요즘 질량 분석은 구조 생물학에서 중요한 역할을합니다. 이 방법은 그들의 모국상태에서 중요한 생물학 거대 분자, 특히 단백질 및 단백질 복합체에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 네이티브 질량 분광법은 다단백 및 핵산 시스템을 포함한 다양한 생체 분자 어셈블리에 널리 적용됩니다.
이 기술의 주요 장점은 빠르고 매우 민감하다는 것입니다. 이질적인 단백질 샘플을 심문하는 데 사용할 수 있으며, 올리고머 상태에서 여러 단백질을 동시에 분석할 수 있게 한다. 절차를 시연하는 것은 내 그룹의 박사 과정 학생 인 앤디 라우 (Andy Lau)가 될 것입니다.
이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 나노 전기 스프레이에 대한 사내 모세혈관을 준비합니다. 버퍼가 각각 암모늄 아세테이트로 교환될 때 각 실행에 대한 제어로 리간드 프리 샘플을 준비합니다. 다음으로 감도, 양수 이온 획득 및 이동성 TOF 모드를 선택합니다.
트랩, API 및 IMS 가스를 켭니다. IM 분리의 경우 여기에 표시된 질소 및 아르곤 시작 점을 사용하고 필요에 따라 조정합니다. 적절한 m/z 획득 범위를 설정합니다.
알 수 없는 단백질의 경우 초기 최적화 단계는 넓은 범위를 사용해야 합니다. 금코팅 모세관을 모세관 홀더에 삽입합니다. 그런 다음 모세관에 관심있는 단백질 복합 용액의 2 ~3 마이크로 리터 사이에 적재합니다.
모세관을 부드럽게 조이고 전기 스프레이 소스 스테이지에 놓습니다. 스테이지를 위치로 밀어 데이터 수집을 시작합니다. 모세관 끝에 낙하가 형성될 때까지 낮은 나노 유량 가스 압력을 적용합니다.
원뿔에 대하여 모세관을 이동하고 이온 전류를 모니터링하여 안정적인 이온 전류를 달성한다. 0.9~1.6킬로볼트 범위의 모세관 전압을 적용합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플링 콘, 소스 오프셋, 소스 온도 및 원뿔 가스 흐름을 설정합니다.
잘 해결된 질량 스펙트럼을 획득하고 이온 전송을 최대화하려면 MS 매개 변수를 조정하고 스펙트럼의 결과로 발생하는 변화를 모니터링합니다. 트랩 충돌 에너지를 10~50볼트 사이의 초기 시작점으로 설정합니다. 전압 오프셋이 충분하지 않은 경우 트랩 충돌 에너지를 조정합니다.
전압을 통해 트랩을 20~45볼트 사이의 초기 시작점으로 설정합니다. 이 전압을 최적화하여 해독을 개선합니다. 그 후 텍스트에 설명된 대로 웨이브 속도와 웨이브 높이를 최적화하여 최상의 이동성 분리를 달성합니다.
HerA와 NurA와 관련된 연구에는 초당 40미터의 파도 속도와 550~650볼트 사이의 파도 높이를 사용합니다. DNA 결합 분석을 위해 단백질과 DNA를 단백질 DNA 복합 체형 형성을 허용하는 어금니 비율로 혼합합니다. 다음 중 5'O-3-티오 트리호스페이트, 테트라리튬 소금 또는 ADP의 양을 증가시추가합니다.
적절한 소프트웨어를 사용하여 생성된 종의 질량을 측정하고 ATP 및 ADP 결합 및 올리고메릭 상태와 같은 리간 드바인딩을 식별합니다. 그런 다음 원시 ESI MS 스펙트럼에서 관찰된 이온 강도를 사용하여 해당 상대적인 종의 풍부를 정량화한다. 안정적인 변속기를 위해 계측기 조건을 최적화한 후, 충돌 에너지를 줄이고 원뿔을 가능한 한 낮게 샘플링하면서도 양호한 스펙트럼 품질을 유지합니다.
이전에 결정된 최적화된 웨이브 속도와 웨이브 높이를 사용하여 IM MS를 획득합니다. 동일한 파도 높이를 유지하면서 세 가지 다른 파도 속도로 이온 드리프트 시간을 측정합니다. 단백질 이온 CCS를 결정하기 위하여 는 4개의 단백질 교정을 측정하기 위하여, 2개는 조사 중인 단백질 위에 질량을, 및 2개의 아래 질량을, 동일 계측 조건을 사용하여 측정합니다. 먼저, 단백질 샘플을 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 암모늄 아세테이트로 교환하는 버퍼를 준비한다.
원하는 양에 도달할 때까지 용매를 10% 증분에 추가합니다. 1 시간 동안 얼음에 배양. 이 후 각 샘플에 대해 IM-MS 스펙트럼을 획득합니다.
SUMMIT 소프트웨어를 사용하여 단백질 하위 복합체를 할당하고 단백질 상호 작용 네트워크를 생성합니다. 또는, 수동으로 예상 된 종에 대 한 이론질량의 목록을 생성. 단백질 복합 적 안정성을 조사하기 시작하려면 IM-MS 데이터를 기록하면서 트랩 가속 전압을 10 볼트에서 200 볼트로 증가시켜 단백질과 가스 상으로 점진적으로 전개됩니다.
적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 각 충전 상태에 대한 각 가속 전압에서 정규화된 CCS 분포강도를 적층하여 2차원 전개 플롯을 생성합니다. 네이티브 MS 결과는 HerA 및 NurA 복합체의 올리고메릭 상태, 조성 및 토폴로지의 상태를 나타낸다. 비동적 상호 작용이 가스 상에서 보존됨에 따라 ATP 감마 S 및 ADP 적정 실험의 기본 MS는 HerA 및 NurA에서 쌍-현명한 뉴클레오티드 결합을 결정하는 데 사용됩니다.
HerA 올리고메릭 상태의 질량 스펙트럼은 ATP 감마 S 농도를 증가시켜 hexameric HerA의 상대적 강도를 증가시킨다는 것을 밝힙습니다. 단백질과 그 복합체에 대한 실험적인 CCS 값은 IM-MS 실험에서 유래됩니다. 이러한 값은 단백질 어셈블리의 저해상도 모델을 구축하기 위해 CCS 값을 사용하여 유효성을 검사하는 x 선 결정학의 이론적 측정과 좋은 관련이 있는 것으로 보입니다.
CIU와 KEcom 분석에 따르면 HERA-NurA에 묶인 DNA는 DNA가 없는 복합체보다 더 안정적이라는 것을 알 수 있습니다. CIU MS 분석 및 각각ATP 결합 상태는 4개의 ATP 감마 S 바운드 상태가 가스 상에서 복잡한 안정성을 감소시킨다는 것을 보여줍니다. 그러나 모든 사이트가 점유되는 ATP 감마 S 바운드 상태 6개는 가장 안정적인 것으로 보입니다.
그대로 복합체의 분자 질량을 정확하게 측정하면 생체 분자 특성화에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 우리는 복잡한 조립 경로, 단백질 올리고머화 및 리간드 결합에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 이 모든 정보를 결합하면 기능성 생물학적 어셈블리의 상세한 모델을 생성할 수 있습니다.
