Name: production and visualization of bacterial spheroplasts and protoplasts to characterize antimicrobial peptide localization
Uploaded: 2018-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
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研究は、国立研究所のアレルギーと感染症 (NIH NIAID) 賞 R15AI079685 によって支えられました。

1. ソリューションの準備
注:エシェリヒア属大腸菌のスフェロプ ラストとB. メガテリウムプロトプ ラストをそれぞれ生産するために手順 1.1-1.9 1.8-1.11 で説明するソリューションを準備します。
<ol><li>準備 1 M トリス-Cl、10.34 g トリス塩酸と dH2O 125 mL フラスコ 50 mL にトリスああ 4.17 g を溶解して pH 7.8。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>0.10 g MgCl2 (95.2 g/mol) と 25 mL dH2125 mL フラスコ内 O 11.98 g ショ糖 (342.3 g/mol) を溶解することによりソリューション (20 mM MgCl2、0.7 M ショ糖、10 mM トリス-塩素、pH 7.8) を準備します。500 μ L を追加 1 M トリス Cl (pH 7.8) し、50 mL にボリュームを調整します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>ソリューション B (10 mM MgCl2、0.8 M ショ糖、10 mM トリス-塩素、pH 7.8) を準備するには、0.05 g MgCl2 (95.2 g/mol) と 13.69 g ショ糖 (342.3 g/mol) 25 mL dH2125 mL のフラスコで O に溶解します。500 μ L を追加 1 M トリス Cl (pH 7.8) し、50 mL にボリュームを調整します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>50 mL dH2O は、125 mL のフラスコで 13.69 g ショ糖 (342.3 g/mol) を溶解することにより 0.8 M ショ糖を準備します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>5 mg/mL デオキシリボヌクレアーゼの準備私 (DNase 私) 0.015 g DNase 溶解 dH250 mL フラスコ O の 3 mL で。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌しなさい。Microfuge の管、-20 ° C でストアに割り切れるソリューション</li>
	<li>0.125 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の準備、0.698 g EDTA 二ナトリウムを溶解して pH 8.0 15 mL dH2O 125 mL のフラスコの中に (372.2 g/mol) を脱水します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>600 μ g/mL セファレキシンを準備するには、50 ml の dH2O 125 mL のフラスコの中のセファレキシン水和物 (365.404 g/mol) の 0.03 g を溶解します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌しなさい、4 ° C での円錐管に格納</li>
	<li>DH250 mL フラスコ O の 3 mL で 0.015 g リゾチームを溶解して 5 mg/mL リゾチームを準備します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌しなさい。Microfuge の管、-20 ° C でストアに割り切れるソリューション</li>
	<li>1 l の dH2O 2 L フラスコで TSB の 30 g を溶解することにより、3 w/v トリプチ醤油スープ (TSB) を準備します。因数にフラスコ 25 mL または 100 mL それぞれ大腸菌スフェロプ ラストまたはB. メガテリウムプロトプ ラスト,の準備で使用される TSB を含むソリューション。液体培地を滅菌するオートクレーブ フラスコ。滅菌 TSB は室温または 4 ° C で保存できます。</li>
