저자 감사 실험실 박사 카 메 론 커리, 크리스텔 Guédot, 테리 Griswold, 마이클 Branstetter,에 대 한 3 명의 익명 검토자에 몰리 Bidwell, 디스 네 스 빗 및 Osmia 중첩 갈 대를 제공 하기 위한 팀 Krogh, Kimball 클락 원고를 개선 하는 그들의 유용한 의견. 이 작품은 미국 농 무부 농업 연구 서비스 충당 자금 (현재 연구 정보 시스템 #3655-21220-001), 위스콘신 농업의, 무역 및 소비자 보호 (#197199), 국립 과학 재단 (에 의해 지원 되었다 부여 번호 DEB-1442148), 미상 그레이트 호수 Bioenergy 연구 센터 (과학 BER 드-FC02-07ER64494의 암컷 사무실).

1. 살 균 제 노출 실험을 위한 Propiconazole 솔루션 준비
<ol><li>실험의 하루 살 균 물에 상업적으로 구입한 propiconazole 14.3%의 적절 한 볼륨을 용 해 하 여 균 솔루션 x 0.1을 준비 합니다. 모든 치료에 대 한 유일한 갓된 균 솔루션 사용은 확인 합니다.</li>
	<li>꿀벌 수집 꽃가루24 (0.361 PPM 또는 꽃가루의 활성 성분 g-1 의 µ g)에서 이전에 보고 된 propiconazole의 최대 농도를 꽃가루의 그램 당 균 솔루션 x 0.1의 23 µ L를 추가 합니다.</li>
</ol>2. 계란과 호스트 Osmia 갈 대에서 꽃가루 규정을 수확
<ol><li>멸 균된 메스를 사용 하 여, 갓 갈 대 Osmia의 중첩, 개별 실 노출 리드의 길이 따라 두 부분으로 분할 연결 해 부. 참고: 각 둥지는 8 ~ 14 챔버와 챔버 내에서 단일 계란 사이 포함할 수 있습니다.</li>
	<li>이전에 게시 지침77에 따라 남성 계란을 포함 하는 실을 식별 하는 시각적으로 갈 대를 검사 합니다. 중첩 리드에서 관련된 달걀 함께 각 꽃가루 규정을 제거 하 고 깨끗 한 장소 소독된 구부러진된 바늘을 사용 하 여 보트 무게.</li>
	<li>부드럽게 깨끗 한 벌금 페인트 브러시를 사용 하 여 제공에서 계란을 분리 하 고 꽃가루 조항의 신선한 무게 기록 표준 실험실 균형을 사용 하 여 계란. 남성 꽃가루 규정의 평균 중량을 계산 합니다.</li>
	<li>초과 온도 탈수에 노출에서 계란에 손상의 기회를 줄이기 위해 최소 지연으로 다음 단계를 수행 합니다.</li>
</ol>3. 준비 호스트 식물 꽃가루 규정
<ol><li>없는 기생충 현재78되도록 중첩 챔버에서 발굴 임산부 수집된 호스트-식물 꽃가루를 않았는지 살펴보십시오. 어떤 잠재적인 모성 편견을 줄이기 위해 멸 균 페 트리 접시에 단일 대량으로 꽃가루 규정을 결합 하 고 멸 균된 바늘을 사용 하 여 잘 혼합 합니다.</li>
	<li>새로운 꽃가루 규정, 각 재구성의 무게는 자연스럽 게 할당 된 남성 규정의 평균 무게에 거의 같은 보장에 결합 된 질량을 분할 (의미 ± SE, 0.35 ± 0.01 g, N = 42). 참고: 때문에 Osmia sp. 작은 꽃가루 규정 남성 자손, 여성77에 비해 남성 애벌레의 낮은 몸 무게에이 결과에 할당 합니다. 어떤에 게 섹스의 차이점에서 발생 하는 이러한 바이어스를 방지 하려면 실험에서 남성 계란만 사용 합니다.</li>
</ol>4. 비 호스트 식물 꽃가루 제공 준비
<ol><li>표준 실험실 볼 밀을 사용 하 여 정밀한 분말에 상업적으로 구입한 꿀 꿀벌 수집 꽃가루 격파</li>
	<li>임산부 수집 호스트 꽃가루 규정 (~ 20%)의 함량에 따라 달라 집니다, 꽃가루 가루 반죽 같은 일관성을 형성 하기 위하여 철저 하 게 소독 40% 설탕 솔루션79 및 혼합의 적절 한 볼륨을 사용 하 여 하이드 레이트.</li>
	<li>개별 꽃가루 질량으로 분할 자연스럽 게 할당 된 남성 규정의 평균 무게와 같은 무게 약 각. 참고: 규정 30 무작위로 선택 된 남성 챔버80에서 꽃가루 규정의 신선 하 고 건조 중량을 비교 하 여 사전에 표준화 될 수 있다 임산부 수집된 호스트 꽃가루 수 분 콘텐츠입니다. 건조 중량을 얻으려면, 꽃가루 규정 한 lyophilizer에서 동결 해야 (1.5 72 h에 대 한 펜 실바 니 아).</li>
