Name: quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay at JoVE.com

この作品は、アメリカの心臓協会 [HL を費 0365274B] によって支えられた国立がん研究所 [Z.W. に GI 胞子 P50CA150964] 国立衛生研究 [オフィスの研究インフラ共有計装グラント S10RR031845 にケース ウエスタン リザーブ大学の施設をイメージング、光学顕微鏡 】、【 名大 】 を中国奨学金理事会。 著者は彼の助けの光顕微鏡イメージング コア スライドのスキャニングとリチャード ・ リーをありがとうございます。

すべての実験では、マウスを含むここに記載は、ケース ウエスタン リザーブ大学機関動物のケアおよび使用委員会によって承認されています。2016-0068 プロトコルのタイトル (PI: 華楼) は、「代替の Pre-mrna スプライシング脊椎動物の発生での役割」.
注意: 装置、試薬およびこのプロトコルで使用される供給のすべての情報は、テーブルの材料に含まれます。
1. ホルマリン固定パラフィン埋め込まれたセクション (FFPE)
<ol><li>
頚部転位によって 1 の CD1 のマウスと 1 c57bl/6 j マウスを安楽死させます。慎重にカット オープン外科はさみ鉗子とスカル。スコップで脳を削除します。 注: 1 歳 5 か月 CD1 雄マウス 3 ヶ c57bl/6 j マウス使用し、同様の結果を示した。<ol>
<li>PBS で脳を洗います。ホルマリン溶液 50 mL に脳全体を置くことによって常温 (RT) 10% ホルマリンを含む溶液で 30 h の脳全体を固定します。</li>
		<li>定着液を PBS に変更し、4 ° C で一晩 PBS で脳を孵化させなさい脱水、キシレンやパラフィン標準手順18を使用して脳を埋め込みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ミクロトームを使用して、5 μ m のセクションに埋め込まれた組織をカットします。最初のそして、リボンを広めるため 45 ° C の水浴中 RT の水浴のパラフィン リボンを置きます。
	<ol>
<li>しわや折り目にリボンが消えて、すぐにスライド ガラスのセクションをマウントします。使用する前に 60 ° C で 1 時間焼く RT。 スライドで一晩乾燥スライドを空気します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 試料の前処理
<ol><li>
組織切片を deparaffinize します。発煙のフードで次の手順を実行します。
	<ol>
<li>新鮮なキシレン、250 ml の 100% エタノールの 2 つの 250 の mL で 2 皿洗い (図 1 a) を入力します。次の表 1に示されている順序とインキュベーション時間皿洗いの洗濯ラック洗濯ラック (図 1 a)、場所に組織スライドを挿入します。</li>
		<li>各孵卵中リフト洗濯ラックを上下 3 回以上洗濯皿に。各インキュベーション後すぐに組織切片の乾燥を防ぐために次の洗濯料理に洗濯ラックを移動します。</li>
		<li>インキュベーションの手順を完了した後洗浄皿からスライド洗濯ラックを削除します。スライドが完全に乾くまで、5 分または 60 ° C のインキュベーターでラックを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>疎水性障壁ペンでティッシュ セクションを囲む 0.75 'x 0.75' 障壁を描画します。空気乾燥室温 3 分のための障壁</li>
	<li>
スライスを前処理します。
	<ol>
<li>試薬と機器を準備します。<ol>
<li>ハイブリダイゼーション オーブン (図 1 b) をオンにし、温度を 40 ° C 使用前に 30 分に設定します。</li>
			<li>蒸留水と加湿の紙 (図 1E) を完全に濡れているし、湿度コントロール トレイ (図 1、左)。ハイブリダイゼーション オーブンで湿度コントロール トレイをおいてください。</li>
			<li>10 x ターゲット検索試薬の 70 mL に dH2O の 630 mL を追加して新鮮な 1 x ターゲット検索試薬の 700 mL を準備します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>過酸化水素を適用します。<ol>
<li>Deparaffinized のスライドをベンチに置きます。組織を完全にカバーするセクションに過酸化水素 5-8 滴を追加します。室温 10 分間インキュベートします。</li>
			<li>過酸化水素のソリューションは、一度に 1 つのスライドを削除する吸収紙の上のスライドをタップします。すぐに洗濯ラックにスライドを挿入して dH2o. でいっぱい洗濯料理にラックを移動</li>
			<li>用蒸留水でラックを上下に移動することによって、スライドを洗って 3-5 回。新鮮な水と洗浄スライド 1 つより多くの時間をいっぱい洗濯料理に洗濯ラックを移動します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ターゲットの検索を実行します。<ol>
<li>ホット プレートに 1,000 mL ガラス製ビーカーを置きます。ビーカーに新鮮な 1 x ターゲット検索試薬の 700 mL を追加し、箔でカバーします。フォイル カバー (図 1) をビーカーに温度計を挿入します。ホット プレートをオンにし、10-15 分のために高い設定します。</li>
			<li>検索試薬の温度 98 ° C に達すると、穏やかな沸騰を維持するために低高からホット プレートの温度制御を切り替えます。15 分以上沸騰していません。</li>
			<li>一方、慎重に箔を開くし、検索リージェント内のスライスを洗濯ラックを置きます。ビーカーを再びふたをして 15 分間インキュベートします。</li>