	<li>34.23 g ショ糖 (342.3 g/mol)、0.46 g マレイン酸 (116.07 g/mol) と 0.38 g MgCl2 (95.21 g/mol) dH2O 250 mL フラスコ 100 mL に溶解して溶液 (1 の M ショ糖、0.04 M マレイン酸、0.04 M MgCl2、pH 6.5) を準備します。6.5 に pH を調整します。0.2 μ m の膜を持つ 25 mm シリンジ フィルターをフィルタ リングによって殺菌し、常温の円錐管に格納します。</li>
	<li>100 mL 3 w/v TSB と 100 mL の溶液 C 1 L のガラス瓶を混合することによってプロトプ ラスト中の 200 mL を準備します。オートクレーブ ソリューションを殺菌し、常温で保存します。</li>
</ol>2. 一晩かけて培養の準備
注: セクション 2-4 適切な無菌技術を使用してを実行します。必要な場合、細菌は潜在的な汚染を減らすために抗生物質耐性のプラスミドを含めることができます。抗生物質耐性の菌株を使用している場合は、手順 2.1、3.1-3.2 と、図 4.1-4.4 で必要な抗生物質を追加します。
<ol><li>滅菌ピペット チップを使用して、それを 3 %w/v TSB の 2-3 mL を含む 14 mL 培養管細菌の単一コロニーをピックアップして一晩かけて培養を準備します。37 ° C で 16-21 h に振りながらインキュベートします。</li>
</ol>3 グラム陰性大腸菌スフェロプ ラストの作成
<ol><li>250 mL フラスコ 25 mL 量 3 %w/v TSB で一晩文化 1: 100 を希釈し、37 ° C で細菌のソリューションをソリューションは 600 0.5-0.8 の光学濃度に達するまでに約 2.5 時間振りながらインキュベート nm。分光光度計を使用して光の密度を測定します。</li>
	<li>250 mL フラスコにこの文化 1:10 3 %w/v TSB の 30 ml を希釈し、インキュベート 37 ° C についての 1 つのセルのフィラメントを生成する 60 μ G/ml セファレキシン (347.4 g/mol) の存在下で 2.5 h に振りながら長さ 50-150 μ m、光学顕微鏡 (図 1 b) 1,000 倍の倍率で観察可能であります。</li>
	<li>1,500 × g、4 ° C で 4 分間デカントで細菌のソリューションを遠心分離によってフィラメントを収穫し、ペレットを予約、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>優しく 0.8 M ショ糖、ペレットを邪魔しないように注意されているの 1 つの mL を追加することでフィラメントを洗います。1 分間インキュベートし、ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。</li>
	<li>1 の 150 μ L を追加 5 mg/mL リゾチームの 120 μ L、5 Mg/ml の DNase の 30 μ M トリス Cl (pH 7.8)、私は、120 μ L、それぞれ 0.125 M EDTA のペレットに注文し、10 分間室温でソリューションを孵化させなさい。</li>
	<li>溶液の 1 mL 徐々 に 1 分以上ソリューションに追加、ソリューションを手でゆっくり旋回しながら、マイクロ ピペットを使用して 3.5 の準備します。室温で 4 分のためのソリューションを孵化させなさい。</li>
	<li>4 ° C の溶液 B の 7 mL を 2 つの 15 mL の円錐管に入れます。これらの 2 つの管のそれぞれに 3.6 で、溶液の同量を追加します。1,500 × g、4 分の 4 ° C で溶液を遠心します。</li>
	<li>ペレットを乱すことがなく 1-2 mL の培養上清を除くすべて削除血清ピペットを使用して、慎重に。P1000 マイクロ ピペットを使用して上下に軽くピペッティングでペレットを再懸濁します。光学顕微鏡 (図 1) を使用して 1,000 倍の倍率でサンプルを観察することによってスフェロプ ラスト形成を視覚的に確認します。</li>
	<li>-20 ° C で 1 週までまたは彼らは 3 凍結融解サイクルを経てまでスフェロプ ラストを格納します。</li>
</ol>4. グラム陽性B. メガテリウムプロトプ ラストの調製
<ol><li>250 mL のフラスコで 3 %w/v TSB の 100 mL で一晩文化縮尺を希釈し、37 ° C で細菌のソリューションをソリューションが 0.9-の光学密度に達するまで、約 4.5 時間のため震えながらインキュベート 600 1.0 nm。分光光度計を使用して光の密度を測定します。</li>
	<li>液体培養を注ぎ、2 つの 50 mL の円錐管、2,000 × g、10 分の 4 ° C で遠心します。</li>
	<li>血清ピペットを使用して、両方の円錐管から上澄みを廃棄します。2.5 mL プロトプ ラスト中でペレットを再懸濁します再懸濁のソリューションを単一の円錐管に結合しています。125 mL のフラスコで結合された再懸濁ソリューションをピペットします。</li>