</ol>5. 준비 Multiwell 세포 배양 배지
<ol><li>압력가 주석 컵 (5 × 9 cm)와 살 균 48-잘 문화 판의 개별 웰 스 라인. 꽃가루 조항을 수용할 수 있도록 살 균 겸 부드럽게 캡슐의 위쪽 테두리 밖으로 감각을 사용 합니다.</li>
	<li>호스트 또는 호스트 비 꽃가루의 단일 대량 치료 그룹에 따라 살 균 도구를 사용 하 여 주석 컵 안에 배치 합니다. 참고: 교차 오염을 피하기 위해, 치료 및 제어 그룹에 대 한 별도 접시를 사용 합니다.</li>
</ol>6. Fungicides를 추가
<ol><li>메 마른 나무 막대기를 사용 하 여 꽃가루 질량 내의 중앙 배치 우울증을 확인 합니다. 새로운 막대기를 사용 하 여 각 꽃가루 조항에 대 한.</li>
	<li>우울증에 (치료)에 대 한 살 균 제 솔루션 또는 살 균 물 (컨트롤)에 대 한 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 핀치는 살 균 제 사이의 표면 접촉을 최소화 하기 위해 살 균 집게를 사용 하 여 우울증의 열기 / 살 균 물과 계란.</li>
	<li>실험적인 디자인의 계승 설정 그 일치 해야 도식 표현 (그림 4)에 묘사 된.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig4.jpg"> 그림 4입니다. 실험적인 체제의 도식 대표. 실험을 완전히 넘어 2 × 2 계승 설정을 나타냅니다. 1 살 균 제 노출 나타냅니다 비율과 2 레벨의 구성: (i) 균 (N = 10), 그리고 (ii) 균 (N = 10). 2 꽃가루 소스 나타냅니다 비율과 2 레벨의 구성: (i) 호스트 꽃가루 (N = 8), 그리고 (ii) 비-호스트 꽃가루 (N = 8). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
7. 후방 고 애벌레 관찰
<ol><li>장소 깨끗 한 벌금 페인트 브러시를 사용 하 여 꽃가루 규정의 위쪽 표면에 임의로 선택 된 남성 계란. 일단 계란 모든 규정에 배치 되었습니다, 그리고 라벨 모서리에 테이프와 보호 셀 문화 접시의 뚜껑을 대체.</li>
	<li>깨끗 한 쟁반에 잘 접시를 놓고 직접 빛과의 접촉을 방해 어두운 천으로 커버. 장소 6 잘 플레이트의 건조를 방지 하기 위해 트레이 내의 살 균 물 포함 30 mL. 실 온에서 부 화 쟁반 인큐베이터 안에 그대로 둡니다.</li>
	<li>잘 접시의 뚜껑을 제거 하지 않고 해 현미경 매일 잘 접시를 관찰 합니다. 애벌레는 살아 움직임을 확인 하 여 확인 합니다. 아무 움직임을 감지할 경우 죽은 애벌레와 나머지 꽃가루 규정을 포함 하는 주석 컵 폐기. 모든 살아남은 애벌레 prepupal 단계를 도달할 때까지 그대로 잘 플레이트 내에서 개발 하는 것을 허용 한다.</li>
	<li>Prepupal 단계41에 도달 하면 주석 컵에서 유 충을 제거 합니다. 어떤 청소 브러쉬를 사용 하 여 실크 누에고치에서 똥. 신중 하 게 해 현미경을 사용 하 여 실크 누에고치를 극복 하 고 고무 집게와는 prepupa를 추출 합니다.</li>
	<li>Prepupa 도구 소프트 바디 피어스 하지 할 수 있도록 부드럽게 처리 합니다. Prepupa (prepupal 바이오 매스)의 prepupal 단계 (애벌레 발달 시간)에 계란에서 개발 시간 신선한 무게를 기록 합니다. 참고: 모든 죽은 유 충 시신에 남은 꽃가루 조항 원치 않는 미생물 성장을 방지 하기 위해 즉시 삭제 됩니다 해야 합니다. 이 나머지 건강 한 애벌레를 감염의 위험을 줄여줍니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

