Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association [subvenciones 0365274B a H.L.], Instituto Nacional del cáncer [esporas GI P50CA150964 a Z.W.], institutos nacionales de salud [Oficina de investigación infraestructura compartida instrumentación Grant S10RR031845 a la microscopia ligera imagen instalación en Case Western Reserve University] y China Scholarship Council [a X.G.]. Los autores agradecen a Richard Lee en la base de imágenes de microscopia de luz por su ayuda con la exploración de la diapositiva.

Todos los experimentos descritos aquí que involucran ratones han sido aprobados por la Comisión de uso y de caso Western Reserve University institucional Animal Care. El título del protocolo 2016-0068 (PI: Hua Lou) es "Papel de splicing alternativo del pre-mRNA en el desarrollo de vertebrados".
Nota: Se incluye información de todos los equipos, reactivos y suministros utilizados en el presente Protocolo en la Mesa de materiales.
1. preparar formalina parafina fijo encajado (FFPE) secciones
<ol><li>
Eutanasia 1 ratón CD1 y 1 ratón C57BL/6J por dislocación cervical. Cuidadosamente corte el cráneo con tijeras quirúrgicas y pinzas. Quitar el cerebro con una cuchara. Nota: ratones machos de 5 meses CD1 y ratones machos de 3 meses C57BL/6J se utiliza y mostraron resultados similares.<ol>
<li>Lavar el cerebro con PBS. Fijar todo el cerebro con una solución que contiene 10% de formalina a temperatura ambiente (RT) de 30 h poniendo todo el cerebro en 50 mL de la solución de formalina.</li>
		<li>Cambiar la solución fijadora a PBS e incubar el cerebro en PBS durante la noche a 4 ° C. Deshidratar e incrustar el cerebro con xileno y parafina usando procedimientos estándar de18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Utilizar un micrótomo para cortar tejidos embebidos en 5 secciones de μm. Poner la cinta de la parafina en baño de agua RT primero y después en un baño de agua de 45 ° C para difundir la cinta.
	<ol>
<li>Cuando desaparecen las arrugas y pliegues en la cinta, inmediatamente montar secciones en portaobjetos de vidrio. Aire seco diapositivas durante la noche en diapositivas RT. Cueza al horno por 1 h a 60 ° C antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. pretratamiento de la muestra
<ol><li>
Desparafinizar cortes de tejido. Llevar a cabo estos pasos en una campana de humos.
	<ol>
<li>Llene dos lavando platos (figura 1A) con 250 mL de xileno fresco y dos con 250 mL de etanol al 100%. Insertar diapositivas de tejidos en un estante de lavado (figura 1A) y el lavado del estante en lavar los platos después de la orden e incubación el tiempo indicado en la tabla 1.</li>
		<li>Durante cada incubación, levante la rejilla de lavado hacia arriba y hacia abajo más de 3 veces en el plato de lavado. Después de cada incubación, mover rápidamente la canasta de lavado en el siguiente plato lavarse para evitar que las secciones de tejido se seque.</li>
		<li>Después de completar los pasos de la incubación, saque la rejilla de lavado con diapositivas del plato de lavado. Coloque la rejilla en una incubadora de 60 ° C por 5 minutos o hasta que las diapositivas estén completamente secas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dibujar una 0,75 '' x 0,75 '' barrera alrededor de la sección del tejido con un bolígrafo de la barrera hidrofóbica. Secar la barrera por 3 min a TA.</li>
	<li>
Prepare las rebanadas
	<ol>
<li>Preparar reactivos y equipos<ol>
<li>Encender el horno de hibridación (figura 1B) y la temperatura a 40 ° C 30 min antes de su uso.</li>
			<li>Moje el papel de humidificación (Figura 1E) con agua destilada completamente y poner en bandeja de control de humedad (figura 1, izquierda). Mantener la bandeja de control de humedad en el horno de hibridación.</li>
			<li>Preparar 700 mL de dulce 1 x objetivo recuperación de reactivos mediante la adición de 630 mL de dH2O a 70 mL de 10 x objetivo recuperación de reactivos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aplicar peróxido de hidrógeno.<ol>
<li>Poner los portaobjetos deparaffinized en el Banco. Agregar 5 – 8 gotas de peróxido de hidrógeno a una sección para cubrir completamente el tejido. Incubar por 10 min a TA.</li>
			<li>Toque en las diapositivas en una hoja de papel absorbente para retirar la solución de peróxido de hidrógeno, una diapositiva a la vez. Insertar la diapositiva en un rack de lavado inmediatamente y mueve el estante a un plato de lavado con dH2O.</li>
			<li>Lavar los portaobjetos moviendo la rejilla hacia arriba y hacia abajo en agua destilada durante 3 a 5 veces. Hacia la canasta de lavado un plato de lavado llenado con agua destilada y diapositivas de lavado una vez más.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realizar recuperación de destino<ol>
<li>Coloque un vaso de precipitados de vidrio de 1000 mL en una placa caliente. Agregar 700 mL de dulce 1 x objetivo recuperación de reactivos en el vaso y cubrir con papel de aluminio. Inserte un termómetro en el vaso a través de la cubierta de aluminio (figura 1). Encender la placa y en alto durante 10 – 15 minutos.</li>
			<li>Cuando la temperatura de los reactivos de recuperación alcanza los 98 ° C, pasar el control de la temperatura de la placa de alto a bajo para mantener un hervor suave. No hervir más de 15 minutos.</li>
			<li>Mientras tanto, cuidadosamente abra la hoja y colocar la rejilla de lavado con rebanadas dentro el regente de la recuperación. Cubrir el vaso otra vez e incubar durante 15 minutos.</li>
			<li>Uso de fórceps para extraer la rejilla el vaso a un plato de lavado llenan con 200 mL de dH2O y enjuague por 15 s.</li>
			<li>Mueve el estante a un plato de lavado que contiene etanol fresco 100% y dejar reposar por 3 minutos eliminar diapositivas y seca en una incubadora de 60 ° C durante 10 minutos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Proteasa III se aplican<ol>
<li>Coloque el portaobjetos sobre la parrilla de tinción (figura 1, derecha). Añadir 5 gotas de proteasa III para cubrir el tejido. Con cuidado ponga la rejilla en la bandeja de control de humedad (figura 1, izquierda) e Introduzca la bandeja en el horno de hibridación de 40 ° C. Incubar durante 30 minutos.</li>
			<li>Retire la parrilla y coloque la bandeja en el horno. Toque el portaobjetos para eliminar el exceso de líquido, una diapositiva a la vez. Insertar la diapositiva en un rack de lavado y lugar la parrilla en un plato de lavado lleno de dH2O. mover el estante hacia arriba y hacia abajo para lavar los portaobjetos para 3 - 5 veces.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ISH ensayo
<ol><li>
Preparar materiales
	<ol>
<li>Pre-calentar 50 x de tampón de lavado en una incubadora de 40 ° C durante 20 min mezcla 2.94 L dH2O y 60 mL de 50 x de tampón de lavado para hacer 1 x de tampón de lavado.</li>
		<li>Preparar solución tinción hematoxilina al 50% mediante la adición de 100 mL de hematoxilina de Gill I a 100 mL de dH2O. Prepare agua de amoníaco 0,02% (p/v) añadiendo 1,43 mL de hidróxido de amonio N 1 a 250 mL de dH2O. mezcla bien en un recipiente.</li>
		<li>Poner las puntas de prueba y AMP 0 – 6 reactivos a RT 30 min antes de su uso. Mantener la bandeja de control de humedad en el horno de hibridación de 40 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimiento ISH Nota: Para examinar la expresión de la Nf1 isoformas de empalme y calcular el porcentaje empalmado en valor (PSI) para el exón 23a, tres diferentes sondas ISH que exón 23a-incluido isoforma, exón excluidos 23a isoforma o ambas isoformas son usadas (figura 2 ). Las sondas se utilizan en las secciones de tejido adyacente corte. Para asegurar la exactitud del cálculo, es crítico que las secciones de tres tejido tratan exactamente el mismo en los pasos de detección de hibridación y amplificación de señal.<ol>
<li>Sonda de hibridación.<ol>
<li>Quite las diapositivas de la canasta de lavado y aprovechar el exceso de líquido de las diapositivas. Coloque el portaobjetos en el canal de la mancha.</li>
			<li>Utilice un lápiz para rotular los portaobjetos con el nombre del sondeo. Poner las diapositivas de tejido cerebral adyacente corte tres que se hibridó con tres sondas diferentes de Nf1 (figura 2) juntos. Llevar a cabo los pasos siguientes en el mismo orden de diapositivas.</li>
			<li>Añadir 4 gotas de la sonda para cubrir el tejido. Do esta una diapositiva a la vez para evitar que las secciones se seque. Coloque la rejilla de la mancha en la bandeja de control de humedad e introducirlo en el horno de 40 ° C por 2 h.</li>
			<li>Lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado. Para cada lavado, llenar la cubeta de tinción con 200 mL de 1 x de tampón de lavado y ponga una rejilla de lavado en el mismo. Aprovechar el exceso de líquido sobre un un portaobjetos papel toalla en un momento y rápidamente lo introduzca en la canasta de lavado. Mueva la parrilla hacia arriba y hacia abajo en el plato para 3 a 5 veces por 2 min a TA.</li>
			<li>Para el segundo lavado Utilice el tampón de lavado fresco.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplificación de la señal.<ol>
<li>Toque en el tampón de lavado excesiva de las correderas y los coloque en el canal de la mancha. Añadir 4 gotas de AMP 0 para cubrir el tejido. Coloque la rejilla de la mancha en la bandeja de control de humedad e introducir en el horno durante 30 min a 40 ° C.</li>
			<li>Lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado como se describió anteriormente.</li>
			<li>Repita este paso con AMP 1 al 6 siguiendo el orden y la condición del cuadro 2. Lave los portaobjetos dos veces después de cada paso de hibridación.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Detección de señal<ol>
<li>Toque en el tampón de lavado excesiva de las correderas y colóquelas en mancha rack. Añadir 2 μl de rápido rojo B a 120 μl de Fast Red (relación de 1: 60) en un tubo de microcentrífuga. Mezclar bien y añadir para cubrir completamente la sección del tejido. Nota: El volumen total de la Red A mezcla B se basa en el número y tamaño de las secciones de tejido. Para un área de 0,75 '' x 0,75 '', 120 μl es suficiente para una sección. Utilizar la mezcla dentro de 5 minutos y evitar la exposición de la mezcla a la luz solar directa o luz ultravioleta.</li>
			<li>Cerrar la bandeja e incubar 10 min a RT. Retire la solución a un contenedor de basura inmediatamente Inserte las diapositivas en un rack de lavado y coloque la parrilla en un plato de lavado con agua del grifo. Enjuague nuevamente con agua fresca del grifo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Contratinción de las diapositivas
	<ol>
<li>Retire la rejilla de lavado del agua de golpecito y rápidamente Pulse sobre papel absorbente para eliminar el agua extra. Poner la rejilla en una 50% la hematoxilina solución de tinción e inmediatamente mueve el estante arriba y abajo varias veces. Incubar durante 2 min a TA.</li>
		<li>Transferencia de la parrilla corrediza en el plato de agua del grifo. Lavar 3 – 5 veces mover el estante hacia arriba y hacia abajo y cambiando el agua fresca del grifo hasta que las diapositivas se convierten en claras, mientras que los tejidos cerebrales siendo púrpura.</li>
		<li>Mueve el estante a un plato que contiene agua de amoníaco 0,02%. Mover el estante hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces hasta que los tejidos se vuelven azules. Lave los portaobjetos 3 a 5 veces con agua de grifo en una cubeta de tinción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaje de las muestras
	<ol>
<li>Mover la parrilla de la cubeta de tinción a una incubadora de 60 ° C e incube durante al menos 15 minutos hasta que las diapositivas estén completamente secas.</li>
		<li>40 μl de medio de montaje sobre el portaobjetos y coloque cuidadosamente un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm en la sección del tejido. Aire seco diapositivas por 30 min a TA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis y recopilación de datos
Nota: Utilizar un escáner de diapositivas para escanear las imágenes con 40 aumentos.
<ol><li>
Controles positivos y negativos
	<ol>
<li>Para cada experimento, incluir controles positivos y negativos (figura 3). Como un buen control positivo, señal debe ser visible como punteadas puntos con aumentos de 20-40.</li>
		<li>Uso del ratón (Mm) 1ZZ - PPIB - como control positivo. Este sondeo apunta a un gen común de limpieza PPIB. Para el control negativo, un punto a cada 20 células Mostrar fondo tinción por campo de microscopio de 20 X es aceptable.</li>
		<li>Usar la sonda DapB-1ZZ como control negativo. Este sondeo apunta la dapB gen bacteriano. Estas puntas de prueba de control se han utilizado en muchos ensayos ISH19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detección de señales y análisis de patrones de expresión de Nf1 exón 23a
	<ol>
<li>Como las señales de hibridación se indican como puntos punteadas, contar los puntos manualmente. El número de puntos se correlaciona con el nivel de las transcripciones que es detectado por un sensor específico. Tenga en cuenta que el número de puntos también puede ser analizado por el software ImageJ o SpotStudio.</li>
		<li>Utilice tres sondas para hibridar a exón que contiene 23a, exón 23a falta isoformas o transcripciones de Nf1 total (figura 2). Como las tres puntas de prueba no pueden utilizarse al mismo tiempo, utilizar tres secciones de tejido cerebral adyacente para hibridar a cada sonda.<ol>
<li>Para calcular el porcentaje empalmado en (PSI) para el exón 23a, contar el número de puntos en varias regiones del cerebro y las células. Para cada región de interés, cuenta más de 400 células de varias subregiones como se indica en la figura 4.</li>
			<li>Recopilar datos de las mismas subregiones de cada uno de los tres sondeos. Calcular PSI como número de puntos por la célula con la sonda de inserción exón 23a / (número de puntos por celular con la sonda de inserción exón 23a + número de punto por la célula con la exon23a salta sonda) x 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Cieply, B., Carstens, R. 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The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806 (2015).</li><li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+splice+variants+in+the+5'UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain:+alternative+5'UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites.">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li><li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+quantification:+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale.">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li><li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms:+characterization,+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain.">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).</li><li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Esta comunicación informa el uso de BaseScope ARN ISH para examinar como patrones de la expresión en secciones de cerebro de ratón. Está demostrado que empalme exón-exón de anti-sentido sondas de menos de 50 nucleótidos pueden dirigirse a inclusión de exón y saltar isoformas robusta y específicamente. Además, la señal resultante puede utilizarse para calcular PSI de un exón alternativo.
Se analizaron algunas variaciones en el procedimiento. Por ejemplo, secciones congeladas del te...