	<li>5 mg/mL リゾチームの 1 mL を追加し、震えながら 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>プロトプ ラスト 1,000 x 倍率球 (図 2) ではなく腫れ棒として表示される細菌などの任意の不正を指摘し、光学顕微鏡下での成長を監視します。血清ピペットを使用して、ソリューションを 15 mL の円錐管と 2,000 × g、10 分の 4 ° C で遠心分離機に転送します。</li>
	<li>上清をデカントし、再 5 mL プロトプ ラスト メディアでペレットを中断します。-20 ° C で 1 週までまたは彼らは 3 凍結融解サイクルを経てまでプロトプ ラストを格納します。</li>
</ol>5. ペプチド溶液および膜色素イメージングのための準備
<ol><li>
ペプチド ソリューション
	<ol>
<li>アルミ箔に包まれておよび microfuge の管で FITC 800 μ L dH2O を使用して蛋白質の濃度測定を実施するために、少なくとも 1 つのトリプトファン残基を含むペプチドで BF2 P11A をラベル付けの 2 mg を溶解します。</li>
		<li>オンカラム、280 でペプチド溶液の吸光度を測定 3 通 nm。トリプトファン (5,700/Mcm) における分子吸光係数を用いたペプチド濃度を計算します。</li>
		<li>光から保護するためにアルミ箔に包まれて2O-20 ° c および microfuge の管で 100-200 μ m ストアの最終濃度に dH でペプチド濃度を希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
膜色素
	<ol>
<li>および microfuge の管でのディ-8-ANEPPS DMSO の 843.3 μ L で 5 mg を溶解してディ-8-ANEPPS (592.9 g/mol) の 10 の mM の在庫を準備します。光から保護するためにアルミ箔に包まれた 4 ° C で保存します。</li>
		<li>および microfuge の管で 997 μ L DMSO に 3 μ L の 10 mM ディ-8-ANEPPS を追加して 0.03 mM ディ-8-ANEPPS の 1 mL を準備します。光から保護するためにアルミ箔に包まれた 4 ° c および microfuge の管に格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6.大腸菌スフェロプ ラストと共焦点顕微鏡を用いたB. メガテリウムプロトプ ラストの可視化
<ol><li>スフェロプ ラストまたはポリ L リジン コーティング ガラス スライド上にプロトプ ラストの 5 μ L をピペットします。アンプ (100-200 μ M) をスライドにラベルが付いた FITC の 2 μ L を追加し、光から保護 3 分間インキュベートします。</li>
	<li>スライドに、膜色素・ ディ ・-8-ANEPPS (0.03 mM) の 1 μ L を追加し、光から保護 3 分間インキュベートします。ガラス基板カバーし、マニキュアで封印します。</li>
	<li>共焦点顕微鏡とアルゴン レーザーをオンにします。アルゴン レーザーで出力電力 20% と 20% の伝送を調整します。</li>
	<li>499-532 nm と FITC 標識ペプチド放出チャネルとディ 8 ANEPPS 標識膜色素放出チャネルの 670-745 nm の発光波長範囲をそれぞれ設定します。</li>
	<li>プロトプ ラスト イメージまたは 63 X 目的としたスフェロプ ラスト (図 1および図 2)。8 ビットを取得するイメージング ソフトウェアを使用して、画像を 512 x 512 複合 z スタックから成るスフェロプ ラストやプロトプ ラストの全体の 0.5 μ m のスライス。 注: は、イメージングのスフェロプ ラストとプロトプ ラスト中の裁ち落としを通じて排出量を減らすための配慮を取る。詳細についてを参照してください。</li>
</ol>7 アンプの局在化の特性
<ol><li>イメージング ソフトウェアで複合 z スタックのイメージを開きます。スフェロプ ラストやプロトプ ラストの中央のスライスを見つけて 1 つ循環地域の利益率 (ROI) を配置 (直径 0.3 μ m)、スフェロプ ラストのプロトプ ラスト (ROI 2) センターで、スフェロプ ラストまたは測定するプロトプ ラストからの膜 (投資収益率 1)背景の蛍光性 (投資収益率 3) (図 5)。飽和ピクセルを含めることを避けてください。各 ROI の蛍光強度は、画像処理ソフトで計算できます。 注: インスタンス ペプチドは、細胞膜の完全ローカライズされていない、描画 ROI 1 ペプチドはローカライズされた膜の領域に。</li>
	<li>細胞内ペプチド蛍光強度膜ペプチドの蛍光強度の比を決定する次の式を使用します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg"> 注: 投資収益率 3 の蛍光強度は蛍光バック グラウンドを考慮するために 2 の投資収益率と投資収益率 1 で蛍光強度から差し引かれます。</li>
</ol>

<ol>
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C., Matsuzaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+the+Novel+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2+with+Lipid+Bilayers:+Proline+as+a+Translocation+Promoting+Factor.">Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor.</a> Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).</li><li>Decad, G. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Gram-Negative+Bacteria+XII.+Molecular-Sieving+Function+of+Cell+Wall.">Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall.</a> J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+Escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).</li><li>Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melittin-Induced+Permeabilization,+Re-sealing,+and+Re-permeabilization+of+E.+coli+Membranes.">Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes.</a> Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).</li><li>Ruthe, H. J., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+bacterial+spheroplasts+by+electric+fields.">Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields.</a> Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

ここに示すプロトコルより急速に拡大、球形の細菌がはるかに簡単検索、向き、およびイメージのため細菌画像のより大きなサンプル サイズを取得する研究者を実現可能にします。データを収集するためにこの拡張機能は、いくつかの点で重要です。まず、ペプチドの局在パターンのより体系的な定量分析を有効化します。高画質画像のセットでのみ大きなサンプルを明らかに局在する細胞...

抗菌ペプチド (アンペア) は、従来の抗生物質1,2,3,4、5の代わりに、彼らの潜在的な使用のため注目を集めています。アンプによって細胞膜透過や核酸など、細胞内構成要素との相互作用構造のセル内容6漏洩を引き起こす膜で細菌を殺します。、抗生物質として利用に加えてアンプを透過が適応する薬物送達アプリケーションの無停止不浸透性の細胞膜7、8を越えることができるので。我々 は、したがって、創での使用のための基盤を築くためのアクションの基本的なアンプのメカニズムを理解しようとします。
共焦点顕微鏡アクション9,10、11,12,のメカニズムに洞察力を提供する細菌細胞の蛍光に分類されたアンプの局在パターンを評価する方法を提供しています。13,14. 細菌の膜の分類、によって 1 つは蛍光に分類されたペプチドが膜または細菌の細胞の細胞内領域に局在するかどうかを決定できます。ただし、この手法は、従来の光顕微鏡の解像度の限界と可変方向スライド15上の細菌のために挑戦をイメージングすることができます細菌の小さなサイズとロッドの形状によって制限されます。
提案手法の目的は、共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識ペプチドの局在パターンの強化された可視化を有効にすることです。小型、薄型、桿菌グラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) とグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) を回すことによって可視化を強化拡大、球状形態に細菌と呼ばれる(グラム陰性菌) のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト (グラム陽性菌) の16,17,18,19,20,21。スフェロプ ラストとプロトプ ラストは、そのサイズの増加とそのイメージングの無関係なスライドの細菌の向きは、その左右対称の形状のためイメージしやすく。また、ローカライズや透過のいずれかの膜としてアンプを特徴付けるために共焦点顕微鏡データを定量的に解析する体系的なアプローチを提案する.これらの方法を適用しやすく区別蛍光ペプチドの局在パターンに分類します。ここに示すプロトコルは、各種アンプ、セル透過ペプチドを含む以外膜活性剤のローカリゼーションを評価するために使用できます。
この手法の利点は、細胞間の異質性15、一般的に識別するために使用される他の蛍光アッセイではなく明らかにするかもしれない単一セルのレベルのアンプの作用のメカニズムに洞察力を提供することの 1 つ、アンプは、一括見積もり9,22,23,24,25を提供するだけの行為のメカニズム。スフェロプ ラストとアンプ セルへの入力を評価するためにプロトプ ラストの使用特定の有用な26彼らこそ脂質小胞24など、セルへの入力を評価するために使用されるその他のモデルよりももっと生理学的に関連する15 。