그들의 자연적인 중첩 갈 대, 실험실 조건 하에서 외부 꿀벌을 양육 애벌레 피트 니스에 관한 여러 가설의 테스트 수 있습니다. 수 정체 불명된 요인 계속 비 사망 원인, 위험 평가 연구 생체 외에서 사용 하 여 실험 수 잠재적인 위협을 식별 하 고 야생 가루 12의이 종 부유한 그룹에 대 한 관리 사례를 알려 ,38,49,...

곤충 가루1의 지배적인 그룹으로 서의 역할을 감안할 때, 꿀벌 인구에 있는 글로벌 손실 위협이 식량 안보 및 생태계 안정성2,3,,45,6 ,7. 모두와 야생 꿀벌 인구에 있는 감소 추세 있다 서식 지 파편, 신흥 기생충 및 병원 균, 유전적 다양성의 손실 및 침입 종3의 도입을 포함 한 여러 공유 위험 요인에 기인 ,4,7,8,9,10,,1112. 특히, 증가 (예를 들어, neonicotinoids), 농약의 사용은 꿀벌13,,1415간의 해로운 효과에 직접 연결 되었다. 여러 연구 neonicotinoids 사이의 ergosterol 생 합성 억제 (비) 살 균 제 성분 여러 벌 종16,,1718 에서 높은 사망으로 이어질 수 있습니다. , 19 , 20 , 21 , 22. 그럼에도 불구 하 고, 살 균 제, 긴 ' 비 안전 '으로 간주 많은 감시23없이 꽃에서 작물에 살포 될 계속. 채집 자 벌 려 정기적으로 살 균 제 잔류물24,,2526으로 오염 하는 꽃가루 중 문서화 되었습니다. 같은 살 균 제 ladenpollen의 소비 애벌레 꿀벌27,,2829,30및 성인 꿀벌16 중 하위 치명적인 효과의 제품군 중 높은 사망을 일으킬 수 있습니다. , 31 , 32 , 33 , 34. 최근 연구 제안 fungicides 꿀벌 꽃가루 부담 미생물35사이 중요 한 공생을 방해 함으로써 하이브 저장 꽃가루 내 미생물 커뮤니티를 변경 하 여 비 손실을 발생할 수 있습니다.
고독한 꿀벌은 여러 야생 및 농업 식물36,37,의 수 분에 대 한 중요 한38, 가루의이 다양 한 그룹 연구를 모니터링 하는 농약에 훨씬 덜 관심을 받고 있다. 성인 고독한 여성의 둥지 5-10 봉인된 브루 드 챔버, 각 임산부 수집 꽃가루와 꿀, 그리고 단일 계란39의 유한 질량 갖춰져 있습니다. 후에 부 화, 애벌레 할당 된 꽃가루 규정 그리고 적절 한 영양40,41관련된 꽃가루 부담 microbiota에 의존 합니다. 사회 생활의 혜택, 부족 하기 때문에 고독한 꿀벌 농약 노출42에 더 취약 있을 수 있습니다. 예를 들어, 다음 스프레이 사회 꿀벌에 적자 동안 보상 수도를 일부 노동자에 의해 확장 하 고 새로 가만히 신흥, 단일 성인 고독한 여자의 죽음 끝 모든 생식 활동43. 민감성에 이러한 차이 ecotoxicological 연구와 야생 꿀벌 모두에 대 한 적절 한 보호를 보장 하기 위해 다양 한 비 taxa를 통합할 필요가 강조 표시 합니다. 그러나, 연구의 한 줌, 외 균 노출의 효과에 대 한 조사는 주로에 초점을 맞춘 사회적 꿀벌18,23,32,44,45 ,,4647,,4849.
고독한 꿀벌 속 Osmia (그림 1)에 속하는 몇 가지 중요 한 과일 및 견과 작물39,50,,5153, 의 효율적인 가루로 사용 되었습니다. 53. 다른 관리 pollinator 그룹24,54,,5556,,5758성인 Osmia 꿀벌은 정기적으로 44-꽃 작물 살포 하는 균에 노출. 최근 스프레이 작물에 식량 약탈을 배워 성인 여성 수집 하 고 재고 나중 발전 애벌레에 대 한 유일한 다이어트를 형성 하는 균 라덴 꽃가루와 그들의 브루 드 실 수 있습니다. 오염된 꽃가루 규정 사용 후 살 균 제 잔류물42애벌레를 노출할 수 있습니다. 노출의 위험 몇 가지 밀접 하 게 관련된 호스트 식물59,,6061에 사료 oligolectic 종 가운데 더 높은 수 있습니다. 예를 들어 특정 megachilid 꿀벌 우선적으로 기생62를 줄이는 수단으로 고품질 국화과 꽃가루에 대 한 마 초 나타납니다. 그러나,는 균 중 oligolectic 고독한 꿀벌 애벌레 피트 니스 영향 정도 하지 되었습니다 실험적으로 측정할. 이 연구의 목표 주요 테스트 프로토콜을 개발 하는 것 이며 생체 외에서 의 피트 니스에 살 균 제 노출 및 꽃가루 소스의 대화형 효과 reared 고독한 꿀벌. 조사, O. ribifloris sensu lato (s.l.)의 계란 얻어질 수 있다 상업적으로 (자료 테이블). 이 인구는 네이티브 pollinator는 지역53,63,64 내 과즙이 풍부한 Mahonia aquifolium (오 레 곤 포도)에 대 한 그것의 강한 취향이로 그것의 중요성 때문에 이상적인 (그림 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig1.jpg"> 그림 1입니다. 성인 Osmia ribifloris의 고해상도 사진. 사진 박사 짐 지팡이, 연구 곤충학자, 미국 농 무부-ARS 신용 <a href="/files/ftp_upload/57876/Figure_1.pdf" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig2.jpg"> 그림 2입니다. 중첩 중첩 여성 전경. 에 Osmia ribifloris (s.l.) 의 갈 대 Phragmite 챔버 파티션 및 갈 대에 대 한 터미널 플러그 masticated 잎에서 건설 한다. 사진 제공 씨 킴 볼 클락, NativeBees.com <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 연구의 첫 번째 목적은 애벌레 피트 니스 (개발 시간 및 prepupal 생물 측정)에 살 균 제 처리 꽃가루를 사용의 효과 평가 하는 것입니다. 일반적인 적용된 살 균 제 propiconazole에 노출은 여러 종 23,,2432,44,45, 전체 성인 꿀벌 중 사망률 증가에 연결 되었다 하는 동안 은 54,55,56,,5758,65,66,67, 애벌레 꿀벌에 미치는 영향 알려진. 이 연구의 두 번째 목적은 비 호스트 꽃가루 애벌레 체력에 소모의 효과 평가 하는 것입니다. 이전 연구 oligolectic 꿀벌의 애벌레 아닌 호스트 꽃가루68소비 하도록 개발 실패를 나타냅니다. 이러한 결과 변화 비 생리학69, 꽃가루 생화학70, 그리고 자연 꽃가루 규정71와 관련 된 유익한 미생물에 표시 될 수 있습니다. 이 연구의 세 번째 목적은 애벌레 체력에 균 치료와 식이 꽃가루의 대화형 효과 평가 하는 것입니다.