			<li>DH2O および 15 のリンス 200 mL でいっぱい洗濯料理にビーカーからラックを削除する使用鉗子 s。</li>
			<li>100% 新鮮なエタノールを含んでいる洗浄皿にラックを移動し、3 分のスライドを削除し、10 分の 60 ° C の定温器に乾燥するために座らせてください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>プロテアーゼ III を適用します。<ol>
<li>染色ラック (図 1右) にスライドを配置します。組織を被覆するプロテアーゼ III の 5 滴を追加します。慎重に湿度コントロール トレイ (図 1、左) でラックを置くし、40 ° C ハイブリダイゼーション オーブン トレイに挿入します。30 分間インキュベートします。</li>
			<li>スライド ラックを取り外し、トレイにオーブンに戻します。余分な液体は、一度に 1 つのスライドを削除するスライドをタップします。洗濯ラックにスライドを挿入、洗浄皿のラックの場所に満ちて dH2O. 移動ラックを上下のスライドを洗うが 3-5 回。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. っぽいアッセイ
<ol><li>
材料を準備します。
	<ol>
<li>あらかじめ 20 分ミックス 2.94 L dH2O および 50 の 60 mL の洗浄バッファー洗浄バッファー x 1 x 40 の ° C の定温器の洗浄バッファー x 50 を温めます。</li>
		<li>100 mL コンテナーでも dH21 N 水酸化アンモニウムの 1.43 mL を 250 mL の dH2o ・ ミックスに追加することによって O. 準備 0.02% (w/v) アンモニア水 100 mL にギルのヘマトキシリンを追加することによって 50% ヘマトキシリン染色液を準備します。</li>
		<li>プローブを入れて、アンプ 0-6 RT 30 分使用前に試薬。40 ° C ハイブリダイゼーション オーブンで湿度コントロール トレイをおいてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
っぽいの手順 注: アイソ フォーム選択的スプライシングNf1の式を調べて、エクソン 23 a、エクソン 23 a 付属のアイソ フォームを対象とする 3 つの異なるっぽいプローブの値を (PSI) 融着接続パーセントを計算するには、エクソン 23a 除外アイソ フォームまたは両方のアイソ フォームは、使用される (図 2).プローブは、隣接してカットするティッシュ セクションで使用されます。計算の正確さを保つ 3 つの切片が扱われることが重要です交配、増幅および信号の検出手順で同じ。<ol>
<li>プローブの交配。<ol>
<li>洗濯ラックからスライドを削除し、スライドから余分な液体をタップします。染色ラックにスライドを配置します。</li>
			<li>プローブ名とスライドのラベルに鉛筆を使用します。一緒に 3 つの異なる Nf1 のプローブ (図 2) と交配させるための 3 つの隣接してカット脳組織スライドを置きます。スライドの同じ順序の以降の手順を実行します。</li>
			<li>組織を被覆するプローブの 4 滴を追加します。セクションが乾くを防ぐために同時にこの 1 つのスライドを行います。湿度コントロール トレイに染色ラックを置き、2 h の 40 ° C のオーブンにそれを挿入します。</li>
			<li>スライドを洗浄バッファーで 2 回洗浄します。各洗浄のための洗浄バッファー × 1 200 mL で染色の皿を満たしし、洗濯ラックを配置します。同時に紙タオル 1 枚のスライドに余分な液体をタップし、洗濯ラックにすばやく挿入します。スライド ラックを上下に移動するための皿で 3 ~ 5 回右で 2 分間</li>
			<li>2 番目の洗浄では、新鮮な洗浄バッファーを使用します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>信号増幅。<ol>
<li>スライドから過剰な洗浄バッファーをタップし、染色ラック内に配置します。組織を被覆する AMP 0 の 4 滴を追加します。湿度コントロール トレイの汚れのラックを置き、40 ° C で 30 分間オーブンで挿入</li>
			<li>スライドを上記のように洗浄液で 2 回洗浄します。</li>
			<li>1-6 次の順序、表 2の条件のアンプでこの手順を繰り返します。交配の各ステップ後 2 回スライドを洗ってください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>信号検出<ol>
<li>スライドから過剰な洗浄バッファーをタップし、染色ラック内に配置します。高速赤 120 μ L を高速赤 B の 2 μ L を追加微量遠心チューブに (1: 60 の比)。よく混ぜるし、ティッシュ セクションを完全にカバーするために追加。 注: 赤い A の容量/B のミックスは、数とティッシュ セクションのサイズに基づいて。0.75 'x 0.75' 領域、120 μ L は、1 つのセクションに十分です。5 分以内でミックスを使用し、ミックスの直射日光や紫外線への暴露を避けます。</li>
			<li>トレイを閉じますと廃棄物コンテナーにソリューション ルート削除で 10 分間インキュベートすぐに洗濯ラックにスライドを挿入して水道水で満たされた洗浄皿にラックを置きます。新鮮な水道水でもう一度すすぎます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スライドの counterstaining
	<ol>
<li>洗濯ラックを水道水から外し、余分な水分を除去する吸収紙の上をすばやくタップします。50% ヘマトキシリン染色液にラックを置くし、すぐに数回上下ラックを移動します。室温 2 分間インキュベートします。</li>
		<li>水道水皿にスライド ラックを転送します。ラックを上下に移動、スライドが明確な脳組織が紫のままになるまで、新鮮な水道水を変更する 3-5 回を洗います。</li>
		<li>0.02% アンモニア水を含んでいる皿にラックを移動します。ラック上下に 2-3 回まで移動組織が青色に変わります。染色皿に新鮮な水道水で 3 ~ 5 回スライドを洗います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サンプルの実装
	<ol>
<li>60 の ° C の定温器に染色の皿からスライド ラックを移動し、スライドが完全に乾燥するまで、少なくとも 15 分間インキュベートします。</li>
		<li>スライド上で、慎重に媒体をマウントの場所 40 μ L 組織切片上 24 ミリメートル x 50 mm の coverslip に置きます。室温 30 分間空気乾燥スライド</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. データの収集と分析
注: は、40 倍の倍率で画像をスキャンするのにスライド スキャナーを使用します。
<ol><li>
正と負のコントロール
	<ol>
<li>各実験の正と負のコントロール (図 3) が含まれます。良い肯定的な制御として信号が 20-40 倍の倍率で点状のドットとして表示されます。</li>
		<li>肯定的な制御として - PPIB - 1 zz (Mm) にマウスを使用。このプローブは、一般的なハウスキーピング遺伝子 PPIB を対象します。マイナス コントロールの 20 X 顕微鏡フィールドごと染色の背景を表示するすべての 20 のセルに 1 つのドットは、許容。</li>
		<li>ネガティブ コントロールとして DapB 1 zz プローブを使用します。このプローブは、細菌の遺伝子 dapB を対象します。これらのコントロールのプローブは、多くっぽい試金19で使用されています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
信号検出およびNf1エクソン 23 a の発現パターンの解析
	<ol>
<li>交配のシグナルに点状のドットとして表示されて、手動でドットを数えます。ドットの数が特定のプローブによって検出された成績証明書のレベルと相関しています。ドットの数には、ImageJ または SpotStudio ソフトウェアによって分析できます注意してください。</li>
		<li>3 つのプローブを使用すると、エクソン 23a 含む、エクソン 23a 欠けてアイソ フォーム、または合計nf1 で成績証明書 (図 2) に交配させます。3 つのプローブは、同時に使用することはできません、各プローブに交配させる 3 つの隣接する脳組織切片を使用します。<ol>
<li>エクソン 23 a のスプライス (PSI) のパーセントを計算するには、細胞といくつかの脳領域でドットの数をカウントします。興味の地域ごとの図 4に示すようにいくつかのサブ領域から 400 以上のセルを個数します。</li>
			<li>3 つのプローブごとに同じサブ領域からデータを収集します。エクソン 23a 封入プローブを用いた細胞あたりのドットの数として PSI を計算/(エクソン 23a 封入プローブ + プローブをスキップ、exon23a のセルあたりのドットの数でセルあたりのドットの数) x 100%。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Cieply, B., Carstens, R. 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The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806 (2015).</li><li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+splice+variants+in+the+5'UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain:+alternative+5'UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites.">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li><li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+quantification:+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale.">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li><li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms:+characterization,+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain.">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).</li><li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections.">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li><li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome.">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Erben, L., He, M. 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著者が明らかに何もありません。

この通信は、マウスの脳のセクションでの発現パターンを検討する BaseScope RNA っぽいの使用を報告します。そのアンチセンス エクソン エキソン接合プローブ エクソン包含およびしっかりと具体的にアイソ フォームをスキップを標的に 50 のヌクレオチドより短いことを示しています。さらに、結果として得られる信号は代替エクソンの PSI を計算する使用できます。
い?...

代替選択的スプライシング (AS) は、mRNA の成熟過程で発生する一般的なプロセスです。このプロセスで、エクソンは成熟した mRNA の差動含めることできます。したがって、AS を介して 1 つの遺伝子コードを生成できる多く Mrna その異なるタンパク質製品。推定されているヒトの遺伝子の 92-94% が代替スプライシング1,2を受けること。パターンをスプライシング異常の代わりに起因する遺伝の突然変異は、多数の疾患、筋萎縮性側索硬化症、筋強直性ジストロフィーがん3,4などにリンクされています。つまり、調査し、人間の病気の新しい治療法を見つけるための代替選択的スプライシング制御機構を理解することが重要。
多くの場合セル型固有の方法で調整されます。特定の生物学的システムでの特定の遺伝子として発現パターンを調べることが重要です。しかし、これは脳や心臓などの細胞の多くの異なる種類を含む複雑な器官を学んだとき複雑になります。この場合、アッセイ システムの理想的な選択肢は、RNAの in situハイブリダイゼーション (っぽい) ティッシュを使用してセクションの特定の遺伝子として発現パターンを多くの細胞のタイプで同時に検出できます。確かに、エクソン特異的プローブは、代替エクソン5,6、7の発現レベルを評価するために使用されています。ただし、この方法は次の理由ではパターン分析としての適していません。まず、従来の ISH 法は通常 300 以上のプローブを使って bp、脊椎動物の内部エクソン (ない最初または最後エクソン) の平均のサイズは 170 ヌクレオチド8,9。第二に、内部代替エキソンの選択的スプライシングのパターンを調べるエクソン特異的プローブを使用すると、プローブによって検出のみの mRNA アイソ フォームは、エクソンは検出できませんなし mRNA アイソ フォームながら、エクソンが含まれている 1 つであります。したがって、代替のエクソンの値を (PSI) 融着接続割合の計算は複雑です。さらに、従来の蛍光っぽいはしばしば免疫染色は、検出効率と堅牢性を軽減っぽいを兼ね備えています。たとえば、ストレス誘発性を検討した研究ではスプライシング アイソ フォーム切り替えアセチルコリンエステラーゼ (AChE) の mRNA、ジゴキシゲニンっぽいプローブに編入され、アンチ ジゴキシゲニン抗体を使用して検出されました。また、ビオチン標識プローブは、アルカリ性ホスファターゼ/ストレプトアビジン共役およびアルカリホスファターゼの10のための基板によって検出されました。どちらのメソッドでは、任意の拡大戦略を使用して、検出の感度を上げます。その結果、それは低レベルで発現する mrna の検出に挑戦します。したがって、表現のパターンとしてその場で分析する単純で丈夫っぽいアッセイ システムが必要です。
BaseScope は最近 RNAscope、老舗のプラットフォームをベースに開発され、広くっぽいアッセイ システムを使用します。両方のアッセイ系では、検出11,12の感度を高めるターゲット固有の増幅技術を採用しています。その他から 1 つを区別するものは BaseScope、50 のヌクレオチドと RNAscope の 300-1,000 ヌクレオチドとして短いターゲット シーケンスの長さです。したがって、ターゲット特定の代替の mRNA のアイソ フォームの検出するエクソン エキソン接合設計プローブすることが可能です。現在の研究では、神経線維腫の発現パターン入力 1 (Nf1) エクソン 23 a、同じ研究室13,14,15で手広く研究代替エクソンを調べる手順を設立,16,17マウスの脳のセクションで。結果は、BaseScope がNf1エクソン 23 a原の発現パターンを研究する理想的なシステムであることを示します。このアッセイ システムは、多くの代替のエクソンの発現パターンとして分析に適応できますが、それは AS の研究の強力な新しいツールを表します

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Humidity Control Tray (with lid)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III General Purpose Incubator</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pretreatment kit&lt;/strong&gt;</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-A</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-B</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Wash Buffer</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Control slide-mouse 3T3 cell pellet</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidifying Paper</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Washing Rack</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Washing Dishes</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>formalde solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay

代替選択的スプライシング (AS) は、ヒトの遺伝子の 90% 以上で発生します。オルタナティブスプ エクソンの表現パターンは多くの場合セル型固有の方法で調整されます。パターンは通常 RT-PCR および RNA シーケンスによって分析される表現としての RNA のサンプルを使用してセルの人口から分離されました。試験では、その場の特定の生物学的構造の表現のパターンとしては、RNAの in situハイブリダイゼーションによる (っぽい) エクソン特異的プローブを用いた実施できます。ただし、代替のエクソン、一般的にエクソン特異的プローブの設計には短すぎるので、ISH のこの特定の使用が制限されています。本報告では、BaseScope、RNA ISH で短いアンチセンス オリゴヌクレオチドを用いる最近開発された技術の使用はマウスの脳のセクションで式パターンとして分析する説明。神経線維腫型 (Nf1) 1 のエクソン 23 a は、短いエクソン エキソン接合プローブがマウスの脳のセクションの RNA っぽい分析に高い特異性と堅牢な交配のシグナルを示すことを説明するために例として使用されます。もっと重要なは、エクソン包含とスキップ特定プローブで検出される信号は確実にNf1エクソン 23a 式マウス脳の別の解剖学的領域での値でスプライス % を計算する使用できます。実験プロトコル、分析としての計算方法が掲載されています。BaseScope 式パターンとしてその場で評価するために強力な新しいツールを提供することが示唆されました。

BaseScope っぽいが 3 つのマウス系統を用いたを行った: CD1 野生型マウス、c57bl/6 j 野生型マウスとNf123aIN/23aIN変異マウス c57bl/6 j バック グラウンドでどのエクソン 23 a の結果としてすべてのセルのタイプに含まれています設計スプライス部位突然変異14,15。
最初のス?...

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Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

その場で交配 (っぽい) プロトコル マウス脳セクションの代替の Pre-mrna スプライシング パターンを検出する短いアンチセンス オリゴヌクレオチドを使用して記述されています。

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

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Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

8.8K ビュー.  Case Western Reserve University. その場で交配 (っぽい) プロトコル マウス脳セクションの代替の Pre-mrna スプライシング パターンを検出する短いアンチセンス オリゴヌクレオチドを使用して記述されています。

ビデオ: Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (&#916;S) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (&#945;) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (&#946;). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3's four spliced transcripts (S&#945;, S&#946;, &#916;S&#945; and &#916;S&#946;) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants' levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and &#945;/&#946; C-termini, can be quantified.

STAT3スプライスバリアント転写産物を定量化するために絶対的および相対的定量PCRのデータをマージ

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

遺伝学

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、<em&gt;インビトロ</em&gt;がんモデル

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

がん研究

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

生物学

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

神経科学

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

ラピッド<em&gt;その場で</emセロトニン症候群のラットのパラホルムアルデヒド接頭辞脳にオリゴヌクレオチドプローブを使用して&gt;ハイブリダイゼーション

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

RNA-seqデータにおける選択的スプライシングおよびポリアデニル化の同定(英語)

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections

Source: Shokry, I. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53165">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video demonstrates the detection of serotonin receptor RNA synthesis using oligonucleotide probes in rat brain tissue affected by serotonin syndrome. The protocol includes tissue pretreatment, probe hybridization, and enzymatic detection to visualize and quantify serotonin receptor RNA expression under a microscope.

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

要約

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STAT3スプライスバリアント転写産物を定量化するために絶対的および相対的定量PCRのデータをマージ

に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出

ラピッド

ダブル蛍光を組み合わせます

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

RNA-seqデータにおける選択的スプライシングおよびポリアデニル化の同定(英語)

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections