細菌は非常に小さいので、人々はしばしば彼らが3次元の物体であることを忘れます。当社のプロトコルは、平らな細胞と湾曲した細胞の両方の形状の正確な再構築を可能にします。このプロトコルは、標準的な顕微鏡にわずかな変更を必要とし、MATLABスクリプトですぐに利用できます。
実験を開始する前に、単一のガラス顕微鏡スライドの反対側の端に3つの20 x 20ミリメートルのカバースリップのそれぞれに2つのスタックを配置します。ピペット200マイクロリットルのアガロースパッド溶液をスライドに、即座にしっかりとカバースリップのスタックに2番目のスライドを置き、アガロースを平らにします。アガロースが室温で約1分間固化させた後、上のスライドから慎重にスライドし、200マイクロリットルピペットチップの大きな端を使用して、ゲルから直径5ミリメートルのパッドを切り取ります。
すべてのパッドがピペットを得られた場合、大腸菌細胞培養は、細胞塊を破壊し、各パッドに1マイクロリットルのサブ培養を加える前に細胞が均質に分布していることを確認するために複数回培養した。サンプルを5〜10分間空気乾燥させた後、パッドにカバースリップを置く前に、液滴がパッドに完全に吸収されたことを確認します。次に、綿棒を使用してカバースリップの端の周りに適切なシーラントを優しく磨き、シーラントをカバースリップの上部から遠ざけるように注意してください。
カバースリップを密封した直後にスライドを顕微鏡のステージに置き、5分間の熱平衡の後、顕微鏡のフォーカスホイールを使用して細胞の中央に焦点を合わせます。ND取得の下の関連する顕微鏡ソフトウェアで、Zスタックを取得するためにZボックスをチェックし、ホームボタンをクリックしてセルの中央を開始点として設定します。ステップサイズを0.1マイクロメートル、レンジを4マイクロメートルに設定し、ZデバイスがPiezoステージに設定されていることを確認します。
セルの上下に十分なぼかしが存在し、セルが背景とほとんど区別できないようにすることが重要です。ラムダウィンドウの下の蛍光チャネルを、画像化される蛍光分子の設定に設定し、実験の順序がλに設定されていることを確認して、各カラーチャンネルで完全なZスタックを取得してから切り替えます。次に、[今すぐ実行] をクリックして、画像の取得を開始します。
すべての画像が取得されると、適切な画像解析ソフトウェアプログラムでファイルを開きます。個々のセルの周囲にボックスを描画し、そのセルをチャネルごとに 1 回 2 回複製し、[ハイパースタックを複製] チェックボックスがオンになっていることを確認し、チャネルを 1 つまたは 2 つに変更します。両方のスタックが使用可能になったら、[イメージ]、[スタック]、[ツール]、および [連結] を選択して、イメージを結合します。
タンパク質チャネルを最初に、形状チャネルを2番目に使用します。新しいイメージを TIFF ファイルとして保存した後、トリミングされたイメージとcell_shape_settings_triを含むデスクトップ上のフォルダ内にフォルダを作成します。shae-cellshape-public exampleData_triからの txt ファイル。
cell_shape_settings_triを編集します。txt ファイルを使用して、目的の実験に適した設定を設定します。Cell_shape_detector3dConvTriFolder関数を実行し、フォルダーの場所に文字列を指定し、その後に開始するセルの数と実行するセルの数を指定します。
セルが正しく再構築されたことを確認するには、ScreenFits を実行します。グラフィカル ユーザー インターフェイスが開いたら、フォルダーの選択 ボタンをクリックし、個々 のセルの再構成を視覚的にスクリーニングする再構築データ ファイルを含むフォルダーを選択します。不整形に見えるセル、または完全なカバレッジが不足しているセルの場合は、名前にフラグを付ける再構築の横にあるボックスを選択し、下流の分析から除外できるようにします。
富化スモーシングスプラインを実行して、表面におけるガウス曲率の関数として目的のタンパク質の相対的な濃度の濃縮プロファイルを作成します。次に、作成した TRI を使用して各フォルダを選択します。をクリックし、新しく作成したカーブ マット ファイルを選択します。
この方法は、2D表現として曲線または異常な形状の細胞を扱う場合に特に有用であり、細胞の曲率を正確に反映することができない。本実験では、細菌性アクチンタンパク質MreBに対する緑色蛍光融合タンパク質を生成し、野生型および変異型の両方の大腸菌細胞におけるアクチンタンパク質の正確な局在化を研究した。これらの測定を3Dキャプチャ画像で行うことで、野生型とrodZ変異型細胞の両方の形状を再構築することができました。
MreBの局在化は、rodZに依存する方法で3Dでしか測定できない幾何学的特徴である小さなガウス曲率で濃縮されると判断された。Z スタックの大きさが十分に大きいため、セルが上下にぼやけていて、セルが互いに十分に間隔を置くようにしてください。3Dでタンパク質の幾何学的局在を測定する方法を示していますが、タグタンパク質アセンブリのサイズなど、このデータから他の情報を計算することができます。