모성 신체 크기를 포함 하 여 수많은 생물 학적 특성, 속도, 프로비저닝 구하고 전략과 꽃가루 수량72,,7374,75 알려져 있습니다 고독한 꿀벌 중 애벌레 적합성에 영향을 미칠. 이러한 요소는 애벌레 건강을 평가할 때 방어할 수 있는 실험적인 디자인을 개발에 도전 포즈 갈 대 사이 뜻깊은 가변성을 발생할 수 있습니다. 또한, 애벌레의 개발 된 중첩 갈 대 내부에서 발생, 그 자손에 이러한 가변성의 효과 시각화 하기가 어렵습니다과 계량 없이 치명적이 지 않은 기법 (그림 3). 이 문제를 해결 하려면 모든 가설이이 연구에서 그들의 중첩 갈 대 외부 reared 애벌레를 사용 하 여 테스트 합니다. 실험 설계는 완전히 교차 2 × 2 계승 설정, 각 인자 2 수준; 구성 된 대표 요인 1: 살 균 제 노출 (살 균 제; 아니 살 균 제); 팩터 2: 꽃가루 소스 (호스트 꽃가루, 비-호스트 꽃가루). 꿀벌 계란에서 통제 된 실험실 조건에서 살 균 multiwell 세포 배양 배지 내에서 prepupal 단계를 발생 합니다. 각 잘는 개별적으로 각종 꽃가루 제공 및 단일 계란 표준화 된 양의 있습니다. 해칭, 후 유 충 우물 내에서 할당 된 꽃가루에 피드를 애벌레의 개발을 완료 고 pupation 시작. 과거의 연구 원인 불명된 사망은 야생49,76에서 발생 보다이 인공 양육 환경 내에서 발생 하는 꿀벌 가운데 낮은 나타났습니다. 생체 외에서의 사용-reared 꿀벌 필드 기반 연구를 통해 몇 가지 이점이 있다: 1) 그것은 자연적인 가변성 및 필드 기반 연구;와 일반적으로 관련 된 통제 요인의 혼동 영향을 최소화 2) 그것은 조작 각 factor(s)에 대 한 관심을 동시에 치료 그룹; 테스트의 여러 레벨을 허용 한다 3) 복제의 수를 미리 결정 된, 수 및 각 복제에 대 한 실험적인 요소를 개별적으로 조작할 수 있습니다. 4) 애벌레 응답 변수를 쉽게 시각화 하 고 방해 인접 한 애벌레; 없이 독립적으로 기록 된 수 있다 5) 프로토콜 여러 요인과 반응 변수 관련 된 더 복잡 한 실험 설계에 맞게 수정할 수 있습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig3.jpg"> 그림 3입니다. 자연 중첩 리드의 내용을 Osmia ribifloris (s.l.). (A) 개별 챔버, 꽃가루 규정 및 파티션, 및 (B)를 갓 보여주는 해 부 리드 수확 꽃가루 규정과 관련 된 계란 (검은 원 표시) 닫습니다. <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kaysville, Davis County, Utah, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmia reeds</td>
			<td>Nativebees.com</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freshly plugged reeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection set</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89259-964</td>
			<td>Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long Nose Pliers</td>
			<td>Husky</td>
			<td>1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-892</td>
			<td>Sterile sealed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-898</td>
			<td>Sterile sealed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373100</td>
			<td>Sterile sealed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Weighing Boats</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10770-448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camel Hair Brush</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1153A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin capsules</td>
			<td>EA Consumables</td>
			<td>D1021</td>
			<td>Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propiconazole 14.3</td>
			<td>Quali-Ppro</td>
			<td>60207-90-1</td>
			<td>Propiconazole 14.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Honey bee pollen</td>
			<td>Bee energised</td>
			<td>897098001244</td>
			<td>Untreated, natural, raw pollen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulverisette</td>
			<td>LAB SYNERGY INC.</td>
			<td>30334913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden sticks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470146908</td>
			<td>Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097-912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89403-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planting tray</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470150-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1158-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-07940-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tweezer</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0135HWPN4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze drier</td>
			<td>Labcono</td>
			<td>LFZ-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>SPSS</td>
			<td>Version 21.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro rearing of solitary bees: a tool for assessing larval risk factors

고독한 꿀벌 와일드 하 고 관리 되는 작물에 대 한 중요 일 분의 서비스를 제공 하는 있지만이 종 부유한 그룹 크게 간과 되어 농약 규제 연구. 살 균 제 잔류물에 노출의 모험 경우 스프레이 또는 호스트 식물 근처에, 꿀벌은 그들의 둥지를 구축 하는 꽃가루를 수집 하는 동안 특히 높을 것입니다. 꽃가루 식물 (oligolecty)의 선택 그룹에서 사용 하는 Osmia 의 종, 비 호스트 식물에서 꽃가루를 사용 하는 무 능력 살 균 제 관련 독성에 대 한 그들의 위험 요소를 높일 수 있습니다. 이 원고는 성공적으로 oligolectic 메이슨 꿀벌, 표준화 된 실험실 조건에서 세포 배양 배지 내에서 prepupal 단계를 달걀에서 Osmia ribifloris sensu lato 후면에 사용 되는 프로토콜을 설명 합니다. 생체 외에서-reared 꿀벌 이후 벌 체력에 살 균 제 노출 및 꽃가루 소스의 효과 조사 하기 위해 사용 됩니다. 2 × 2 완전히 넘어 계승 디자인에 따라 실험 prepupal 바이오 매스, 애벌레 발달 시간 및 survivorship 계량 애벌레 피트 니스에 살 균 제 노출 및 꽃가루 근원의 주요 및 대화형 효과 검사 합니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 외에서사용 하 여-reared 꿀벌 자연 배경 가변성을 감소 시킨다 고 여러 실험적인 매개 변수의 동시 조작 있습니다. 설명된 프로토콜 가설 꿀벌 건강에 영향을 미치는 요인의 제품군과 관련 된 테스트에 대 한 다양 한 도구를 제공 합니다. 중요 한, 지속적인 성공을 충족 되어야 보존 노력에 대 한 꿀벌 감소를 촉진 하는 생리와 환경 요인의 복잡 한 상호 작용으로 이러한 통찰력 중요할 증명할 것 이다.

