この方法は、発生学、遺伝子治療および幹細胞移植における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点は、それがマウスの胎児に異なる実験療法の効果の分析を可能にすることです.この手順を実証することは、医師ニコラス・アーンとバーバラ・クーンズ、私たちの研究室の医師と研究員になります。
処置を開始する前に、手術針の先端に5〜10マイクロリットルの無菌PBSを入れ、2〜3回滴下して、可能な破片を取り除きます。次に、適切な実験量および濃度で目的の試薬を針に充填する。マイクロインジェクタのモードボタンを3回押して、射出キャリブレーション画面に進みます。
射出時間を調整するために10または100ミリ秒の間隔を追加し、モードボタンをさらに2回押します。バランスボタンを押して、足のペダルを一度押します。その後、もう一度ペダルを押して、溶液の量が1プッシュごとに針から空にされているのかを評価します。
マイクロインジェクタが適切な実験量に較正されたら、注射のために正しいレベルに針を充填する。すべての針が洗浄されたら、妊娠した2〜6ヶ月の雌マウスのつまみつまみへの応答の欠如を確認する。腹部を剃り、乳首を傷めないように気をつけて、動物をぴりかきの位置の加熱パッドに移します。
動物の目に軟膏を塗布し、テープで加熱パッドに手足を固定します。そして、露出した皮膚を消毒する。次に、100マイクロリットルの0.25%ブピバカインなどの局所麻酔薬を皮下に注入する。
次に、下側の境界が内膜に1センチメートル以下になるように1〜2センチの皮膚切開を行い、鼻隠しの正中線を特定し、周囲の上皮を傷めないように注意する。Adson鉗子を使用して、基礎となる臓器や胎児をつかまずに筋膜をつまみ、はさみで組織を開きます。腹腔内で安全に、皮膚切開の長さに筋切開を拡張し、綿先端アプリケーターを使用して腹部の上部に腸を移動させ、グラビッド子宮を露出させる。
すべての胎児が数えられるように、右および左卵巣を慎重に識別する切開を通して子宮を抽出する。右の子宮だけが露出するように左の子宮を腹部に戻し、注射されていない胎児を暖かく保つ。そして、非支配的な手の親指と人差し指の間の最も外側の羊膜嚢を静かにつかむ。
動物の上に解剖顕微鏡を配置し、必要に応じて胎児のより良い視覚化のために焦点と照明を調整します。静脈注射のために子宮を回転させてビテリンが無駄になるように、注射することは針先に平行である。そして、子宮壁を突き刺すために5度の角度で子宮の上に針を置きます。
子宮壁と羊膜嚢の間の先端で、先端をビテリンの上に直接置き、ほぼ接線の角度で、ベベルが容器に進むまで無駄に針を滑空します。針が血管の後壁に浸透しないように角度が低いままにすることが不可欠です。針先で血液のスポットが観察されるとき、足のペダルを押して、対象物質の全容を血管に注入する。
羊水注射の場合、血管が欠けている場所が見つかるまで羊膜嚢を回転させます。針を子宮壁に垂直に向け、子宮黄身嚢を通して針を突き刺し、羊膜嚢は胎児組織に浸透しないように注意する。次に、適切な量の材料を注入します。
いずれかのタイプの注射の後、所望の容積が送達されたら注射部位から針を引き出す。そして、右の子宮角のすべての胎児が注入されるまで次の胎児に進みます。その後、右の子宮の角を腹部に戻します。
そして、腹部から左子宮の角を取り除きます。左角のすべての胎児が注入されると、子宮全体を腹部に戻し、子宮または腸のボルブルを避けるように注意する。使い捨て転送ピペットを使用して、約2ミリリットルの無菌PBSを腹部に分配し、無分別の損失を置き換えます。
そして、4-0ポリグラクチン910縫合糸を使用して、1つの連続した層で筋膜と腹部を閉じます。その後、完全な再実行まで監視とヒートランプの下できれいなケージにマウスを転送します。このトレーニング実験では、研修生による子宮内移植を受けた胎児の肝臓は、移植されたGFP細胞の生着が低いため、経験豊富なインストラクターによって注入された肝臓よりも低い蛍光レベルを注射後24時間で示した。
GFP陽性ドナー細胞のフローサイトメトリック解析も、蛍光顕微鏡下で観察された低レベルの蛍光と相関した。羊膜内経路を介して送達されるウイルスベクターの能力は、羊水と接触する細胞をトランスデュースする。妊娠12.5日目の胎児においてGFPトランスジーンを運ぶアデノウイルスの子宮内注入後48時間後の上皮細胞の導入によって例示される。
一度マスターこの技術は、妊娠マウスあたり15〜25分で完了することができます。このビデオを見た後、あなたは安全かつ効果的にマウスの胎児に異なる治療法を提供する方法をよく理解している必要があります。
