 개발 하는 것 이며 생체 외에서 의 피트 니스에 살 균 제 노출 및 꽃가루 소스의 대화형 효과 reared 고독한 꿀벌. 조사, O. ribifloris sensu lato (s.l.)의 계란 얻어질 수 있다 상업적으로 (자료 테이블). 이 인구는 네이티브 pollinator는 지역53,63,64 내 과즙이 풍부한 Mahonia aquifolium (오 레 곤 포도)에 대 한 그것의 강한 취향이로 그것의 중요성 때문에 이상적인 (그림 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig1.jpg"> 그림 1입니다. 성인 Osmia ribifloris의 고해상도 사진. 사진 박사 짐 지팡이, 연구 곤충학자, 미국 농 무부-ARS 신용 <a href="/files/ftp_upload/57876/Figure_1.pdf" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig2.jpg"> 그림 2입니다. 중첩 중첩 여성 전경. 에 Osmia ribifloris (s.l.) 의 갈 대 Phragmite 챔버 파티션 및 갈 대에 대 한 터미널 플러그 masticated 잎에서 건설 한다. 사진 제공 씨 킴 볼 클락, NativeBees.com <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 연구의 첫 번째 목적은 애벌레 피트 니스 (개발 시간 및 prepupal 생물 측정)에 살 균 제 처리 꽃가루를 사용의 효과 평가 하는 것입니다. 일반적인 적용된 살 균 제 propiconazole에 노출은 여러 종 23,,2432,44,45, 전체 성인 꿀벌 중 사망률 증가에 연결 되었다 하는 동안 은 54,55,56,,5758,65,66,67, 애벌레 꿀벌에 미치는 영향 알려진. 이 연구의 두 번째 목적은 비 호스트 꽃가루 애벌레 체력에 소모의 효과 평가 하는 것입니다. 이전 연구 oligolectic 꿀벌의 애벌레 아닌 호스트 꽃가루68소비 하도록 개발 실패를 나타냅니다. 이러한 결과 변화 비 생리학69, 꽃가루 생화학70, 그리고 자연 꽃가루 규정71와 관련 된 유익한 미생물에 표시 될 수 있습니다. 이 연구의 세 번째 목적은 애벌레 체력에 균 치료와 식이 꽃가루의 대화형 효과 평가 하는 것입니다.
모성 신체 크기를 포함 하 여 수많은 생물 학적 특성, 속도, 프로비저닝 구하고 전략과 꽃가루 수량72,,7374,75 알려져 있습니다 고독한 꿀벌 중 애벌레 적합성에 영향을 미칠. 이러한 요소는 애벌레 건강을 평가할 때 방어할 수 있는 실험적인 디자인을 개발에 도전 포즈 갈 대 사이 뜻깊은 가변성을 발생할 수 있습니다. 또한, 애벌레의 개발 된 중첩 갈 대 내부에서 발생, 그 자손에 이러한 가변성의 효과 시각화 하기가 어렵습니다과 계량 없이 치명적이 지 않은 기법 (그림 3). 이 문제를 해결 하려면 모든 가설이이 연구에서 그들의 중첩 갈 대 외부 reared 애벌레를 사용 하 여 테스트 합니다. 실험 설계는 완전히 교차 2 × 2 계승 설정, 각 인자 2 수준; 구성 된 대표 요인 1: 살 균 제 노출 (살 균 제; 아니 살 균 제); 팩터 2: 꽃가루 소스 (호스트 꽃가루, 비-호스트 꽃가루). 꿀벌 계란에서 통제 된 실험실 조건에서 살 균 multiwell 세포 배양 배지 내에서 prepupal 단계를 발생 합니다. 각 잘는 개별적으로 각종 꽃가루 제공 및 단일 계란 표준화 된 양의 있습니다. 해칭, 후 유 충 우물 내에서 할당 된 꽃가루에 피드를 애벌레의 개발을 완료 고 pupation 시작. 과거의 연구 원인 불명된 사망은 야생49,76에서 발생 보다이 인공 양육 환경 내에서 발생 하는 꿀벌 가운데 낮은 나타났습니다. 생체 외에서의 사용-reared 꿀벌 필드 기반 연구를 통해 몇 가지 이점이 있다: 1) 그것은 자연적인 가변성 및 필드 기반 연구;와 일반적으로 관련 된 통제 요인의 혼동 영향을 최소화 2) 그것은 조작 각 factor(s)에 대 한 관심을 동시에 치료 그룹; 테스트의 여러 레벨을 허용 한다 3) 복제의 수를 미리 결정 된, 수 및 각 복제에 대 한 실험적인 요소를 개별적으로 조작할 수 있습니다. 4) 애벌레 응답 변수를 쉽게 시각화 하 고 방해 인접 한 애벌레; 없이 독립적으로 기록 된 수 있다 5) 프로토콜 여러 요인과 반응 변수 관련 된 더 복잡 한 실험 설계에 맞게 수정할 수 있습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig3.jpg"> 그림 3입니다. 자연 중첩 리드의 내용을 Osmia ribifloris (s.l.). (A) 개별 챔버, 꽃가루 규정 및 파티션, 및 (B)를 갓 보여주는 해 부 리드 수확 꽃가루 규정과 관련 된 계란 (검은 원 표시) 닫습니다. <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>eggs of &lt;em&gt;O. ribifloris&lt;/em&gt; sensu lato (s.l.)</td><td></td><td></td><td>Kaysville, Davis County, Utah, USA</td></tr><tr><td>Osmia reeds</td><td>Nativebees.com</td><td>NA</td><td>Freshly plugged reeds</td></tr><tr><td>Dissection set</td><td>VWR</td><td>89259-964</td><td>Sterilize before use</td></tr><tr><td>Long Nose Pliers</td><td>Husky</td><td>1006</td><td></td></tr><tr><td>6 well culture plates</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>Sterile sealed</td></tr><tr><td>48 well culture plates</td><td>VWR</td><td>10062-898</td><td>Sterile sealed</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25373100</td><td>Sterile sealed</td></tr><tr><td>Square Weighing Boats</td><td>VWR</td><td>10770-448</td><td></td></tr><tr><td>Camel Hair Brush</td><td>Bioquip</td><td>1153A</td><td></td></tr><tr><td>Tin capsules</td><td>EA Consumables</td><td>D1021</td><td>Sterilize before use</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>470302-808</td><td></td></tr><tr><td>Propiconazole 14.3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazole 14.3%</td></tr><tr><td>Honey bee pollen</td><td>Bee energised</td><td>897098001244</td><td>Untreated, natural, raw pollen</td></tr><tr><td>Microbalance</td><td>VWR</td><td>10204-990</td><td></td></tr><tr><td>Pulverisette</td><td>LAB SYNERGY INC.</td><td>30334913</td><td></td></tr><tr><td>Wooden sticks</td><td>VWR</td><td>470146908</td><td>Sterilize before use</td></tr><tr><td>Sealing tape</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>VWR</td><td>89403-384</td><td></td></tr><tr><td>Planting tray</td><td>VWR</td><td>470150-632</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>BDH1158-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube</td><td>VWR</td><td>21008936</td><td></td></tr><tr><td>Microsyringe</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-07940-07</td><td></td></tr><tr><td>Rubber tweezer</td><td>Amazon</td><td>B0135HWPN4</td><td></td></tr><tr><td>Syringe needles</td><td>VWR</td><td>89219-334</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drier</td><td>Labcono</td><td>LFZ-1L</td><td></td></tr><tr><td>Statistical software</td><td>SPSS</td><td>Version 21.0</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro rearing of solitary bees: a tool for assessing larval risk factors