Empalme alternativo (AS) es un proceso común que ocurre durante la maduración del pre-mRNA. En este proceso, un exón puede incluirse diferencialmente en el mRNA maduro. Así, a través de AS, un gen puede generar mRNAs muchos ese código para productos diferentes de proteínas. Se estima que 92 – 94% de los genes humanos sufrir splicing alternativo del1,2. Alternativa anormal empalme patrones resultado de mutaciones genéticas se han ligado a un gran número de enfermedades, como esclerosis lateral amiotrófica, distrofia miotónica, cáncer3,4. Por lo tanto es crucial investigar y comprender mejor los mecanismos de splicing alternativos en un intento de encontrar nuevos tratamientos de enfermedades humanas.
COMO a menudo se regula de manera específica de tipo celular. Es importante determinar el patrón de expresión de AS de un gen específico en un sistema biológico dado. Sin embargo, esto se complica cuando se estudia un órgano complejo que contiene muchos tipos diferentes de células, como el cerebro o el corazón. En este caso, una opción ideal de sistema de ensayo es RNA en situ hibridación (ISH utilizando) las secciones por lo que el modelo AS de expresión de un gen específico puede ser detectado en muchos tipos celulares simultáneamente. De hecho, se han utilizado sondas exón específico para evaluar los niveles de expresión de un exón alternativo5,6,7. Sin embargo, este enfoque no es adecuado para análisis del patrón por las siguientes razones. En primer lugar, convencionales métodos ISH suelen utilizan sondas de más de 300 bp, mientras que el tamaño promedio de exones internos vertebrados (no primer o último exón) es 170 nucleótidos8,9. En segundo lugar, cuando una sonda de exón específico se utiliza para examinar el patrón de corte y empalme de un exón alternativo interno, la única isoforma de mRNA detectada por la sonda es la que contiene el exón, mientras que la isoforma de mRNA sin el exón no puede ser detectado. Así, el cálculo por ciento empalmado en valor (PSI) para el exón alternativo es complicado. Además, ISH fluorescente convencional a menudo combina ISH con inmunotinción, que reduce la eficiencia de la detección y la robustez. Por ejemplo, en un estudio que investigó la tensión inducida empalme isoform de la conmutación de la acetilcolinesterasa (AChE) mRNA, digoxigenina fue incorporado en la sonda ISH y detectado usando anticuerpo anti-digoxigenina. Alternativamente, la sonda marcada con biotina fue detectado por un conjugado de fosfatasa alcalina/estreptavidina y sustrato para fosfatasa alcalina10. Ni método utiliza cualquier estrategia de amplificación para aumentar la sensibilidad de detección. Como resultado, es difícil detectar las transcripciones del mRNA que se expresan en niveles bajos. Por lo tanto, es necesario un sistema de análisis ISH más simple y más robusto para analizar patrones de expresión en situ.
BaseScope es un reciente desarrollo basado en la plataforma de RNAscope, una bien establecida y ampliamente utilizado sistema de ensayo ISH. Ambos sistemas de ensayo emplean una tecnología de amplificación específico del destino que aumenta la sensibilidad de detección11,12. Lo que distingue una de la otra es la longitud de la secuencia de destino, que es tan corta como 50 nucleótidos para BaseScope y 300-1.000 nucleótidos de RNAscope. Por lo tanto, es posible sondas de diseño dirigidos a uniones exón-exón para detectar específico alternativo mRNA isoforms. En el presente estudio, se estableció un procedimiento para examinar como patrones de expresión de la neurofibromatosis tipo 1 (Nf1) exón 23a, un exón alternativo estudiado en el mismo laboratorio13,14,15 , 16 , 17, en secciones de cerebro de ratón. Los resultados demuestran que el BaseScope es un sistema ideal para el estudio de patrones de expresión de Nf1 exón 23a in situ. Como este sistema de análisis puede ser adaptado para analizar como patrones de expresión de muchos exones alternativos, representa una poderosa nueva herramienta en los estudios de AS.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Oven</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Humidity Control Tray (with lid)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III General Purpose Incubator</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Pretreatment kit&lt;/strong&gt;</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reagent Kit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-A</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Fast RED-B</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Wash Buffer</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Control slide-mouse 3T3 cell pellet</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidifying Paper</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Washing Rack</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Washing Dishes</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>formalde solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay

Empalme alternativo (AS) ocurre en más del 90% de genes humanos. El patrón de expresión de un exón alternativamente empalmado a menudo está regulado de manera específica de tipo celular. COMO expresión patrones típicamente son analizados por RT-PCR y RNA-seq con muestras de RNA aislados de una población de células. In situ examen de como patrones de la expresión de una particular estructura biológica puede realizarse por el RNA en situ hibridación (ISH) utilizando sondas exón específico. Sin embargo, este uso particular del ISH ha sido limitada porque exones alternativos son generalmente demasiado cortos para el diseño de sondas exón específico. En este informe, el uso de BaseScope, una tecnología recientemente desarrollada que emplea cortos oligonucleótidos antisentidos en ARN ISH, se describe a analizar como patrones de la expresión en secciones de cerebro de ratón. Exón 23a de neurofibromatosis tipo 1 (Nf1) se utiliza como ejemplo para ilustrar que corta exón-exón cruce sondas exhiben señales de hibridación robusto con alta especificidad en el análisis de ARN ISH en secciones de cerebro de ratón. Más importante aún, las señales detectadas con exón específico inserción y saltar las puntas de prueba pueden utilizarse para calcular fiablemente el porcentaje empalmado en los valores de expresión de 23a exón de Nf1 en diferentes áreas anatómicas del cerebro de un ratón. Presentan el protocolo experimental y el método de cálculo para análisis. Los resultados indican que BaseScope proporciona una nueva herramienta poderosa para evaluar como los patrones de expresión en situ.

BaseScope ISH se llevó a cabo utilizando tres cepas de ratón: CD1 tipo salvaje ratones, C57BL/6J tipo salvaje ratones y ratones mutantes Nf123aIN/23aIN en el fondo de C57BL/6J, en qué exón 23a está incluido en todos los tipos de células como resultado del sitio del empalme de ingeniería las mutaciones14,15.
Como primer paso, el sistema de ensa...

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Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Se describe un protocolo en situ hibridación (ISH) que utiliza oligonucleótidos antisentidos corto para detectar patrones de splicing alternativo del pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón.

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

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Genetics

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

8.8K vistas.  Case Western Reserve University. Se describe un protocolo en situ hibridación (ISH) que utiliza oligonucleótidos antisentidos corto para detectar patrones de splicing alternativo del pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón.

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Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (&#916;S) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (&#945;) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (&#946;). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3's four spliced transcripts (S&#945;, S&#946;, &#916;S&#945; and &#916;S&#946;) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants' levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and &#945;/&#946; C-termini, can be quantified.

La fusión absoluta y relativa de datos de PCR cuantitativa para cuantificar STAT3 variante de empalme transcripciones

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Investigación

Genética

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cáncer

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Investigación sobre el cáncer

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Uso de la sola molécula fluorescente en Situ del hibridación (SM-pescado) para cuantificar y Localize mRNAs en oocitos murinos

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biología

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Neurociencias

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación usando sondas de oligonucleótidos en Cerebro paraformaldehído-prefijo de ratas con síndrome de serotonina

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

Identificación de empalme alternativo y poliadenilación en datos de RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections

Source: Shokry, I. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53165">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video demonstrates the detection of serotonin receptor RNA synthesis using oligonucleotide probes in rat brain tissue affected by serotonin syndrome. The protocol includes tissue pretreatment, probe hybridization, and enzymatic detection to visualize and quantify serotonin receptor RNA expression under a microscope.

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Resumen

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La fusión absoluta y relativa de datos de PCR cuantitativa para cuantificar STAT3 variante de empalme transcripciones

El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en

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Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución

Rápido

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Identificación de empalme alternativo y poliadenilación en datos de RNA-seq

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections