研究は、国立研究所のアレルギーと感染症 (NIH NIAID) 賞 R15AI079685 によって支えられました。

1. ソリューションの準備
注:エシェリヒア属大腸菌のスフェロプ ラストとB. メガテリウムプロトプ ラストをそれぞれ生産するために手順 1.1-1.9 1.8-1.11 で説明するソリューションを準備します。
<ol><li>準備 1 M トリス-Cl、10.34 g トリス塩酸と dH2O 125 mL フラスコ 50 mL にトリスああ 4.17 g を溶解して pH 7.8。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>0.10 g MgCl2 (95.2 g/mol) と 25 mL dH2125 mL フラスコ内 O 11.98 g ショ糖 (342.3 g/mol) を溶解することによりソリューション (20 mM MgCl2、0.7 M ショ糖、10 mM トリス-塩素、pH 7.8) を準備します。500 μ L を追加 1 M トリス Cl (pH 7.8) し、50 mL にボリュームを調整します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>ソリューション B (10 mM MgCl2、0.8 M ショ糖、10 mM トリス-塩素、pH 7.8) を準備するには、0.05 g MgCl2 (95.2 g/mol) と 13.69 g ショ糖 (342.3 g/mol) 25 mL dH2125 mL のフラスコで O に溶解します。500 μ L を追加 1 M トリス Cl (pH 7.8) し、50 mL にボリュームを調整します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>50 mL dH2O は、125 mL のフラスコで 13.69 g ショ糖 (342.3 g/mol) を溶解することにより 0.8 M ショ糖を準備します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>5 mg/mL デオキシリボヌクレアーゼの準備私 (DNase 私) 0.015 g DNase 溶解 dH250 mL フラスコ O の 3 mL で。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌しなさい。Microfuge の管、-20 ° C でストアに割り切れるソリューション</li>
	<li>0.125 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の準備、0.698 g EDTA 二ナトリウムを溶解して pH 8.0 15 mL dH2O 125 mL のフラスコの中に (372.2 g/mol) を脱水します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>600 μ g/mL セファレキシンを準備するには、50 ml の dH2O 125 mL のフラスコの中のセファレキシン水和物 (365.404 g/mol) の 0.03 g を溶解します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌しなさい、4 ° C での円錐管に格納</li>
	<li>DH250 mL フラスコ O の 3 mL で 0.015 g リゾチームを溶解して 5 mg/mL リゾチームを準備します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌しなさい。Microfuge の管、-20 ° C でストアに割り切れるソリューション</li>
	<li>1 l の dH2O 2 L フラスコで TSB の 30 g を溶解することにより、3 w/v トリプチ醤油スープ (TSB) を準備します。因数にフラスコ 25 mL または 100 mL それぞれ大腸菌スフェロプ ラストまたはB. メガテリウムプロトプ ラスト,の準備で使用される TSB を含むソリューション。液体培地を滅菌するオートクレーブ フラスコ。滅菌 TSB は室温または 4 ° C で保存できます。</li>
	<li>34.23 g ショ糖 (342.3 g/mol)、0.46 g マレイン酸 (116.07 g/mol) と 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dH2O 250 mL フラスコ 100 mL に溶解して溶液 (1 の M ショ糖、0.04 M マレイン酸、0.04 M MgCl2、pH 6.5) を準備します。6.5 に pH を調整します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>100 mL 3 w/v TSB と 100 mL の溶液 C 1 L のガラス瓶を混合することによってプロトプ ラスト中の 200 mL を準備します。オートクレーブ ソリューションを殺菌し、常温で保存します。</li>
</ol>2. 一晩かけて培養の準備
注: セクション 2-4 適切な無菌技術を使用してを実行します。必要な場合、細菌は潜在的な汚染を減らすために抗生物質耐性のプラスミドを含めることができます。抗生物質耐性の菌株を使用している場合は、手順 2.1、3.1-3.2 と、図 4.1-4.4 で必要な抗生物質を追加します。
<ol><li>滅菌ピペット チップを使用して、それを 3 %w/v TSB の 2-3 mL を含む 14 mL 培養管細菌の単一コロニーをピックアップして一晩かけて培養を準備します。37 ° C で 16-21 h に振りながらインキュベートします。</li>
</ol>3 グラム陰性大腸菌スフェロプ ラストの作成
<ol><li>250 mL フラスコ 25 mL 量 3 %w/v TSB で一晩文化 1: 100 を希釈し、37 ° C で細菌のソリューションをソリューションは 600 0.5-0.8 の光学濃度に達するまでに約 2.5 時間振りながらインキュベート nm。分光光度計を使用して光の密度を測定します。</li>
	<li>250 mL フラスコにこの文化 1:10 3 %w/v TSB の 30 ml を希釈し、インキュベート 37 ° C についての 1 つのセルのフィラメントを生成する 60 μ G/ml セファレキシン (347.4 g/mol) の存在下で 2.5 h に振りながら長さ 50-150 μ m、光学顕微鏡 (図 1 b) 1,000 倍の倍率で観察可能であります。</li>
	<li>1,500 × g、4 ° C で 4 分間デカントで細菌のソリューションを遠心分離によってフィラメントを収穫し、ペレットを予約、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>優しく 0.8 M ショ糖、ペレットを邪魔しないように注意されているの 1 つの mL を追加することでフィラメントを洗います。1 分間インキュベートし、ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。</li>
	<li>1 の 150 μ L を追加 5 mg/mL リゾチームの 120 μ L、5 Mg/ml の DNase の 30 μ M トリス Cl (pH 7.8)、私は、120 μ L、それぞれ 0.125 M EDTA のペレットに注文し、10 分間室温でソリューションを孵化させなさい。</li>
	<li>溶液の 1 mL 徐々 に 1 分以上ソリューションに追加、ソリューションを手でゆっくり旋回しながら、マイクロ ピペットを使用して 3.5 の準備します。室温で 4 分のためのソリューションを孵化させなさい。</li>
	<li>4 ° C の溶液 B の 7 mL を 2 つの 15 mL の円錐管に入れます。これらの 2 つの管のそれぞれに 3.6 で、溶液の同量を追加します。1,500 × g、4 分の 4 ° C で溶液を遠心します。</li>
	<li>ペレットを乱すことがなく 1-2 mL の培養上清を除くすべて削除血清ピペットを使用して、慎重に。P1000 マイクロ ピペットを使用して上下に軽くピペッティングでペレットを再懸濁します。光学顕微鏡 (図 1) を使用して 1,000 倍の倍率でサンプルを観察することによってスフェロプ ラスト形成を視覚的に確認します。</li>
	<li>-20 ° C で 1 週までまたは彼らは 3 凍結融解サイクルを経てまでスフェロプ ラストを格納します。</li>
</ol>4. グラム陽性B. メガテリウムプロトプ ラストの調製
<ol><li>250 mL のフラスコで 3 %w/v TSB の 100 mL で一晩文化縮尺を希釈し、37 ° C で細菌のソリューションをソリューションが 0.9-の光学密度に達するまで、約 4.5 時間のため震えながらインキュベート 600 1.0 nm。分光光度計を使用して光の密度を測定します。</li>
	<li>液体培養を注ぎ、2 つの 50 mL の円錐管、2,000 × g、10 分の 4 ° C で遠心します。</li>
	<li>血清ピペットを使用して、両方の円錐管から上澄みを廃棄します。2.5 mL プロトプ ラスト中でペレットを再懸濁します再懸濁のソリューションを単一の円錐管に結合しています。125 mL のフラスコで結合された再懸濁ソリューションをピペットします。</li>
	<li>5 mg/mL リゾチームの 1 mL を追加し、震えながら 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>プロトプ ラスト 1,000 x 倍率球 (図 2) ではなく腫れ棒として表示される細菌などの任意の不正を指摘し、光学顕微鏡下での成長を監視します。血清ピペットを使用して、ソリューションを 15 mL の円錐管と 2,000 × g、10 分の 4 ° C で遠心分離機に転送します。</li>
	<li>上清をデカントし、再 5 mL プロトプ ラスト メディアでペレットを中断します。-20 ° C で 1 週までまたは彼らは 3 凍結融解サイクルを経てまでプロトプ ラストを格納します。</li>
</ol>5. ペプチド溶液および膜色素イメージングのための準備
<ol><li>
ペプチド ソリューション
	<ol>
<li>アルミ箔に包まれておよび microfuge の管で FITC 800 μ L dH2O を使用して蛋白質の濃度測定を実施するために、少なくとも 1 つのトリプトファン残基を含むペプチドで BF2 P11A をラベル付けの 2 mg を溶解します。</li>
		<li>オンカラム、280 でペプチド溶液の吸光度を測定 3 通 nm。トリプトファン (5,700/Mcm) における分子吸光係数を用いたペプチド濃度を計算します。</li>
		<li>光から保護するためにアルミ箔に包まれて2O-20 ° c および microfuge の管で 100-200 μ m ストアの最終濃度に dH でペプチド濃度を希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
膜色素
	<ol>
<li>および microfuge の管でのディ-8-ANEPPS DMSO の 843.3 μ L で 5 mg を溶解してディ-8-ANEPPS (592.9 g/mol) の 10 の mM の在庫を準備します。光から保護するためにアルミ箔に包まれた 4 ° C で保存します。</li>
		<li>および microfuge の管で 997 μ L DMSO に 3 μ L の 10 mM ディ-8-ANEPPS を追加して 0.03 mM ディ-8-ANEPPS の 1 mL を準備します。光から保護するためにアルミ箔に包まれた 4 ° c および microfuge の管に格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6.大腸菌スフェロプ ラストと共焦点顕微鏡を用いたB. メガテリウムプロトプ ラストの可視化
<ol><li>スフェロプ ラストまたはポリ L リジン コーティング ガラス スライド上にプロトプ ラストの 5 μ L をピペットします。アンプ (100-200 μ M) をスライドにラベルが付いた FITC の 2 μ L を追加し、光から保護 3 分間インキュベートします。</li>
	<li>スライドに、膜色素・ ディ ・-8-ANEPPS (0.03 mM) の 1 μ L を追加し、光から保護 3 分間インキュベートします。ガラス基板カバーし、マニキュアで封印します。</li>
	<li>共焦点顕微鏡とアルゴン レーザーをオンにします。アルゴン レーザーで出力電力 20% と 20% の伝送を調整します。</li>
	<li>499-532 nm と FITC 標識ペプチド放出チャネルとディ 8 ANEPPS 標識膜色素放出チャネルの 670-745 nm の発光波長範囲をそれぞれ設定します。</li>
	<li>プロトプ ラスト イメージまたは 63 X 目的としたスフェロプ ラスト (図 1および図 2)。8 ビットを取得するイメージング ソフトウェアを使用して、画像を 512 x 512 複合 z スタックから成るスフェロプ ラストやプロトプ ラストの全体の 0.5 μ m のスライス。 注: は、イメージングのスフェロプ ラストとプロトプ ラスト中の裁ち落としを通じて排出量を減らすための配慮を取る。詳細についてを参照してください。</li>
</ol>7 アンプの局在化の特性
<ol><li>イメージング ソフトウェアで複合 z スタックのイメージを開きます。スフェロプ ラストやプロトプ ラストの中央のスライスを見つけて 1 つ循環地域の利益率 (ROI) を配置 (直径 0.3 μ m)、スフェロプ ラストのプロトプ ラスト (ROI 2) センターで、スフェロプ ラストまたは測定するプロトプ ラストからの膜 (投資収益率 1)背景の蛍光性 (投資収益率 3) (図 5)。飽和ピクセルを含めることを避けてください。各 ROI の蛍光強度は、画像処理ソフトで計算できます。 注: インスタンス ペプチドは、細胞膜の完全ローカライズされていない、描画 ROI 1 ペプチドはローカライズされた膜の領域に。</li>
	<li>細胞内ペプチド蛍光強度膜ペプチドの蛍光強度の比を決定する次の式を使用します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg"> 注: 投資収益率 3 の蛍光強度は蛍光バック グラウンドを考慮するために 2 の投資収益率と投資収益率 1 で蛍光強度から差し引かれます。</li>
</ol>

<ol>
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C., Matsuzaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+the+Novel+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2+with+Lipid+Bilayers:+Proline+as+a+Translocation+Promoting+Factor.">Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor.</a> Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).</li><li>Decad, G. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Gram-Negative+Bacteria+XII.+Molecular-Sieving+Function+of+Cell+Wall.">Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall.</a> J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+Escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).</li><li>Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melittin-Induced+Permeabilization,+Re-sealing,+and+Re-permeabilization+of+E.+coli+Membranes.">Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes.</a> Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).</li><li>Ruthe, H. J., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+bacterial+spheroplasts+by+electric+fields.">Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields.</a> Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

ここに示すプロトコルより急速に拡大、球形の細菌がはるかに簡単検索、向き、およびイメージのため細菌画像のより大きなサンプル サイズを取得する研究者を実現可能にします。データを収集するためにこの拡張機能は、いくつかの点で重要です。まず、ペプチドの局在パターンのより体系的な定量分析を有効化します。高画質画像のセットでのみ大きなサンプルを明らかに局在する細胞...

抗菌ペプチド (アンペア) は、従来の抗生物質1,2,3,4、5の代わりに、彼らの潜在的な使用のため注目を集めています。アンプによって細胞膜透過や核酸など、細胞内構成要素との相互作用構造のセル内容6漏洩を引き起こす膜で細菌を殺します。、抗生物質として利用に加えてアンプを透過が適応する薬物送達アプリケーションの無停止不浸透性の細胞膜7、8を越えることができるので。我々 は、したがって、創での使用のための基盤を築くためのアクションの基本的なアンプのメカニズムを理解しようとします。
共焦点顕微鏡アクション9,10、11,12,のメカニズムに洞察力を提供する細菌細胞の蛍光に分類されたアンプの局在パターンを評価する方法を提供しています。13,14. 細菌の膜の分類、によって 1 つは蛍光に分類されたペプチドが膜または細菌の細胞の細胞内領域に局在するかどうかを決定できます。ただし、この手法は、従来の光顕微鏡の解像度の限界と可変方向スライド15上の細菌のために挑戦をイメージングすることができます細菌の小さなサイズとロッドの形状によって制限されます。
提案手法の目的は、共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識ペプチドの局在パターンの強化された可視化を有効にすることです。小型、薄型、桿菌グラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) とグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) を回すことによって可視化を強化拡大、球状形態に細菌と呼ばれる(グラム陰性菌) のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト (グラム陽性菌) の16,17,18,19,20,21。スフェロプ ラストとプロトプ ラストは、そのサイズの増加とそのイメージングの無関係なスライドの細菌の向きは、その左右対称の形状のためイメージしやすく。また、ローカライズや透過のいずれかの膜としてアンプを特徴付けるために共焦点顕微鏡データを定量的に解析する体系的なアプローチを提案する.これらの方法を適用しやすく区別蛍光ペプチドの局在パターンに分類します。ここに示すプロトコルは、各種アンプ、セル透過ペプチドを含む以外膜活性剤のローカリゼーションを評価するために使用できます。
この手法の利点は、細胞間の異質性15、一般的に識別するために使用される他の蛍光アッセイではなく明らかにするかもしれない単一セルのレベルのアンプの作用のメカニズムに洞察力を提供することの 1 つ、アンプは、一括見積もり9,22,23,24,25を提供するだけの行為のメカニズム。スフェロプ ラストとアンプ セルへの入力を評価するためにプロトプ ラストの使用特定の有用な26彼らこそ脂質小胞24など、セルへの入力を評価するために使用されるその他のモデルよりももっと生理学的に関連する15 。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Trizma hydrocloride (Tris HCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base (Tris OH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>106361</td>
			<td>Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cephalexin hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Trypticase soy broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B11768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BF2 P11A FITC</td>
			<td>NeoScientific</td>
			<td>Custom ordered</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-8-ANEPPS</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>61012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34869</td>
			<td>Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 &#956;m HT Tuffryn Membrane</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite, Advanced Fluorescence</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>For image processing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and visualization of bacterial spheroplasts and protoplasts to characterize antimicrobial peptide localization

細菌内でペプチドの局在パターンを評価する方法としての共焦点顕微鏡の使用は、従来の光顕微鏡の解像度の限界によって阻害される一般的。小さな棒状グラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) とグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) を変換するプロトコルを提案する特定の顕微鏡の解像度は簡単に強化できない、大きく、簡単にイメージ化された球状形態にスフェロプ ラストやプロトプ ラストと呼ばれます。この変換では、迅速かつ明確にペプチド (すなわち膜のローカライズ) 細菌の細胞膜に自分自身を申し立てるか (すなわち、透過) セルを入力する膜を通過するかどうかを決定するためのオブザーバーをことができます。このアプローチでは、ローカライズや透過膜としてペプチドを特徴付けるため体系的な方法を示します。Buforin II P11A の相互作用を観察することによりこのプロトコルの有用性を示す様々 な膜活性ペプチドや細菌の緊張のこのメソッドを使用できますが、(BF2 P11A)、エシェリヒア属大腸菌での抗菌ペプチド (AMP)スフェロプ ラストとB. メガテリウムプロトプ ラスト。

細菌を拡大して、球は、簡単に、ペプチドは細菌の細胞膜にローカライズや細菌の細胞膜に容易に若しかどうかを区別できます。従来の光顕微鏡の解像度限界は膜にローカライズされた信号と重複するように見えるために、膜または通常の細菌の細胞内スペースからペプチド信号が発生するかどうかを区別するために挑戦的な、細胞内領域 (図 3 a</stron...

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Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

ここで提案するグラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) を生成するプロトコル スフェロプ ラストとグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) 明確に可視化し、急速に特徴付けるプロトプ ラストペプチド細菌の相互作用。これは膜透過ペプチドとローカライズを定義する体系的な方法を提供します。

生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

production-visualization-bacterial-spheroplasts-protoplasts-to

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K ビュー.  Wellesley College. ここで提案するグラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) を生成するプロトコル スフェロプ ラストとグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) 明確に可視化し、急速に特徴付けるプロトプ ラストペプチド細菌の相互作用。これは膜透過ペプチドとローカライズを定義する体系的な方法を提供します。

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Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

生物学

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for protein localization, but subcellular context is often absent in fluorescence images. Immuno-electron microscopy, on the other hand, can localize proteins, but the technique is limited by a lack of compatible antibodies, poor preservation of morphology and because most antigens are not exposed to the specimen surface. Correlative approaches can acquire the fluorescence image from a whole cell first, either from immuno-fluorescence or genetically tagged proteins. The sample is then fixed and embedded for electron microscopy, and the images are correlated 1-3. However, the low-resolution fluorescence image and the lack of fiducial markers preclude the precise localization of proteins. 
Alternatively, fluorescence imaging can be done after preserving the specimen in plastic. In this approach, the block is sectioned, and fluorescence images and electron micrographs of the same section are correlated 4-7. However, the diffraction limit of light in the correlated image obscures the locations of individual molecules, and the fluorescence often extends beyond the boundary of the cell. 
Nano-resolution fluorescence electron microscopy (nano-fEM) is designed to localize proteins at nano-scale by imaging the same sections using photo-activated localization microscopy (PALM) and electron microscopy. PALM overcomes the diffraction limit by imaging individual fluorescent proteins and subsequently mapping the centroid of each fluorescent spot 8-10. 
We outline the nano-fEM technique in five steps. First, the sample is fixed and embedded using conditions that preserve the fluorescence of tagged proteins. Second, the resin blocks are sectioned into ultrathin segments (70-80 nm) that are mounted on a cover glass. Third, fluorescence is imaged in these sections using the Zeiss PALM microscope. Fourth, electron dense structures are imaged in these same sections using a scanning electron microscope. Fifth, the fluorescence and electron micrographs are aligned using gold particles as fiducial markers. In summary, the subcellular localization of fluorescently tagged proteins can be determined at nanometer resolution in approximately one week.

We describe a method to localize fluorescently tagged proteins in electron micrographs. Fluorescence is first localized using photo-activated localization microscopy on ultrathin sections. These images are then aligned to electron micrographs of the same section.

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

孤立した塊茎プロトプ ラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.

簡便な分離大豆プロトプ ラストと一過的遺伝子発現解析への応用

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Assessment of Zebrafish Lens Nucleus Localization and Sutural Integrity

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for generation of transgenics for in vivo imaging. These unique capabilities make the zebrafish an ideal platform to study ocular lens development and physiology. Our recent findings that an Aquaporin-0, Aqp0a, is required for stability of the anterior lens suture, as well as for the shift of the lens nucleus to the lens center with age led us to develop tools especially suited to analyzing the properties of zebrafish lenses. Here we outline detailed methods for lens dissection that can be applied to both larval and adult lenses, to prepare them for histological analysis, immunohistochemistry and imaging. We focus on analysis of lens suture integrity and cortical cell morphology and compare data generated from dissected lenses with data obtained from in vivo imaging of lens morphology made possible by a novel transgenic zebrafish line with a genetically encoded fluorescent marker. Analysis of dissected lenses perpendicular to their optical axis allows quantification of the relative position of the lens nucleus along the anterior-posterior axis. Movement of the lens nucleus from an initial anterior position to the center is required for normal lens optics in adult zebrafish. Thus, a quantitative measure of lens nuclear position directly correlates with its optical properties.

These protocols were developed to analyze cortical lens morphology, structural integrity of the zebrafish lens sutures in fixed and live lenses and to measure the position of the zebrafish lens nucleus along the anterior-posterior axis.

ゼブラフィッシュレンズ核局在化と Sutural 整合性の評価

The zebrafish is uniquely suited to genetic manipulation and in vivo imaging, making it an increasingly popular model for reverse genetic studies and for ...

生産と細菌のスフェロプラストとプロトプラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

要約

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この動画の章

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

孤立した塊茎プロトプラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

簡便な分離大豆プロトプラストと一過的遺伝子発現解析への応用

ゼブラフィッシュレンズ核局在化と Sutural 整合性の評価

生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

要約

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植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

孤立した塊茎プロトプ ラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

簡便な分離大豆プロトプ ラストと一過的遺伝子発現解析への応用

ゼブラフィッシュレンズ核局在化と Sutural 整合性の評価

生産と細菌のスフェロプラストとプロトプラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

孤立した塊茎プロトプラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

簡便な分離大豆プロトプラストと一過的遺伝子発現解析への応用