고독한 꿀벌 와일드 하 고 관리 되는 작물에 대 한 중요 일 분의 서비스를 제공 하는 있지만이 종 부유한 그룹 크게 간과 되어 농약 규제 연구. 살 균 제 잔류물에 노출의 모험 경우 스프레이 또는 호스트 식물 근처에, 꿀벌은 그들의 둥지를 구축 하는 꽃가루를 수집 하는 동안 특히 높을 것입니다. 꽃가루 식물 (oligolecty)의 선택 그룹에서 사용 하는 Osmia 의 종, 비 호스트 식물에서 꽃가루를 사용 하는 무 능력 살 균 제 관련 독성에 대 한 그들의 위험 요소를 높일 수 있습니다. 이 원고는 성공적으로 oligolectic 메이슨 꿀벌, 표준화 된 실험실 조건에서 세포 배양 배지 내에서 prepupal 단계를 달걀에서 Osmia ribifloris sensu lato 후면에 사용 되는 프로토콜을 설명 합니다. 생체 외에서-reared 꿀벌 이후 벌 체력에 살 균 제 노출 및 꽃가루 소스의 효과 조사 하기 위해 사용 됩니다. 2 × 2 완전히 넘어 계승 디자인에 따라 실험 prepupal 바이오 매스, 애벌레 발달 시간 및 survivorship 계량 애벌레 피트 니스에 살 균 제 노출 및 꽃가루 근원의 주요 및 대화형 효과 검사 합니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 외에서사용 하 여-reared 꿀벌 자연 배경 가변성을 감소 시킨다 고 여러 실험적인 매개 변수의 동시 조작 있습니다. 설명된 프로토콜 가설 꿀벌 건강에 영향을 미치는 요인의 제품군과 관련 된 테스트에 대 한 다양 한 도구를 제공 합니다. 중요 한, 지속적인 성공을 충족 되어야 보존 노력에 대 한 꿀벌 감소를 촉진 하는 생리와 환경 요인의 복잡 한 상호 작용으로 이러한 통찰력 중요할 증명할 것 이다.

애벌레 피트 니스 3 통계 (i) 애벌레 발달 시간, (ii) prepupal 바이오 매스, 그리고 (iii) %survivorship 사용 하 여 정량 했다. 양방향 ANOVA 균 노출을 사용 하 여 실시 되었다 (2 레벨: 아니 살 균 제, 살 균 제) 및 꽃가루 소스 (2 레벨: 호스트 꽃가루, 비-호스트 꽃가루) 독립 변수와 종속 변수 애벌레 발달 시간으로. 살 균 제 노출에 대 한 주요 효과 (F1,28 = 1.24, P = 0...

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In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

생체 외에서 고독한 꿀벌의 양육: 애벌레 위험 요소를 평가 하기 위한 도구

꽃 식물에 균 스프레이 고독한 꿀벌 꽃가루 부담 균 잔류물의 높은 농도에 노출 될 수 있습니다. 실험실 기반 실험 체 외에관련 된을 사용 하 여-reared 꿀벌 애벌레,이 연구 균 처리 꽃가루 호스트와 호스트 비 식물에서 파생 된 소모의 대화형 효과 조사.

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

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Research

JoVE Journal

Environment

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

8.1K 조회수.  University of Wisconsin-Madison. 꽃 식물에 균 스프레이 고독한 꿀벌 꽃가루 부담 균 잔류물의 높은 농도에 노출 될 수 있습니다. 실험실 기반 실험 체 외에관련 된을 사용 하 여-reared 꿀벌 애벌레,이 연구 균 처리 꽃가루 호스트와 호스트 비 식물에서 파생 된 소모의 대화형 효과 조사.

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Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

식민지 수준에 개인에서 꿀 꿀벌 개발에 대한 환경 화학 물질의 효과를 평가

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

연구

환경과학

Rearing and Long-Term Maintenance of Eristalis tenax Hoverflies for Research Studies

With an estimated 6000 species worldwide, hoverflies are ecologically important as alternative pollinators to domesticated honeybees. However, they are also a useful scientific model to study motion vision and flight dynamics in a controlled laboratory setting. As the larvae develop in organically polluted water, they are useful models for investigating investment in microbial immunity. While large scale commercial breeding for agriculture already occurs, there are no standardized protocols for maintaining captive populations for scientific studies. This is important as commercial captive breeding programs focusing on mass output during peak pollination periods may fail to provide a population that is consistent, stable and robust throughout the year, as is often needed for other research purposes. Therefore, a method to establish, maintain and refresh a captive research population is required. Here, we describe the utilization of an artificial hibernation cycle, in addition to the nutritional and housing requirements, for long term maintenance of Eristalis tenax. Using these methods, we have significantly increased the health and longevity of captive populations of E. tenax compared to previous reports. We furthermore discuss small scale rearing methods and options for optimizing yields and manipulating population demographics.

Rearing and Long-Term Maintenance of Eristalis tenax Hoverflies for Research Studies

The overall goal of these procedures is to establish, maintain and refresh a captive population of Eristalis tenax in a research setting.

양육 및 조사 연구에 대 한 Eristalis tenax Hoverflies의 유지 보수 장기

With an estimated 6000 species worldwide, hoverflies are ecologically important as alternative pollinators to domesticated honeybees. However, they are ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

코 확장 응답 곤충의 행동 소성을 조사하기위한 프로토콜 : 기본, 바이오 메디컬에 응용 프로그램, 및 농업 연구

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

신경과학

Evaluating the Effect of Pesticides on the Larvae of the Solitary Bees

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ingestion of provisions contaminated with pesticides may increase the mortality rate of the larvae, decrease the collection rate and the population of adult solitary bees in the next year from a demographic perspective. But there are limited studies on the effects of pesticides on the larvae of solitary bees. Therefore, understanding how pesticides influence the larvae of solitary bees should be considered an integral part of pesticide ecological risk assessment. This study presents a method to expose the larvae of solitary bee, Osmia excavata, to lethal or sublethal doses of pesticide, tracking larval weight gain, developmental duration, eclosion ability, and food consumption efficiency conversion of ingested food. To demonstrate the effectiveness of this method, the larvae of O. excavata were fed with provisions containing acute lethal and sublethal doses of chlorpyrifos. Then, the above indexes of the treated larvae were investigated. This technique helps to predict and mitigate the risk of pesticides to pollinators.

The present protocol explains a method to feed pesticide-contaminated provisions to the larvae of the solitary bees, Osmia excavata. The procedure examines the ecotoxicity of the pesticide to the larvae of the solitary bees.

살충제가 독방 꿀벌의 유충에 미치는 영향 평가

Current ecological risk assessments of pesticides on pollinators have primarily considered only laboratory conditions. For the larvae of solitary bees, ...

생화학

Exploring Life History Choices: Using Temperature and Substrate Type as Interacting Factors for Blowfly Larval and Female Preferences

Blowflies (Diptera: Calliphoridae) present a wide range of larval lifestyles, typically classified as obligate parasitism, facultative parasitism, and complete sapro-necrophagy. Several parasitic species, both obligate and facultative, are considered to be of sanitary and economic importance, as their larvae can cause myiasis (maggot infestation in live tissue). However, it is noteworthy that the adult female plays a decisive role as she chooses the oviposition site, and, therefore, largely determines the feeding habit and developmental conditions of the larvae. In this study, two protocols are proposed to test larval feeding preference and female oviposition site preference considering two interacting factors: meat substrate type and temperature. The setups presented here allowed to test Lucilia cuprina larvae and gravid females in a four-choice assay with two temperatures (33 &plusmn; 2 &#176;C and 25 &plusmn; 2 &#176;C) and two types of meat substrates (fresh meat supplemented with blood and 5-day-old rotten meat). Larvae or gravid females can choose to burrow or lay their eggs, respectively, in either of the following: rotten meat at 25 &#176;C (simulating a necrophagous species condition), fresh meat supplemented with blood at 33 &#176;C (simulating a parasitic species condition), and two controls, rotten meat at 33 &#176;C, or fresh meat supplemented with blood at 25 &#176;C. The preference is assessed by counting the number of larvae or eggs laid in each option for each replicate. Comparing the observed results to a random distribution allowed for the estimation of the statistical significance of the preference. The results indicated that L. cuprina larvae have a strong preference for the rotten substrate at 25 &#176;C. Conversely, oviposition-site preference by females was more varied for the meat type. This methodology can be adapted to test the preference of other insect species of similar size. Other questions can also be explored by using alternative conditions.

Herein, two protocols for assessing food source and oviposition preferences in larvae and females of blowflies are detailed. These comprise four choices with two interacting factors: substrate type and temperature. The assays enable the determination of the food source preference of the larvae and the oviposition site preference for the females.

생활사 선택 탐색: 날파리 유충과 암컷 선호도에 대한 상호 작용 요인으로 온도 및 기질 유형 사용

Blowflies (Diptera: Calliphoridae) present a wide range of larval lifestyles, typically classified as obligate parasitism, facultative parasitism, and ...