애벌레 피트 니스 3 통계 (i) 애벌레 발달 시간, (ii) prepupal 바이오 매스, 그리고 (iii) %survivorship 사용 하 여 정량 했다. 양방향 ANOVA 균 노출을 사용 하 여 실시 되었다 (2 레벨: 아니 살 균 제, 살 균 제) 및 꽃가루 소스 (2 레벨: 호스트 꽃가루, 비-호스트 꽃가루) 독립 변수와 종속 변수 애벌레 발달 시간으로. 살 균 제 노출에 대 한 주요 효과 (F1,28 = 1.24, P = 0...

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In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

생체 외에서 고독한 꿀벌의 양육: 애벌레 위험 요소를 평가 하기 위한 도구

꽃 식물에 균 스프레이 고독한 꿀벌 꽃가루 부담 균 잔류물의 높은 농도에 노출 될 수 있습니다. 실험실 기반 실험 체 외에관련 된을 사용 하 여-reared 꿀벌 애벌레,이 연구 균 처리 꽃가루 호스트와 호스트 비 식물에서 파생 된 소모의 대화형 효과 조사.

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

in-vitro-rearing-solitary-bees-tool-for-assessing-larval-risk

Research

JoVE Journal

Environment

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

8.1K 조회수.  University of Wisconsin-Madison. 꽃 식물에 균 스프레이 고독한 꿀벌 꽃가루 부담 균 잔류물의 높은 농도에 노출 될 수 있습니다. 실험실 기반 실험 체 외에관련 된을 사용 하 여-reared 꿀벌 애벌레,이 연구 균 처리 꽃가루 호스트와 호스트 비 식물에서 파생 된 소모의 대화형 효과 조사.

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A Push-pull Protocol to Reduce Colonization of Bird Nest Boxes by Honey Bees

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. These bees select cavities that are suitable nest sites for birds, resulting in competition. The difficulty of removing bees and their defensive behavior makes a prevention protocol necessary. Here, we describe a push-pull integrated pest management protocol to deter bees from inhabiting bird boxes by applying a bird safe insecticide, permethrin, to repel bees from nest boxes, while simultaneously attracting them to pheromone-baited swarm traps. Shown here is an example experiment using Barn Owl nest boxes. This protocol successfully reduced colonization of Barn Owl nest boxes by Africanized honey bees. This protocol is flexible, allowing adjustments to accommodate a wide range of bird species and habitats. This protocol could benefit conservation efforts where AHB are located.

Preventing colonization of bird nest boxes by invasive Africanized honey bees is important for conservation efforts of nest-site limited birds. We provide an integrated pest management approach to &#34;push&#34; bees away from nest boxes with a repellant insecticide, permethrin, and &#34;pull&#34; them toward pheromone baited swarm traps.

푸시 풀 프로토콜 꿀 꿀벌에 의해 식민 새의 둥지 상자를 감소시키는

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. ...

연구

환경과학

Reliable Method for Assessing Seed Germination, Dormancy, and Mortality under Field Conditions

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester fabric and glue can be folded and glued to construct a strip of compartments that house seeds and identifying information, while allowing contact with soil leachate, water, microorganisms, and ambient temperature. Strips may be constructed with a wide range of compartment numbers and sizes and allow the researcher to house a variety of genotypes within a single species, different species, or seeds that have experienced different treatments. As opposed to individual seed packets, strips are more easily retrieved as a unit. While replicate packets can be included within a strip, different strips can act as blocks or can be retrieved at different times for observation of seed behavior over time. We used a high temperature glue gun to delineate compartments and sealed the strips once the seed and tags identifying block and removal times were inserted. The seed strips were then buried in the field at the desired depth, with the location marked for later removal. Burrowing animal predators were effectively excluded by use of a covering of metal mesh hardware cloth on the soil surface. After the selected time interval for burial, strips were dug up and seeds were assessed for germination, dormancy and mortality. While clearly dead seeds can often be distinguished from ungerminated living ones by eye, dormant seeds were conclusively identified using a standard Tetrazolium chloride colorimetric test for seed viability.