<table><tbody><tr><td>Trizma hydrocloride (Tris HCl)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base (Tris OH)</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>106361</td><td>Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement</td></tr><tr><td>Cephalexin hydrate</td><td>Sigma</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>BBL Trypticase soy broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11768</td><td></td></tr><tr><td>BF2 P11A FITC</td><td>NeoScientific</td><td>Custom ordered</td><td></td></tr><tr><td>di-8-ANEPPS</td><td>Biotium</td><td>61012</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869</td><td>Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement</td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 &amp;mu;m HT Tuffryn Membrane</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5 II</td><td>For image acquisition</td></tr><tr><td>Leica Application Suite, Advanced Fluorescence</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>For image processing</td></tr></tbody></table>

production and visualization of bacterial spheroplasts and protoplasts to characterize antimicrobial peptide localization

細菌内でペプチドの局在パターンを評価する方法としての共焦点顕微鏡の使用は、従来の光顕微鏡の解像度の限界によって阻害される一般的。小さな棒状グラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) とグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) を変換するプロトコルを提案する特定の顕微鏡の解像度は簡単に強化できない、大きく、簡単にイメージ化された球状形態にスフェロプ ラストやプロトプ ラストと呼ばれます。この変換では、迅速かつ明確にペプチド (すなわち膜のローカライズ) 細菌の細胞膜に自分自身を申し立てるか (すなわち、透過) セルを入力する膜を通過するかどうかを決定するためのオブザーバーをことができます。このアプローチでは、ローカライズや透過膜としてペプチドを特徴付けるため体系的な方法を示します。Buforin II P11A の相互作用を観察することによりこのプロトコルの有用性を示す様々 な膜活性ペプチドや細菌の緊張のこのメソッドを使用できますが、(BF2 P11A)、エシェリヒア属大腸菌での抗菌ペプチド (AMP)スフェロプ ラストとB. メガテリウムプロトプ ラスト。

細菌を拡大して、球は、簡単に、ペプチドは細菌の細胞膜にローカライズや細菌の細胞膜に容易に若しかどうかを区別できます。従来の光顕微鏡の解像度限界は膜にローカライズされた信号と重複するように見えるために、膜または通常の細菌の細胞内スペースからペプチド信号が発生するかどうかを区別するために挑戦的な、細胞内領域 (図 3 a</stron...

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Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

ここで提案するグラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) を生成するプロトコル スフェロプ ラストとグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) 明確に可視化し、急速に特徴付けるプロトプ ラストペプチド細菌の相互作用。これは膜透過ペプチドとローカライズを定義する体系的な方法を提供します。

生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

production-visualization-bacterial-spheroplasts-protoplasts-to

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K ビュー.  Wellesley College. ここで提案するグラム陰性大腸菌(E. 大腸菌) を生成するプロトコル スフェロプ ラストとグラム陽性バキルス メガテリウム(B. メガテリウム) 明確に可視化し、急速に特徴付けるプロトプ ラストペプチド細菌の相互作用。これは膜透過ペプチドとローカライズを定義する体系的な方法を提供します。

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Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

生化学

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

免疫・感染学

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

非正規のアミノ酸類の選択的な圧力の取り込みによって生成される抗菌ペプチド

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

生物工学

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Fluorescent Reporter 定量による全臓器病原体追跡(英語)

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

著者スポットライト:組織における抗生物質と免疫系に対する細菌の応答を解明する

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

生産と細菌のスフェロプラストとプロトプラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

要約

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抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示

ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

非正規のアミノ酸類の選択的な圧力の取り込みによって生成される抗菌ペプチド

Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化

正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

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生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

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非正規のアミノ酸類の選択的な圧力の取り込みによって生成される抗菌ペプチド

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正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

生産と細菌のスフェロプラストとプロトプラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化