행동분석학

Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best established model to study how plasticity in lifespan and aging is explained by social factors.
The worker caste of honey bees includes nurse bees, which tend the brood, and forager bees, which collect nectar and pollen. Previous work has shown that brain functions and flight performance senesce more rapidly in foragers than in nurses. However, brain functions can recover, when foragers revert back to nursing tasks. Such patterns of accelerated and reversed functional senescence are linked to changed metabolic resource levels, to alterations in protein abundance and to immune function. Vitellogenin, a yolk protein with adapted functions in hormonal control and cellular defense, may serve as a major regulatory element in a network that controls the different aging dynamics in workers.
Here we describe how the emergence of nurses and foragers can be monitored, and manipulated, including the reversal from typically short-lived foragers into longer-lived nurses. Our representative results show how individuals with similar chronological age differentiate into foragers and nurse bees under experimental conditions. We exemplify how behavioral reversal from foragers back to nurses can be validated. Last, we show how different cellular senescence can be assessed by measuring the accumulation of lipofuscin, a universal biomarker of senescence.
For studying mechanisms that may link social influences and aging plasticity, this protocol provides a standardized tool set to acquire relevant sample material, and to improve data comparability among future studies.

In honey bee workers, aging depends on social behaviors rather than on chronological age. Here we show how worker-types with very different aging patterns can be obtained and analyzed for cellular senescence.

둔화 가속과 반전 꿀 꿀벌 모델에서 노화와 표본을 얻기

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

생물학

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

꿀 꿀벌에 Sublethal 농약 노출의 식민지 수준 효과 모니터링

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

At-Risk Butterfly Captive Propagation Programs to Enhance Life History Knowledge and Effective Ex Situ Conservation Techniques

Improving knowledge of ex situ best practices for at-risk butterflies is important for generating successful conservation and recovery program outcomes. Research on such captive populations can also yield valuable data to address key information gaps about the behavior, life history, and ecology of the target taxa. We describe a protocol for captive propagation of the federally endangered Cyclargus thomasi bethunebakeri that can be used as a model for other at-risk butterfly ex situ programs, especially those in the family Lycaenidae. We further provide a simple and straightforward protocol for recording various life history metrics that can be useful for informing ex situ methodologies as well as adapted for laboratory studies of other lepidoptera.

Here, we present protocols for 1) the laboratory captive propagation of the federally endangered Miami blue butterfly (Cyclargus thomasi bethunebakeri), and 2) assessing basic life history information such as immature development time and number of larval stadia. Both methods can be adapted for use with other ex situ conservation programs.

생명역사 지식과 효과적인 Ex Situ 보존 기술을 향상시키기 위한 위험에 처한 나비 포로 전파 프로그램

Improving knowledge of ex situ best practices for at-risk butterflies is important for generating successful conservation and recovery program outcomes. ...

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee health, including exposure to viral pathogens. Such viruses can cause a wide variety of devastating effects and can often be challenging to study due to multiple factors that make it difficult to separate the effects of experimental treatments from preexisting background infection. Here we present a method to mass produce large quantities of virus particles along with a high throughput bioassay to test viral infection and effects. Necessitated by the current lack of a continuous, virus-free honey bee cell line, viral particles are amplified in vivo using honey bee pupae, which are extracted from the hive in large volumes using minimally stressful methodology. These virus particles can then be used in honey bee cage bioassays to test inocula viability, as well as various other virus infection dynamics, including interactions with nutrition, pesticides, and other pathogens. A major advantage of using such particles is that it greatly reduces the chances of introducing unknown variables in subsequent experimentation when compared to current alternatives, such as infection via infected bee hemolymph or homogenate, though care should still be taken when sourcing the bees, to minimize background virus contamination. The cage assays are not a substitute for large-scale, field-realistic experiments testing virus infection effects at a colony level, but instead function as a method to establish baseline viral responses that, in combination with the semi-pure virus particles, can serve as important tools to examine various dimensions of honey bee-virus physiological interactions.

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Here we describe two protocols: first to propagate, extract, purify, and quantify large quantities of honey bee non-enveloped virus particles, including a method for removing honey bee pupae and second to test the effects of viral infection using a highly repeatable, high-throughput cage bioassay.

꿀벌의 구강 감염을위한 바이러스 풍부 접종물 준비 (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

꿀벌 여왕을 짝짓기하는 농약적 위험 평가

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...