Al giorno d'oggi la spettrometria di massa gioca un ruolo importante nella biologia strutturale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su importanti macromolecole biologiche nel loro stato nativo, in particolare proteine e complessi proteici. La spettrometria di massa nativa è ampiamente applicabile a una varietà di gruppi biomolecolari tra cui sistemi multiproteina e acido nucleico.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che è rapida e altamente sensibile. Può essere utilizzato per interrogare campioni di proteine eterogenee, rendere possibile l'analisi simultanea di più proteine allo stato oligomerico. A dimostrare la procedura sarà Andy Lau, dottorando del mio gruppo.
Per iniziare questa procedura, preparare i capillari internamente per la nanoelettrospray come delineato nel protocollo di testo. Preparare un campione privo di ligandi come controllo per ogni corsa come scambio di buffer in acetato di ammonio. Selezionare quindi la sensibilità, l'acquisizione di ioni positivi e le modalità TOF di mobilità.
Attivare quindi i gas trap, API e IMS. Per la separazione istantanea utilizzare i punti di partenza dell'azoto e dell'argon mostrati qui e regolare se necessario. Impostare un intervallo di acquisizione m/z appropriato.
Per una proteina sconosciuta i passaggi di ottimizzazione iniziali dovrebbero utilizzare un'ampia gamma. Inserire il capillare rivestito in oro in un supporto capillare. Quindi caricare tra due e tre microlitri della soluzione complessa proteica di interesse nel capillare.
Stringere delicatamente il capillare e posizionarlo sullo stadio della sorgente elettrospray. Far scorrere il palco in posizione per iniziare ad acquisire dati. Applicare una bassa pressione del gas a flusso nanometrico fino a quando non si forma una goccia sulla punta del capillare.
Spostare il capillare rispetto al cono e monitorare la corrente ionia per ottenere una corrente ionia stabile. Applicare una tensione capillare nell'intervallo compreso tra 0,9 e 1,6 kilovolt. Quindi impostare il cono di campionamento, l'offset della sorgente, la temperatura della sorgente e il flusso di gas del cono come delineato nel protocollo di testo.
Per acquisire uno spettro di massa ben risolto e massimizzare la trasmissione degli ioni, regolare i parametri MS e monitorare il cambiamento risultante negli spettri. Impostare l'energia di collisione trappola su un punto iniziale di partenza compreso tra 10 e 50 volt. Se gli offset di tensione sono insufficienti, regolare le energie di collisione della trappola.
Impostare la trappola attraverso la sua tensione su un punto di partenza iniziale compreso tra 20 e 45 volt. Migliorare la desolvazione ottimizzando questa tensione. Successivamente, ottimizza la velocità d'onda e l'altezza dell'onda come delineato nel testo per ottenere la migliore separazione della mobilità.
Per gli studi che coinvolgono HerA e NurA utilizzare una velocità d'onda di 40 metri al secondo e un'altezza dell'onda compresa tra 550 e 650 volt. Per l'analisi del legame con il DNA, mescolare la proteina e il DNA con un rapporto molare che consente la formazione complessa di DNA proteico. Aggiungere quantità crescenti di uno dei seguenti, 5'O-3-tio-trifosfato, sale di tetralitio o ADP.
Utilizzando un software appropriato misurare le masse delle specie generate e identificare il legame del ligando, come il legame ATP e ADP e gli stati oligomerici. Quindi utilizzare le intensità ionici osservate negli spettri ESI MS grezzi per quantificare la corrispondente abbondanza relativa di specie. Dopo aver ottimizzato le condizioni dello strumento per una trasmissione stabile, ridurre l'energia collisionale e il cono di campionamento il più basso possibile, pur mantenendo una buona qualità degli spettri.
Utilizzare la velocità dell'onda ottimizzata e l'altezza dell'onda determinate in precedenza per acquisire la messaggistica istantanea. Misurare il tempo di deriva ionia a tre diverse velocità d'onda mantenendo la stessa altezza d'onda. Per determinare lo ione proteico CCS misurare quattro calibranti proteici, due con la massa al di sopra della proteina in esame e due con la massa sottostante, utilizzando le stesse condizioni di strumentazione. In primo luogo, preparare i campioni proteici e tampone scambiarli in acetato di ammonio come delineato nel protocollo di testo.
Aggiungere solvente con incrementi del 10% fino a raggiungere la quantità desiderata. Incubare sul ghiaccio per un'ora. Successivamente, acquisire uno spettro IM-MS per ogni campione.
Utilizzando il software SUMMIT, assegnare sottocomplessi proteici e generare reti di interazione proteica. In alternativa, generare manualmente un elenco di masse teoriche per le specie previste. Per iniziare a studiare la stabilità complessa delle proteine, registrare i dati IM-MS aumentando la tensione di accelerazione della trappola da 10 volt a 200 volt, che si svilupperà progressivamente verso la proteina e la fase gassosa.
Analizza i dati utilizzando un software appropriato e genera grafici di dispiegamento bidimensionali impilando l'intensità delle distribuzioni CCS normalizzate ad ogni tensione di accelerazione per ogni stato di carica. I risultati nativi della SM rivelano lo stato oligomerico, la composizione e la topologia del complesso HerA e NurA. Poiché le interazioni non covalenti sono conservate nella fase gassosa, gli MS nativi degli esperimenti di titolazione ATP gamma S e ADP, sono usati per determinare il legame nucleotidico a coppie nell'HerA e nel NurA.
Gli spettri di massa degli stati oligomerici di HerA rivelano che l'aumento della concentrazione di ATP gamma S aumenta l'intensità relativa dell'HerA esamerica. I valori sperimentali ccs per le proteine e i loro complessi sono quindi derivati dagli esperimenti IM-MS. Si vede che questi valori hanno un buon accordo con le misurazioni teoriche della cristallografia a raggi X, che convalida l'utilizzo di valori CCS per la costruzione di modelli a bassa risoluzione di assemblaggio proteico.
L'analisi del CIU e del KEcom rivela che l'HerA-NurA legato al DNA è più stabile del complesso privo di DNA. L'analisi CIU MS e i rispettivi stati di legame ATP mostrano che i quattro stati legati atp gamma S riducono la stabilità complessa nella fase gassosa. Tuttavia, lo stato legato a sei ATP gamma S in cui tutti i siti sono occupati, è visto come il più stabile.
Misurazioni accurate della massa molecolare di un complesso intatto forniscono preziose informazioni sulla caratterizzazione biomolecolare. Possiamo ottenere informazioni su percorsi di assemblaggio complessi, oligomerizzazione proteica e legame del ligando. La combinazione di tutte queste informazioni consente di generare modelli dettagliati di assemblaggi biologici funzionali.
