現在では、質量分析は構造生物学において重要な役割を果たしています。この方法は、ネイティブ状態の重要な生体高分子、特にタンパク質およびタンパク質複合体に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。天然型の質量分析は、マルチプロテインおよび核酸系を含む様々な生体分子集合体に広く適用可能です。
この手法の主な利点は、迅速で高感度です。異種タンパク質サンプルを問い合わせ、オリゴマー状態の複数のタンパク質を同時に分析することを可能にする。この手順をデモンストレーションすることは、私のグループの博士課程の学生であるアンディ・ラウです。
この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、ナノエレクトロスプレー用の社内毛細血管を準備します。各ランの制御としてリガンドフリーサンプルを調製し、それぞれ酢酸アンモニウムにバッファー交換を行います。次に、感度、正イオン集録、および移動性 TOF モードを選択します。
次に、トラップ、API、および IMS の各ガスをオンにします。IM分離のためにここに示されている窒素とアルゴンの出発点を使用し、必要に応じて調整します。適切な m/z 取得範囲を設定します。
未知のタンパク質の場合、初期最適化ステップは広い範囲を使用する必要があります。金でコーティングされたキャピラリーをキャピラリーホルダーに挿入します。その後、目的のタンパク質複合体溶液の2〜3マイクロリットルの間に毛細血管に負荷を入れておく。
毛細管を軽く締め、エレクトロスプレーソースステージに置きます。ステージをスライドさせて、データの取得を開始します。毛細血管の先端に落下が形成されるまで、低ナノフローガス圧力を適用します。
コーンに対してキャピラリーを動かし、イオン電流を監視して安定したイオン電流を実現します。0.9~1.6キロボルトの範囲でキャピラリー電圧を印加します。次に、テキスト プロトコルで説明されているように、サンプリング コーン、ソース オフセット、ソース温度、およびコーン ガス フローを設定します。
十分に解決された質量スペクトルと最大イオン伝送を取得するには、MSパラメータを調整し、スペクトルの結果の変化を監視します。トラップ衝突エネルギーを 10 ~ 50 ボルトの初期開始点に設定します。電圧オフセットが不十分な場合は、トラップの衝突エネルギーを調整します。
トラップを電圧で20~45ボルトの初期開始点に設定します。この電圧を最適化することで、脱解を改善します。その後、テキストで説明されているように波速と波の高さを最適化して、最適な移動性の分離を実現します。
HerAとNurAを含む研究では、毎秒40メートルの波速度と550〜650ボルトの間の波の高さを使用しています。DNA結合解析では、タンパク質とDNAを大臼歯比で混合し、タンパク質DNA複合体の形成を可能にします。以下のいずれか、5'O-3-チオ-三リン酸、四リチウム塩、またはADPのいずれかの増加量を追加します。
適切なソフトウェアを使用して、生成された種の質量を測定し、ATPおよびADP結合およびオリゴマー状態などのリガンド結合を同定する。次に、生のESI MSスペクトルで観察されたイオン強度を使用して、対応する種の相対的な存在量を定量化します。安定した伝送のために機器条件を最適化した後、良好なスペクトル品質を維持しながら、衝突エネルギーとサンプリングコーンを可能な限り低く減らします。
IM MS を取得するには、以前に決定した最適化された波速と波の高さを使用します。同じ波の高さを維持しながら、3つの異なる波速でイオンドリフト時間を測定します。タンパク質イオンCCSを決定するために、4つのタンパク質較正剤を測定し、2つは調査中のタンパク質の上の質量を有し、2つは以下の質量を有し、同じ計装条件を使用する。まず、タンパク質サンプルを調製し、テキストプロトコルで概説されているように、それらを酢酸アンモニウムに交換します。
所望の量に達するまで10%ずつずつ溶媒を加えます。氷の上で1時間インキュベートします。この後、各サンプルの IM-MS スペクトルを取得します。
SUMMITソフトウェアを使用して、タンパク質サブ複合体を割り当て、タンパク質相互作用ネットワークを生成します。または、期待される種の理論質量のリストを手動で生成します。タンパク質の複雑な安定性の調査を開始するには、トラップ加速電圧を10ボルトから200ボルトに引き上げながらIM-MSデータを記録し、タンパク質と気相に徐々に展開します。
適切なソフトウェアを使用してデータを分析し、各電荷状態の各加速電圧で強度正規化されたCCS分布を積み重ねて2次元展開プロットを生成します。ネイティブMSの結果は、HerAとNurA複合体のオリゴマー状態、組成、およびトポロジーを明らかにします。非共有結合相互作用が気相に保存されるので、ATP γ SおよびADP滴定実験のネイティブMSは、HerAおよびNurAにおける対ワイズヌクレオチド結合を決定するために使用される。
HerAオリゴマー状態の質量スペクトルは、ATP γ S濃度を増加させることで六角ヘラの相対的強度が増加することを明らかにした。タンパク質およびその複合体の実験的CCS値は、次いでIM-MS実験から導出される。これらの値は、タンパク質アセンブリの低分解能モデルを構築するためのCCS値を使用して検証するX線結晶学からの理論的測定と良好な一致を有すると見られる。
CIUとKEcomの分析は、DNA結合HerA-NurAがDNAフリー複合体よりも安定していることを明らかにします。CIU MS分析およびそれぞれのATP結合状態は、4つのATPガンマS結合状態がガス相における複雑な安定性を低下させることを示している。しかし、全ての部位が占める6つのATPガンマS結合状態は、最も安定しているとみられる。
インタクトな複合体の分子質量を正確に測定することで、生体分子特性評価に関する貴重な洞察を得られます。複雑な組み立て経路、タンパク質オリゴマー化、リガンド結合に関する情報を得ることができます。この情報をすべて組み合わせることで、機能的な生物学的アセンブリの詳細なモデルを生成することができます。