Here we present a protocol for assessing seed survivorship, germination and dormancy under field conditions using buried, labeled seed strips and tetrazolium chloride (TZ) viability testing.

이 필드 조건에서 종자 발아, 휴면 및 사망률을 평가하기위한 신뢰할 수있는 방법

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been hindered partly due to a lack of standardized methods and availability of robust, user-friendly technology. In this study, commercially available, division-arrested cell lines were employed to quantitatively screen for endocrine activity of chemicals present in water samples of interest to environmental quality professionals. A single, standardized protocol that included comprehensive quality assurance/quality control (QA/QC) checks was developed for Estrogen and Glucocorticoid Receptor activity (ER and GR, respectively) using a cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Samples of treated municipal wastewater effluent and surface water from freshwater systems in California (USA), were extracted using solid phase extraction and analyzed for endocrine activity using the standardized protocol. Background and dose-response for endpoint-specific reference chemicals met QA/QC guidelines deemed necessary for reliable measurement. The bioassay screening response for surface water samples was largely not detectable. In contrast, effluent samples from secondary treatment plants had the highest measurable activity, with estimated bioassay equivalent concentrations (BEQs) up to 392 ng dexamethasone/L for GR and 17 ng 17&#946;-estradiol/L for ER. The bioassay response for a tertiary effluent sample was lower than that measured for secondary effluents, indicating a lower residual of endocrine active chemicals after advanced treatment. This protocol showed that in vitro transactivation bioassays that utilize commercially available, division-arrested cell &#34;kits&#34;, can be adapted to screen for endocrine activity in water.

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

물 사용에 내분비 활동에 대한 선별 시판<em&gt; 체외</em&gt; 전이 활성화 생물학적 정량

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

Video Tracking Protocol to Screen Deterrent Chemistries for Honey Bees

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey bee colony numbers have been declining in the United States and many European countries since 1947. A number of factors play a role in this decline, including the unintentional exposure of honey bees to pesticides. The development of new methods and regulations are warranted to reduce pesticide exposures to these pollinators. One approach is the use of repellent chemistries that deter honey bees from a recently pesticide-treated crop. Here, we describe a protocol to discern the deterrence of honey bees exposed to select repellent chemistries. Honey bee foragers are collected and starved overnight in an incubator 15 h prior to testing. Individual honey bees are placed into Petri dishes that have either a sugar-agarose cube (control treatment) or sugar-agarose-compound cube (repellent treatment) placed into the middle of the dish. The Petri dish serves as the arena that is placed under a camera in a light box to record the honey bee locomotor activities using video tracking software. A total of 8 control and 8 repellent treatments were analyzed for a 10 min period with each treatment was duplicated with new honey bees. Here, we demonstrate that honey bees are deterred from the sugar-agarose cubes with a compound treatment whereas honey bees are attracted to the sugar-agarose cubes without an added compound.

The loss of honey bee colonies presents a challenge to crop pollination services. Current pollinator protection practices warrant an alternative approach to minimize the contact of honey bees to harmful pesticides using repellent chemistries. Here, we provide detailed methods for a visual tracking protocol to screen deterrents for bees.

꿀벌을위한 억제 성 화학 물질을 차단하는 비디오 추적 프로토콜

The European honey bee, Apis mellifera L., is an economically and agriculturally important pollinator that generates billions of dollars annually. Honey ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as redox potential (Eh) and pH, but also to microbial activities that can play a direct or indirect role on speciation and/or mobility. Indeed, some bacteria can directly oxidize As(III) to As(V) or reduce As(V) to As(III). Likewise, bacteria are strongly involved in Hg cycling, either through its methylation, forming the neurotoxin monomethyl mercury, or through its reduction to elemental Hg&#176;. The fates of both As and Hg are also strongly linked to soil or aquifer composition; indeed, As and Hg can bind to organic compounds or (oxy)hydroxides, which will influence their mobility. In turn, bacterial activities such as iron (oxy)hydroxide reduction or organic matter mineralization can indirectly influence As and Hg sequestration. The presence of sulfate/sulfide can also strongly impact these particular elements through the formation of complexes such as thio-arsenates with As or metacinnabar with Hg.
Consequently, many important questions have been raised on the fate and speciation of As and Hg in the environment and how to limit their toxicity. However, due to their reactivity towards aquifer components, it is difficult to clearly dissociate the biogeochemical processes that occur and their different impacts on the fate of these TE.
To do so, we developed an original, experimental, column setup that mimics an aquifer with As- or Hg-iron-oxide rich areas versus iron depleted areas, enabling a better understanding of TE biogeochemistry in anoxic conditions. The following protocol gives step by step instructions for the column set-up either for As or Hg, as well as an example with As under iron and sulfate reducing conditions.

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Fate and speciation of arsenic and mercury in aquifers are closely related to physio-chemical conditions and microbial activity. Here, we present an original experimental column setup that mimics an aquifer and enables a better understanding of trace element biogeochemistry in anoxic conditions. Two examples are presented, combining geochemical and microbiological approaches.

(옥 시) 철 수 산화물, 성분, 및 박테리아 혐 기성 생물 지구 화학적 상호 작용을 공부에 대 한 실험 열 설정

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Rearing and Long-Term Maintenance of Eristalis tenax Hoverflies for Research Studies

With an estimated 6000 species worldwide, hoverflies are ecologically important as alternative pollinators to domesticated honeybees. However, they are also a useful scientific model to study motion vision and flight dynamics in a controlled laboratory setting. As the larvae develop in organically polluted water, they are useful models for investigating investment in microbial immunity. While large scale commercial breeding for agriculture already occurs, there are no standardized protocols for maintaining captive populations for scientific studies. This is important as commercial captive breeding programs focusing on mass output during peak pollination periods may fail to provide a population that is consistent, stable and robust throughout the year, as is often needed for other research purposes. Therefore, a method to establish, maintain and refresh a captive research population is required. Here, we describe the utilization of an artificial hibernation cycle, in addition to the nutritional and housing requirements, for long term maintenance of Eristalis tenax. Using these methods, we have significantly increased the health and longevity of captive populations of E. tenax compared to previous reports. We furthermore discuss small scale rearing methods and options for optimizing yields and manipulating population demographics.

Rearing and Long-Term Maintenance of Eristalis tenax Hoverflies for Research Studies

The overall goal of these procedures is to establish, maintain and refresh a captive population of Eristalis tenax in a research setting.

양육 및 조사 연구에 대 한 Eristalis tenax Hoverflies의 유지 보수 장기

With an estimated 6000 species worldwide, hoverflies are ecologically important as alternative pollinators to domesticated honeybees. However, they are ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

유연한 저비용 수경 시스템 살 균 조건에서 작은 분자에 식물 응답을 평가 하기 위한

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

애벌레에서 행동 응답 프로필을 조사 하기 위한 실험 프로토콜: 신경 흥분 제 카페인에 응용

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

단풍 나무의 미 립 자 물질 제거 능력 평가

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) in vitro exposure systems are often large and bulky, making transport to the field and operation at the source of emission or within the breathing zone difficult. Through miniaturization of these systems, the lab can be brought to the field, expediting processing time and providing a more appropriate exposure method that does not alter the aerosol prior to contacting the cells. The Portable In vitro Exposure Cassette (PIVEC) adapts a 37 mm filter cassette to allow for in vitro toxicity testing outside of a traditional laboratory setting. The PIVEC was characterized using three sizes of copper nanoparticles to determine deposition efficiency based on gravimetric and particle number concentration analysis. Initial cytotoxicity experiments were performed with exposed lung cells to determine the ability of the system to deposit particles while maintaining cell viability. The PIVEC provides a similar or increased deposition efficiency when comparing to available perpendicular flow in vitro exposure devices. Despite the lower sample throughput, the small size gives some advantages to the current in vitro ALI exposure systems. These include the ability to be worn for personal monitoring, mobility from the laboratory to the source of emission, and the option to set-up multiple systems for spatial resolution while maintaining a lower user cost. The PIVEC is a system capable of collecting aerosols in the field and within the breathing zone onto an air-interfaced, in vitro model.

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Here, we present a protocol to perform portable cellular aerosol exposures and measure cellular response. The method uses cells, grown at the air-liquid interface, mimicking in vivo physiology. Cellular response to copper nanoparticle aerosols was observed as oxidative stress through reactive oxygen species generation and cytotoxicity as lactate dehydrogenase release.

새로운 휴대용 체 외에 노출 카세트 졸 샘플링에 대 한

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...